一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法
阅读说明：本技术 一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法 (Method for detecting alpha-thalassemia and beta-thalassemia point mutation ) 是由 李仁强 王方金 罗俊峰 陈云弟 于 2020-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法,属于基因检测技术领域。本发明提供由异尾双链荧光探针组成的探针对,将采用不同荧光基团标记的异尾双链荧光探针按照探针编码方式,加入到含有待检测样本的PCR反应体系中,利用不对称PCR扩增产生大量单链DNA模板,荧光链特异性结合单链DNA模板释放荧光信号,计算不同荧光通道的荧光净增量,与突变判定阈值进行比较,判定点突变类型。本发明将不对称PCR与荧光链检测结合,操作简单方便,检测时间短,兼容自动化检测流程,适合大量样本检测,尤其通过荧光编码方式用4个荧光通道检测24种地贫点突变,可提高检测通量与突变位点,节省反应试剂与样本用量。(The invention discloses a method for detecting alpha-thalassemia and beta-thalassemia point mutation, and belongs to the technical field of gene detection. The invention provides a probe pair consisting of heterotail double-chain fluorescent probes, wherein the heterotail double-chain fluorescent probes marked by different fluorescent groups are added into a PCR reaction system containing a sample to be detected according to a probe coding mode, a large number of single-chain DNA templates are generated by utilizing asymmetric PCR amplification, fluorescent chains are specifically combined with the single-chain DNA templates to release fluorescent signals, the net increment of fluorescence of different fluorescent channels is calculated, and the net increment is compared with a mutation judgment threshold value to judge the type of point mutation. The method combines asymmetric PCR with fluorescence chain detection, is simple and convenient to operate, short in detection time, compatible with an automatic detection process, suitable for detecting a large number of samples, and particularly capable of detecting 24 thalassemia point mutations by using 4 fluorescence channels in a fluorescence coding mode, improving detection flux and mutation sites, and saving the using amount of a reaction reagent and the sample.)
技术领域
本发明涉及一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
地中海贫血又称海洋性贫血，在地中海、东南亚等地区多见，是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病。由于早期报道的病例几乎都是来自于地中海地区的移民，该病遂被命名为地中海贫血，简称地贫。根据基因缺陷的分类，临床上主要分为α链珠蛋白地贫和β链珠蛋白地贫。根据基因分型，临床上分为α地贫、β地贫、γ地贫及γβ地贫等，临床上高发的主要是前两者。α静止型和标准型，以及β地贫杂合子由于无或仅有轻度贫血，一般称为α或β地贫基因携带者，出现明显贫血症状者称为地贫患者。
α链珠蛋白地贫基因位于16号染色体短臂，正常个体中α珠蛋白是由四个α珠蛋白拷贝(αα/αα)合成的。如果这些变异导致该等位基因α珠蛋白不表达，则称为α0地贫基因型；而该等位基因只损失一个α拷贝，或变异仅影响该等位基因的表达变化，则称为α+地贫基因型。α-地贫最常见的原因是从染色体中缺失一个(-α)或两个(--α)珠蛋白基因，偶尔存在基因突变(αTα或ααT)可能导致所谓的非缺失性α-地贫，中国人群中最常见的三种非缺失型α-地贫点突变为αWS,αQS,αCS。
β链珠蛋白地贫基因位于11号染色体短臂，每条染色体有一个β珠蛋白基因。β-地中海贫血是由于β珠蛋白基因异常导致β珠蛋白链合成不足或结构异常，从而引起溶血性贫血。β地贫大部分是由于β珠蛋白中的HBB基因发生突变、小的缺失或插入所致，小部分是由于基因的大片段缺失所致。中国人群常见的β地贫基因点突变为IVS-II-654(C>T),IVS-II-5(G＞C),CD71/72(+A),CD43(G>T),CD41/42(-TCTT),CD41(-C),CD37(TGG>TAG),CD31(-C),IVS-I-5(G＞C),IVS-I-1(G＞T),CD30(A＞G),CD27/28(+C),CD26(G>A),CD17(A>T),CD14/15(+G),Int(ATG＞AGG),Cap(-ACCC),nt28(A＞G),nt29(A＞G),nt30(T＞C),nt32(C＞A)等。
