次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用
阅读说明：本技术 次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用 (Application of hypoxanthine nucleotide in preparing anti-infective medicament ) 是由 李惠 彭博 彭宣宪 赵贤亮 匡素芳 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,具体涉及次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用。本发明经过实验证明,次黄嘌呤核苷酸可以显著提高大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球多重耐药菌、铜绿假单胞菌等细菌对阿莫西林、头孢哌酮、美罗培南、庆大霉素等抗生素的敏感性,可以与抗生素连用作为抗感染药物,在低浓度抗生素条件下杀灭细菌,达到较好的抗感染效果,同时减少细菌耐药性的产生。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to application of hypoxanthine nucleotide in preparation of anti-infective medicines. Experiments prove that the hypoxanthine nucleotide can obviously improve the sensitivity of bacteria such as Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, staphylococcus aureus multidrug resistant bacteria, pseudomonas aeruginosa and the like to antibiotics such as amoxicillin, cefoperazone, meropenem, gentamicin and the like, can be used as an anti-infective drug together with the antibiotics, kills the bacteria under the condition of low-concentration antibiotics, achieves a better anti-infective effect, and reduces the generation of drug resistance of the bacteria.)
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用。
背景技术
作为治疗细菌感染性疾病主要药物，抗生素是世界上应用最广，发展最快，品种最多的一类药物。然而随着抗生素的广泛应用，耐药性也日益突出。世界卫生组织(WHO)在2007年《世界卫生报告》中明确指出，细菌耐药是威胁人类健康的重大公共卫生问题。
目前常用对抗细菌耐药性的方法为通过提高细菌对抗生素的敏感性，使得原本无效或低效的抗生素变得有效或高效，从而将细菌杀灭。如中国专利申请CN104606219A公开了一种提高抗生素清除病原菌的小分子代谢物肌苷，将肌苷与抗生素联用可以显著提高抗生素的杀菌作用。但是实际应用中发现，虽然肌苷能提高部分细菌对某些抗生素的敏感性，而对于其他细菌或抗生素的效果并不很理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有提高抗生素清除病原菌药物较少，且对某些细菌或抗生素的效果有限的缺陷和不足，提供一种小分子物质-次黄嘌呤核苷酸提高细菌对抗生素敏感性中的新应用，将次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用。
本发明的目的是提供一种次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用。
本发明另一目的是提供一种抗感染组合物。
本发明另一目的是提供一种抗感染药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
核苷酸Nucleotide是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，其是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动。其中，次黄嘌呤核苷酸，即6-羟基嘌呤核苷酸，又称肌苷酸(hypoxanthine nucleotide，IMP)，是嘌呤核苷酸生物合成过程中的第一个核苷酸产物，由天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、CO2及一碳单位(甲酰基及次甲基，由四氢叶酸携带)等通过11步酶促反应合成。次黄嘌呤核苷酸脱去磷酸根转变成次黄嘌呤核苷(肌苷，inosine)，次黄嘌呤核苷在核苷磷酸环化酶的作用下生成次黄嘌呤(Hypoxanthine)。