地中海贫血是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因遗传病，目前尚无法治愈。输血和骨髓移植可改善患者生活质量，但该方法给患病家庭带来沉重的经济负担，对患者的心理带来严重影响。地中海贫血属于常染色体隐性遗传病，如夫妻双方都为地中海贫血基因携带者，下一代有1/4的几率为地中海贫血患者。通过地中海贫血诊断避免地中海贫血患儿出生，这是目前国际上公认的首选预防措施，而基因检测是目前地中海贫血诊断的金标准。
目前常用的地贫基因检测技术包括PCR、MLPA、基因芯片以及高通量测序。基于PCR技术的裂隙聚合酶链反应(Gap-PCR)和反向斑点杂交技术(RBD)在临床实验室应用成熟，准确度高，且检测成本相对较低，故已作为主流技术得到普及，但其实验过程产生核酸染料污染，操作繁琐，自动化程度较低。MLPA是一种探针依赖扩增技术，基本原理是把目的基因复制到依赖探针上，再用一对通用引物扩增捕获的目标片段，通过对扩增产物进行毛细管电泳分析得出目的片段异常结果，主要应用于缺失型α-地贫筛查。基因芯片技术是将大量的寡核苷酸片段或DNA片段有序排列在固相载体上，待测样品DNA与芯片杂交后扫描芯片荧光强度，获得样品中基因序列和表达水平的相关信息，其标准化和自动化程度高，质控方便，但检测价格较高，数据分析处理较复杂。高通量测序技术又称为下一代测序(NGS)，可在一次实验中对目标DNA进行全面分析，包括单碱基变异、短插入缺失、拷贝数变异和结构变异，目前已在肿瘤和遗传病基因检测领域得到广泛应用，但其检测价格较高，检测流程较复杂，数据分析需要专门的人员与技术平台。综上所述，现有地贫基因检测技术尚无法满足临床诊断经济、简单、快速的要求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种经济、简单、快速、准确的不对称PCR-异尾双链荧光探针法检测地贫点突变的荧光链、引物及方法。
本发明的第一个目的是提供一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法，包括如下步骤：
将采用不同荧光基团标记的异尾双链荧光探针按照探针编码方式，加入到含有待检测样本的PCR反应体系中，进行扩增以及荧光信号收集，计算不同荧光通道的荧光净增量，与突变判定阈值进行比较，判定点突变类型；
其中，所述的异尾双链荧光探针包括荧光链和淬灭链，所述的荧光链的5’端标记荧光基团，3’端标记阻止寡核苷酸延伸的基团，所述的淬灭链3’端标记荧光淬灭基团；荧光链5’端3～25bp与模板序列不互补，与模板序列不互补区域的自由能为-25～-2kcal/mol；所述荧光链3’端10～80bp与模板序列互补，互补区域的Tm值为50～70℃；所述淬灭链与荧光链5’端互补，荧光链3’端5～80bp与淬灭链不互补，形成T区域，其中，T区域的自由能为-25～-4kcal/mol，淬灭链与荧光链5’端互补区域的自由能为-30～-1kcal/mol。
进一步地，检测α-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-13所示，淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-20所示；检测β-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-52所示，淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.54-85所示。
进一步地，所述的荧光基团为FAM、VIC、HEX、NED、CY5、Texas Red、TAMRA中的一种。
进一步地，所述的荧光淬灭基团为BHQ系列、3'IBRQ、3'IBFQ中的一种。
进一步地，所述的阻止寡核苷酸延伸的基团为磷酸基团、MGB、简臂、错配碱基中的一种。
进一步地，所述的异尾双链荧光探针中荧光链与淬灭链比例为1:2～1:20。
进一步地，所述的探针编码方式如下所示：
其中，管I中包含如下所示的异尾双链荧光探针：
管II中包含如下所示的异尾双链荧光探针：
管III包含如下所示的异尾双链荧光探针：
进一步地，所述的异尾双链荧光探针中还包括内参荧光链与内参淬灭链，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.86所示。
进一步地，所述的PCR反应体系中还包括PCR扩增引物、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、ROX荧光染料、阳性对照、阴性对照和纯水。
进一步地，所述的PCR扩增引物包括扩增α-地贫点突变序列的引物组合和扩增β-地贫点突变基因序列的引物组合；所述的扩增α-地贫点突变序列的引物组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；所述的扩增β-地贫点突变基因序列的引物组合的核苷酸序列如SEQID NO.3-6所示。
本发明的第二个目的是提供一种检测α-地贫和β-地贫点突变的试剂盒，包括异尾双链荧光探针、PCR扩增引物、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、ROX荧光染料、阳性对照、阴性对照和纯水；
所述的异尾双链荧光探针包括荧光链，以及与荧光链5’端完全互补的淬灭链，所述的荧光链的5’端标记荧光基团，3’端标记阻止寡核苷酸延伸的基团，所述的淬灭链3’端标记荧光淬灭基团；检测α-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-13所示，淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-20所示；检测β-地贫点突变的荧光链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-52所示，淬灭链的核苷酸序列如SEQ ID NO.54-85所示。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的荧光链，可排除真假基因、同源序列等相似序列干扰。
(2)本发明的荧光链，可区分相邻碱基间的变异。
(3)本发明的方法，通过荧光编码方式用4个荧光通道检测24种地贫点突变，可提高检测通量与突变位点，节省反应试剂与样本用量。
(4)本发明的方法，结果以荧光信号呈现，无需开管检测，消除潜在污染与交叉。
(5)本发明的方法，将不对称PCR与荧光链检测结合，操作简单方便，检测时间短，兼容自动化检测流程，适合大量样本检测。
附图说明
图1为本发明提供的荧光链与淬灭链序列组成示意图；
图2为本发明提供的荧光链检测单碱基变异的反应过程。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明设计由异尾双链荧光探针组成的探针对，利用不对称PCR扩增产生大量单链DNA模板，荧光链特异性结合单链DNA模板释放荧光信号，通过特征的荧光信号升高检测地贫点突变。
实施例1：
1、地贫基因序列分析与引物设计
人类珠蛋白基因包括八个功能基因与三个假基因，按所编码的珠蛋白肽链不同，形成α-珠蛋白基因簇和β-珠蛋白基因簇。
α-地贫基因簇位于16号染色体短臂，基因排列顺序为5′-ζ-ψζ-ψα-α2-α1-θ-3′，全长约40kb，功能基因包括ζ、α2、α1三个成员，在人发育的不同时期次序开启和关闭，转录翻译出ζ-珠蛋白链和α-珠蛋白链。正常人每条16号染色体上游2个α-珠蛋白基因，即α1(HBA1基因)和α2(HBA2基因)，二者表达同一种产物即α-珠蛋白链。HBA1和HBA2为高度同源基因，其序列相似性约为94％，二者编码区序列完全一致，差异仅存在于5’非翻译区以及内含子区域；此外，还存在同源基因HBZ和假基因HBZP1、HBM、HBQ1。中国人群最常见的三种α-地贫点突变ΑWS、ΑQS、ΑCS均发生在HBA2基因编码区域。
β-地贫基因簇位于11号染色体短臂，基因排列顺序为5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′，全长约75kb功能基因包括ε、Gγ、Aγ、δ、β五个成员，在人发育的不期次序开启和关闭，转录翻译出ε-珠蛋白链、γ-珠蛋白链、δ-珠蛋白链和β-珠蛋白链。HBB基因与HBD基因碱基序列高度相似，存在其他HBG1、HBG2、HBE、HBBP1等同源基因或假基因。中国人群常见的β-地贫点突变均发生在HBB基因，突变碱基集中分布于HBB基因1号外显子和2号外显子区域。
本发明提供的PCR扩增引物可特异性扩增HBA2基因与HBB基因目标序列片段，排除同源基因与假基因序列干扰。
2、荧光链设计与点突变检测原理
本发明提供的荧光链5’端标记荧光基团，3’端标记阻止延伸的基团，荧光链由5’端非同源序列区域与3’端模板互补区域组成。本发明同时提供一种淬灭链，其序列与荧光链5’端序列完全反向互补，在3’端标记荧光淬灭基团。图1中列举了一种荧光链与淬灭链的序列组成示意图。
当反应体系中不存在模板DNA时，荧光链与淬灭链碱基互补配对结合，荧光基团与淬灭基团之间形成非荧光复合物，供体(荧光基团)与受体(淬灭基团)通过氢键以质子偶联的电子转移进行相互作用，荧光基团由此被淬灭，这一淬灭方式被称为接触淬灭(Contactquenching)。在接触淬灭过程中，氢键的形成由反应体系的静电、空间位阻与疏水作用所决定，当非荧光复合物吸收能量后，立即由激发态恢复静息状态，不释放光子或发出荧光，接触淬灭的一个显著特征为，当两个分子形成非荧光复合物时，其吸收光谱将发生偏移。
在样本检测过程中，首先通过不对称PCR扩增产生大量的单链DNA模板；然后将反应体系升温至95℃，荧光链与淬灭链受热分离，成为单链游离状态；随后再降温至40℃，荧光链与单链DNA模板特异性杂交，荧光基团与淬灭基团脱离接触而发出荧光。
本发明提供的荧光链可特异性检测发生在HBA2基因与HBB基因的24种点突变，突变类型包括单碱基替换、碱基插入和碱基缺失。
本发明提供的引物、探针以Genebank提供的序列作为设计依据，采用软件进行设计，引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
引物、探针序列及标记基团如表1所示：表1
实施例2：
本实施例提供一种检测24种地贫点突变的方法，其中包括异尾双链荧光探针、PCR扩增引物、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、ROX荧光染料、阳性对照、阴性对照、纯水。方法包括3管反应体系及相应试剂，即PCR体系A、PCR体系B、PCR体系C。PCR体系A与PCR体系B用于检测18种点突变，PCR体系C检测6种点突变，通过内参信号监控样本质量与实验结果。
方法具体组成如下：表2
组分名称
主要成分
PCR反应液A
引物、探针、PCR缓冲液
PCR反应液B
引物、探针、PCR缓冲液
PCR反应液C
引物、探针、PCR缓冲液
PCR酶混合液
Taq DNA聚合酶
阳性对照
突变型基因组DNA
阴性对照
野生型基因组DNA
上述Taq DNA聚合酶可选TAKARA LA Taq DNA Polymerase、康为世纪GoldStarDNA Polymerase、BIORAD iTaq DNA Polymerase中的一种。
本方法使用方法如下：
(1)检测体系
PCR反应体系A：表3
PCR反应体系B：表4
PCR反应体系C：表5
(2)PCR条件
最优PCR反应条件：表6
(3)样本检测
1)使用商品化核酸纯化提取方法提取样本基因组DNA，将提取的基因组DNA溶于TE缓冲液中。
2)使用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。
3)取n*22μL PCR Mix A和n*1μL PCR酶混合液(n＝样本个数+1个阴性对照+1个空白对照)加入到1.5mL离心管中，混匀离心即为PCR反应液A。按照同样的试剂用量配制PCR反应液B、PCR反应液C。
4)按每管23μL将PCR反应液A/B/C分装至PCR薄壁反应管中。
5)向PCR反应液A/B/C中分别加入2μL待检DNA样本，小心盖紧PCR管盖。
6)以2000rpm转速将PCR反应管离心10秒，使反应液集中在管底。
7)将PCR反应管放入PCR仪中，按上述反应条件进行PCR扩增与荧光信号收集。
8)反应结束，将PCR管密封后丢弃于指定垃圾桶内，避免污染。
(4)数据分析
1)记录每个反应管在FAM、VIC、NED、CY5、ROX五个荧光通道的起始信号(F0)和终点信号(F1)。
2)将FAM、VIC、NED、CY5的起始信号值与终点信号值分别除以对应的ROX荧光信号值，获得校正荧光强度Fn，以FAM通道为例：Fn0＝FAM0/ROX0，Fn1＝FAM1/ROX1，其他通道荧光按照相同的计算方法进行校正。