本发明通过实验证明，次黄嘌呤核苷酸可以显著提高大肠埃希菌E.coliATCC35218、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae、金黄色葡萄球多重耐药菌MRSA、铜绿假单胞菌P.aeruginosa等细菌对阿莫西林、头孢哌酮、美罗培南、庆大霉素等抗生素的敏感性，可以与抗生素连用作为抗感染药物，在低浓度抗生素条件下杀灭细菌，达到较好的抗感染效果，同时减少细菌耐药性的产生。并且，经实验证明，次黄嘌呤核苷酸与次黄嘌呤核苷(肌苷，inosine)、次黄嘌呤的效果差异显著，次黄嘌呤核苷酸能达到更好的效果。
因此，本发明要求保护次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用。
进一步地，所述次黄嘌呤核苷酸在抗感染药物中提高细菌对抗生素的敏感性。
优选地，所述细菌为大肠埃希菌E.coli ATCC35218、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae、金黄色葡萄球多重耐药菌MRSA、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、鲍曼不动杆菌ATCC19606A.baumannii、嗜水气单胞菌A.hydrophila ATCC19606、迟钝爱德华菌EIB202、弧菌-溶藻弧菌V.alginolyticus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus或化脓性链球菌S.pyogenes中的一种或多种。上述细菌为常见人类和养殖动物致病菌，其中金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌为革兰氏阴性菌。
这些细菌为常见的病原菌，且常见其耐药菌株，同时大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌是研究细菌耐药的模式菌，故这些细菌为耐药和非耐药菌的较好代表菌。尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球多重耐药菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和化脓性链球菌。尤其是本发明多数验证试验是以大肠埃希耐药菌作为研究对象的。但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为1)大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为研究耐药机制的模式菌。2)上述细菌分别属于革兰氏阴性和阳性细菌，其中金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌为革兰氏阳性菌，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌为革兰氏阴性菌。而所有人类和养殖动物病原菌均可以按照该染色进行分类，故上述细菌具有较好的代表性。3)细菌可以具有耐药和非耐药状态，即同一细菌的耐药和非耐药菌株，而本发明的大肠埃希菌即为相对非耐药状态，在添加次黄嘌呤核苷酸后亦提高了对抗生素的敏感性。因此，根据上述原理从这些菌种可以推知到更多的菌种也适宜于本发明的理念。
优选地，所述抗生素为阿莫西林、头孢哌酮、美罗培南、庆大霉素、巴洛沙星、环丙沙星、金霉素、四环素、氯霉素、林可霉素中的一种或多种。其中，氨苄青霉素为青霉素类抗生素，头孢哌酮为头孢菌类抗生素(两者同为β-内酰胺类抗生素)；巴洛沙星和环丙沙星为喹诺酮类抗生素；庆大霉素为氨基糖苷类抗生素；红霉素为大环内酯类抗生素；金霉素和四环素为四环素类抗生素；氯霉素为酰胺醇类抗生素；林可霉素为林可酰胺类抗生素。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。
另外的，本发明还提供了一种抗感染组合物，所述组合物含有次黄嘌呤核苷酸和抗生素。
进一步地，所述抗生素为阿莫西林、头孢哌酮、美罗培南、庆大霉素、巴洛沙星、环丙沙星、金霉素、四环素、氯霉素、林可霉素中的一种或多种。上述抗生素并不能作为对本发明保护范围的限制。这是因为虽然抗生素的品种数以百计，但可以根据其化学结构和抗菌机制可以分类，相似化学结构的具有相同的抗菌机制，因此不需要一一进行验证。目前，临床常用抗生素分为：青霉素类抗生素，头孢菌类抗生素，喹诺酮类抗生素，氨基糖苷类抗生素，酰胺醇类抗生素，大环内酯类抗生素，四环素类抗生素和林可酰胺类抗生素。本发明所采用的氨苄青霉素为青霉素类抗生素，头孢哌酮为头孢菌类抗生素(两者同为β-内酰胺类抗生素)；巴洛沙星和环丙沙星为喹诺酮类抗生素；庆大霉素为氨基糖苷类抗生素；红霉素为大环内酯类抗生素；金霉素和四环素为四环素类抗生素；氯霉素为酰胺醇类抗生素；林可霉素为林可酰胺类抗生素。因此，具有很好的抗生素代表性。领域技术人员根据本发明的理念，可以容易地推知到，临床其余多种抗生素也同样能适用于本发明所述的方法。