3)将各荧光终点荧光强度Fn1减去起点荧光强度Fn0，获得荧光增量ΔFn＝Fn1-Fn0。
4)将检测样本3管反应共4个荧光通道的荧光增量ΔFns扣减阴性对照相应荧光通道的ΔFnc，获得待检测样本在4个荧光通道的荧光净增量ΔΔFn＝ΔFns–ΔFnc。
5)突变判定：将待测样本在在4个荧光通道的荧光净增量ΔΔFn与突变判定阈值进行比较，判定点突变类型。
荧光编码方式可按表7设置，举例说明，当管I中出现A阳性信号时，说明存在16号点突变和12号点突变，此时，如果管I中同时出现C阳性信号，则判断突变是12号点突变，而不是16号点突变，如果C阳性信号不出现，则判断突变是16号点突变，而不是12号点突变。
表7
实施例3：
利用本发明提供的方法检测α-地贫与β-地贫点突变临床样本
1、样本信息
使用临床地贫基因检测过程中收集的外周血样本，经Sanger测序确认地贫点突变类型，点突变类型分别为IVS-I-5(G>C)、CD14/15(+G)、Int(ATG＞AGG)、CD71/72(+A)、αWS、αQS、αCS、CD26(G>A)、CD37(TGG>TAG)、nt30(T＞C)。
2、样本检测
使用实施例1所述，对临床样本提取基因组DNA并进行质控，将质控合格的DNA样本按照所述反应体系、反应条件进行检测与结果判定。
3、检测结果：表8
实施例4：
利用本发明提供的方法区分地贫点突变的纯合、杂合状态
利用下列探针与反应体系，可判定点突变的纯合、杂合状态。表9
PCR反应体系D：表10
组分
终浓度
ThalWTF-T4ROX
10
ThalWTQ-T4ROX
20
ThalWTF-T4Cy5
30
ThalWTQ-T4Cy5
60
ThalWTF-T4HEX
50
ThalWTQ-T4HEX3
150
ThalWTF-T4FAM
10
ThalWTQ-T4FAM
20
HBB-FP1
1000nM
HBB-RP1
100nM
HBB-FP2
1000nM
HBB-RP2
100nM
Taq DNA聚合酶
0.04U
5x PCR Buffer
1x
dNTPs
0.2mM
10x ROX
1x
样本
2μL
水
～
总体积
25μL
PCR反应体系E：表11
名称
终浓度
ThalWTF-T5ROX
20
ThalWTQ-T5ROX
40
ThalWTF-T5CY5
50
ThalWTQ-T5CY5
300
ThalWTF-T5FAM
10
ThalWTQ-T5FAM
500
HBB-FP1
1000nM
HBB-RP1
100nM
Taq DNA聚合酶
0.04U
5x PCR Buffer
1x
dNTPs
0.2mM
10x ROX
1x
样本
2μL
水
～
总体积
25μL
PCR反应体系F：表12
名称
终浓度
ThalWTF-T6ROX
20
ThalWTQ-T6ROX
200
ThalWTF-T6CY5
10
ThalWTQ-T6CY5
20
ThalWTF-T6FAM
10
ThalWTQ-T6FAM
20
ThalWTF-T6HEX
50
ThalWTQ-T6HEX
100
HBB-FP1
100nM
HBB-RP1
1000nM
HBA-FP
100nM
HBA-RP
1000nM
Taq DNA聚合酶
0.04U
5x PCR Buffer
1x
dNTPs
0.2mM
10x ROX
1x
样本
2μL
水
～
总体积
25μL
利用反应体系A、B、C、D、E、F荧光信号模式，判定点突变纯合、杂合状态的原理如下：
(1)反应体系A、B、C的探针特异性检测突变型模板，反应体系D、E、F的探针特异性检测野生型模板。
(2)当待检测样本为无点突变野生型时，反应体系A、B、C全部荧光通道均无信号升高；反应体系D、E、F全部荧光通道均有信号升高。
(3)当待测样本为点突变纯合时，反应体系A、B、C对应突变位点的荧光通道信号升高，非突变位点的荧光通道无信号升高；反应体系D、E、F对应突变位点的荧光通道无信号升高，非突变位点的荧光通道信号升高。
(4)当待测样本为点突变杂合时，反应体系A、B、C对应突变位点的荧光通道信号升高，非突变位点的荧光通道无信号升高；反应体系D、E、F全部荧光通道均有信号升高。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120> 一种检测α-地贫和β-地贫点突变的方法
<160> 108
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ctccccgccg agttcac 17
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ggtctgagac aggtaaacac ctccat 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
caccctaggg ttggccaatc tactc 25
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
acttatcccc ttcctatgac atgaacttaa cc 32
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
tatcatgcct ctttgcacca ttctaaa 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atccagcctt atcccaacca taaaata 27
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
accctggtgc aggcctcc 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
ctccaagcct ccccggacaa gt 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
ccttggggtg caggcctccc tg 22
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
cccaactaat accgtcaagc tggagc 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
tactagagaa taccgtcaag ctggag 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
ccctttgaat accgtcaagc tggagc 26
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
ccctctgcct ccccggacaa gttc 24
<210> 14
<211> 11
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
tgcaccaggg t 11
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
gggaggcttg gag 13
<210> 16
<211> 12
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
tgcaccccaa gg 12
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
acggtattag ttggg 15
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
acggtattct ctagta 16
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
acggtattca aaggg 15
<210> 20
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
gggaggcaga ggg 13
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
taggaacatt gctattacct taaccca 27
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
tacccggact caacctctgg gt 22
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
actggctgat accaaactgc ccagg 25
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
ctcaaccacc aacccgccca ggg 23
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
taggacacct gactttcatg cccagc 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
tttccaacct gactttcatg cccagc 26
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
atcgccccat agagtcaccc tg 22
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
cctgaaccca tagagtcacc ctgaa 25
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
ctttatatgt aaaggactaa aagaacctct 30
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
ttgctataat tgacttttat tcccagccct g 31
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
actctgggtg tctgaggttg ctagt 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
ccgcggtgtc tgaggttgct agt 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 33
cctgatcccc accagggcag taac 24
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 34
actggcctga cttctatgcc cag 23
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 35
cccggacctt gatagcaacc tgcc 24
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 36
ccctttccca ggggcctcac ca 22
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 37
ccggtccatc acttaaaggc acc 23
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 38
ctgctccatc acttaaaggc accg 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 39
tcccagacca gcacctaagg gtgg 24
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 40
tcccagacca gcacctaagg gtg 23
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 41
ctgcataaaa ggactaaaag aacctctg 28
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 42
cccggtgact tttattccca gccc 24
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 43
cactgttgca ccctggtgtc t 21
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 44
atgacctgca ccctggtgtc tg 22
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 45