更进一步地，所述次黄嘌呤核苷酸和抗生素的质量比为(300～5500):1。
优选地，所述次黄嘌呤核苷酸和抗生素的质量比为(326～5223):1。
另外的，本发明还提供了一种抗感染药物，所述抗感染药物含有所述组合物。
进一步地，所述抗感染药物可以添加药学上允许添加的辅料制成口服剂型或注射剂型。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用，并且经过实验证明，次黄嘌呤核苷酸可以显著提高大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球多重耐药菌、铜绿假单胞菌等细菌对阿莫西林、头孢哌酮、美罗培南、庆大霉素等抗生素的敏感性，可以与抗生素连用作为抗感染药物，在低浓度抗生素条件下杀灭细菌，达到较好的抗感染效果，同时减少细菌耐药性的产生。
附图说明
图1为肌苷和次黄嘌呤核苷酸提高肺炎克雷伯菌对不同抗生素敏感性的结果数据统计图。
图2为肌苷和次黄嘌呤核苷酸提高铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对不同抗生素敏感性的结果数据统计图。
图3为黄嘌呤核苷酸提高大肠埃希菌对氨苄青霉素敏感性的结果数据统计图。
图4为次黄嘌呤核苷酸提高大肠埃希菌对氨苄青霉素敏感性的浓度梯度结果数据统计图。
图5为次黄嘌呤核苷酸提高多种细菌对氨苄青霉素敏感性的结果数据统计图。
图6为次黄嘌呤核苷酸提高大肠埃希菌对多种抗生素敏感性的结果数据统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1样本制备
挑取细菌单菌落接种于5mL LB培养基中，37℃(大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，金黄色葡萄球多重耐药菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，和化脓性链球菌或30℃(嗜水气单胞菌，迟钝爱德华菌，溶藻弧菌，副溶血弧菌)200rpm培养16小时；按1:100转接菌液至新鲜LB培养基中，37℃或30℃200rpm培养到OD600为1.0，取适量的菌液于8000rpm，5min离心收集菌体，除去上清并以等体积0.85％生理盐水洗涤菌体3次，悬浮于1×M9(含10mM乙酸钠，2mMMgSO4，0.1mM CaCl2)，并于M9培养基调菌液浓度到106CFU/mL(稀释1000倍)；分装到5mL试管中备用。
实施例2次黄嘌呤核苷酸和肌苷提高细菌对抗生素敏感性效果测定
将实施例1制备好的每种细菌样本分成3个组，2个实验组分别加入10mM次黄嘌呤核苷酸(IMP)和肌苷(Inosine)，另一个对照组加入等体积生理盐水；每支试管都加入相对应的抗生素，三个生物学重复；37℃200rpm摇床中孵育6小时，然后取100μL采用系列稀释法，分别取10μL进行点板计数，计算细菌CFU/mL(菌落形成单位/毫升)；细菌菌落数在20-200的数据可用于统计分析；细菌存活率(percent survival)为加入抗生素和肌苷或黄嘌呤核苷酸处理后的细菌CFU/仅仅加入抗生素的细菌数量×100％。
结果参见图1～2，由图可见，对于肺炎克雷伯菌R10，肌苷可提高其对庆大霉素敏感性约2.35倍，而IMP可提高4.95倍；肌苷可提高其对头孢哌酮敏感性约31.83倍，而IMP可提高0.88倍。对于肺炎克雷伯菌R3，肌苷可提高其对庆大霉素敏感性约3.61倍，而IMP可提高1.71倍；肌苷可提高其对头孢哌酮敏感性约2.45倍，而IMP可提高1.64倍。对于肺炎克雷伯菌R12，肌苷可提高其对庆大霉素敏感性约8.33倍，而IMP可提高5.47倍；肌苷可提高其对头孢哌酮敏感性约2.45倍，而IMP可提高1.75倍(图1)。
对于铜绿假单胞菌A2，肌苷可提高其对庆大霉素敏感性约2.48倍，而IMP可提高15.09倍；肌苷可提高其对头孢哌酮敏感性约3.91倍，而IMP可提高5倍。对于鲍曼不动杆菌9，肌苷可提高其对庆大霉素敏感性约1.28倍，而IMP可提高2.14倍；肌苷可提高其对阿莫西林敏感性约2.95倍，而IMP可提高1.64倍(图2)。
从上述结果来看，肌苷和次黄嘌呤核苷酸提高细菌对抗生素敏感性存在显著的差异，表现在：(1)对于相同抗生素，肌苷和次黄嘌呤核苷酸效果不一样，有些细菌是肌苷效果优于次黄嘌呤核苷酸，而有些细菌是次黄嘌呤核苷酸效果优于肌苷；(2)对于同一细菌，肌苷和次黄嘌呤核苷酸效果对不同抗生素效果也不一样。
实施例3次黄嘌呤核苷酸可提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性