atgcgggact caaaaacctc tggg 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 46
atgcgggact caaaaacctc tggg 24
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 47
tcagatggtt cacctagccc cacag 25
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 48
tctcaattgt tcacctagcc ccacag 26
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 49
cctttcctac ccttagaccc agagg 25
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 50
cccgaactgg tggtaaggcc ctgg 24
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 51
accatatttg ggcacaaaag tcagg 25
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 52
ccgaatgtgg tggtaaggcc ctgg 24
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 53
atttcatgac actgagtgag ctgc 24
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 54
aatagcaatg ttccta 16
<210> 55
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 55
ttgagtccgg gta 13
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 56
ttggtatcag ccagt 15
<210> 57
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 57
ggttggtggt tgag 14
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 58
aaagtcaggt gtccta 16
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 59
aaagtcaggt tggaaa 16
<210> 60
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 60
tctatggggc gat 13
<210> 61
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 61
tctatgggtt cagg 14
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 62
agtcctttac atataaag 18
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 63
ataaaagtca attatagcaa 20
<210> 64
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 64
cagacaccca gagt 14
<210> 65
<211> 12
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 65
cagacaccgc gg 12
<210> 66
<211> 12
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 66
gtggggatca gg 12
<210> 67
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 67
aagtcaggcc agt 13
<210> 68
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 68
tatcaaggtc cggg 14
<210> 69
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 69
ccctgggaaa ggg 13
<210> 70
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 70
agtgatggac cgg 13
<210> 71
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 71
agtgatggag cag 13
<210> 72
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 72
tgctggtctg gga 13
<210> 73
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 73
tgctggtctg gga 13
<210> 74
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 74
agtcctttta tgcag 15
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 75
ataaaagtca ccggg 15
<210> 76
<211> 12
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 76
ggtgcaacag tg 12
<210> 77
<211> 12
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 77
ggtgcaggtc at 12
<210> 78
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 78
tttgagtccc gcat 14
<210> 79
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 79
tttgagtccc gcat 14
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 80
aggtgaacca tctga 15
<210> 81
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 81
aggtgaacaa ttgaga 16
<210> 82
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 82
aagggtagga aagg 14
<210> 83
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 83
accaccagtt cggg 14
<210> 84
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 84
tgcccaaata tggt 14
<210> 85
<211> 14
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 85
accaccacat tcgg 14
<210> 86
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 86
tcagtgtcat gaaat 15
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 87
taggaacgtc cagggaggcg tgcaccg 27
<210> 88
<211> 38
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 88
tactagaaac tcaaagaacc tctgggtcca agggtaga 38
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 89
ctgatggggc tccagcttaa cggtatttgg 30
<210> 90
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 90
actacgcacc ttgccccaca gggcagt 27
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 91
accgcccacc cttaggctgc tggt 24
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 92
tcccggtgag gccctgggca ggttggtatc aaggtt 36
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 93
ctatcgcact tcagggtgag tctatgggac 30
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 94
ctcgggtcgg tgcctttagt gatggcc 27
<210> 95
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 95
cagtttatat ggctgggcat aaaagtcagg gc 32
<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 96
ccgggttctg ggttaaggca atagcaatat 30
<210> 97
<211> 34
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 97
aatcaccacc tcaaacagac accatggtgc atct 34
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 98
gcctccctgg acgttccta 19
<210> 99
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 99
gacccagagg ttctttgagt ttctagta 28
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 100
aagctggagc cccatcag 18
<210> 101
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 101
ggcaaggtgc gtagt 15
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 102
cctaagggtg ggcggt 16
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 103
accaacctgc ccagggcctc accggga 27
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 104
tcaccctgaa gtgcgatag 19
<210> 105
<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 105
aaggcaccga cccgag 16
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 106
tatgcccagc catataaact g 21
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 107
ccttaaccca gaacccgg 18
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 108
tgtctgtttg aggtggtgat t 21
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