将制备好的大肠埃希菌K12样本分成3个组，2个实验组分别加入7.5mM次黄嘌呤核苷酸(IMP)和次黄嘌呤(Hypoxanthine)，对照组加入等体积生理盐水，每支试管都加入100微克/毫升氨苄青霉素，三个生物学重复；37℃200rpm摇床中孵育6小时，然后取100μL采用系列稀释法，分别取10μL进行点板计数，计算细菌CFU/mL(菌落形成单位/毫升)。细菌菌落数在20-200的数据可用于统计分析。细菌存活率(percent survival)是次黄嘌呤化合物和/或抗生素处理后的细菌CFU/起始细菌数量×100％。
结果参见图3，由图可见，仅加入氨苄青霉素细菌的存活率为75.98％，在加入氨苄青霉素基础上再加入次黄嘌呤后细菌存活率下降为28.65％，敏感性提高2.65倍；而在加入氨苄青霉素基础上再加入次黄嘌呤核苷酸后细菌存活率下降为0.41％，敏感性却提高了182倍。结果说明次黄嘌呤核苷酸可以大大提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性。
实施例4次黄嘌呤核苷酸提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性具有IMP浓度依赖性
为研究次黄嘌呤化合物浓度与杀菌效率之间是否存在梯度效应，以及其最佳杀菌浓度，我们以大肠埃希菌K12菌株为对象，在添加100微克/毫升氨苄青霉素基础上加入不同浓度的次黄嘌呤化合物(0.938mM～15mM)作用6小时，然后进行活菌计数，并计算生存率，公式为添加不同浓度次黄嘌呤化合物时活菌数/起始细菌数量×100％。
结果参见图4，由图可见，对照组(即没有添加次黄嘌呤核苷酸)的细菌生存率为69.97％，而随着添加次黄嘌呤核苷酸浓度的升高，细菌的生存率从5.97％降低为0.27％，杀菌效率从11.7倍提高至263倍。这些结果说明，次黄嘌呤核苷酸提高大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性具有浓度依赖性，而次黄嘌呤在浓度变化时生存率不变，即无浓度依赖性，提示次黄嘌呤的作用不明显。
实施例5次黄嘌呤核苷酸提高多种细菌对氨苄青霉素的敏感性
为研究次黄嘌呤核苷酸是否对多种细菌有效，进行了次黄嘌呤核苷酸提高多种细菌对氨苄青霉素敏感性的研究。细菌种类包括大肠埃希菌(E.coli ATCC35218)，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，金黄色葡萄球多重耐药菌(MRSA)，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，鲍曼不动杆菌ATCC19606(A.baumannii)，嗜水气单胞菌(A.hydrophila ATCC19606)，迟钝爱德华菌(EIB202)，弧菌(溶藻弧菌V.alginolyticus，副溶血弧菌V.parahaemolyticus)和化脓性链球菌(S.pyogenes)，具体细菌及使用的抗生素氨苄青霉素剂量参见表1。
表1细菌及其使用的氨苄青霉素剂量
按照实施例1分别制备每种细菌样本，分装于5mL试管中，根据表1所示每种细菌使用不同的氨苄青霉素剂量，再加入或不加入15mM次黄嘌呤核苷酸作用6小时，然后进行活菌计数，并计算生存率，公式为次黄嘌呤核苷酸和/或抗生素处理后的细菌CFU/起始细菌数量×100％。
结果参见图5，由图可见，添加次黄嘌呤核苷酸后，这些细菌对氨苄青霉素的敏感性普遍都得到了提高，具体如下：大肠埃希菌ATCC35218提高了39.77倍，肺炎克雷伯菌提高了4.82倍，金黄色葡萄球多重耐药菌(MRSA)提高了3.19倍，铜绿假单胞菌提高了169.94，鲍曼不动杆菌提高了10.76倍，嗜水气单胞菌提高了95倍，迟钝爱德华菌提高了26.88倍，溶藻弧菌提高了21.33倍，副溶血弧菌提高了4.47倍，化脓性链球菌提高了6.46倍。
实施例6次黄嘌呤核苷酸提高大肠埃希菌对其他抗生素的敏感性
为研究添加次黄嘌呤核苷酸后，大肠埃希菌是否对氨苄青霉素类以外的其他抗生素有效，按照实例1制备大肠埃希菌K12样品，分别添加15mM次黄嘌呤核苷酸和抗生素(抗生素分别为阿莫西林，头孢哌酮，美罗培南，庆大霉素，巴洛沙星，环丙沙星，金霉素，四环素，氯霉素和林可霉素)，每种抗生素使用剂量见表2。作用6小时后统计活菌数量，计算生存率。
表2抗生素及其使用剂量
抗生素
中文
使用剂量(μg/mL)
Amoxicillin
阿莫西林
100
Cefoperazone
头孢哌酮
100
Meropenem
美罗培南
10
Gentamicin
庆大霉素
10
Baloflocacin
巴洛沙星
10
Ciprofloxacin
环丙沙星
2
Chlortetracycline
金霉素
200
Tetracycline
四环素
20
Chloramphenicol
氯霉素
200
Lincomycin
林可霉素
10
结果参见图6，由图可见，次黄嘌呤核苷酸均能提高起始菌对多种抗生素的敏感性，具体情况如下：阿莫西林提高了89.84倍，头孢哌酮提高了156.47倍，美罗培南提高了24.37倍，庆大霉素提高了58.17倍，巴洛沙星提高了17.4倍，环丙沙星提高了6.75倍，金霉素提高了2.98倍，四环素提高了3.57倍，氯霉素提高了1.37倍，林可霉素提高了1.66倍。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。