具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的作进一步解释说明，这些实施例应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1

复配核苷酸按照重量配比AMP 16.9％、CMP 43.2％、GMP 17.8％、UMP 22.1％在洁净区称取原料，用混合机混合均匀，既得粉剂，按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后备用；然后在洁净区按照上述制备的复配核苷酸1.2份、茶多酚1份、白藜芦醇0.05份、辅酶Q10 0.04份、烟酰胺0.02份配比，称取原料，用混合机混合均匀，压成片剂，片重为0.3g。成品按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后保存备用。

实施例2

复配核苷酸按照重量配比AMP 16.9％、CMP 43.2％、GMP 17.8％、UMP 22.1％在洁净区称取原料，用混合机混合均匀，既得粉剂，按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后备用；然后在洁净区按照上述制备的复配核苷酸1.2份、黄芪多糖0.2份、姜黄素0.19份、白藜芦醇0.05份、烟酰胺0.02份配比，称取原料，用混合机混合均匀，压成片剂，片重为0.3g。成品按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后保存备用。

实施例3

复配核苷酸按照重量配比AMP 24.3％、CMP 28.3％、GMP 19.3％、UMP 28.1％在洁净区称取原料，用混合机混合均匀，既得粉剂，按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后备用；然后在洁净区按照上述制备的复配核苷酸0.6份、海洋鱼低聚肽0.43份配比，称取原料，用混合机混合均匀，压成片剂，片重为0.3g。成品按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后保存备用。

实施例4

复配核苷酸按照重量配比AMP 24.3％、CMP 28.3％、GMP 19.3％、UMP 28.1％在洁净区称取原料，用混合机混合均匀，既得粉剂，按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后备用；然后在洁净区按照上述制备的复配核苷酸1.2份、茶多酚1份、白藜芦醇0.05份、辅酶Q10 0.04份、烟酰胺0.02份配比，称取原料，用混合机混合均匀，压成片剂，片重为0.3g。成品按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后保存备用。

实施例5

复配核苷酸按照重量配比AMP 24.3％、CMP 28.3％、GMP 19.3％、UMP 28.1％在洁净区称取原料，用混合机混合均匀，既得粉剂，按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后备用；然后在洁净区按照上述制备的复配核苷酸1.2份、黄芪多糖0.2份、姜黄素0.19份、白藜芦醇0.05份、烟酰胺0.02份配比，称取原料，用混合机混合均匀，压成片剂，片重为0.3g。成品按质量标准的规定取样进行各项指标的检验，检验合格后保存备用。

实施例6

为了验证本发明的含核苷酸组合物延缓衰老的作用，本实验首先通过考察含核苷酸组合物的抗氧化性能。

取1片实施例1制备的片剂，准备称重后溶解于去离子水和乙醇的混合溶液中(体积比为1:1)，制得浓度为1mg/mL的母液，进行DPPH自由基清除率的测定和ABTS自由基清除率的测定。

1.DPPH自由基清除率的测定：

将母液分别稀释100，50，25，10，1倍制备成浓度为10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，100μg/mL，500μg/mL的梯度稀释液。

分别取上述浓度150μL样品和150μL浓度为60mg/L的DPPH溶液(无水乙醇稀释)置于96孔板中，混合均匀，30℃避光保存，30min后使用酶标仪测量519nm下吸光度值。DPPH自由基清除率公式如下：

式中，A空白为150μL去离子水乙醇溶液和150μL DPPH溶液的吸光度，A样品为150μL样品和150μL DPPH溶液的吸光度；IC₅₀为DPPH自由基清除率达到50％时样品的浓度。

2.ABTS自由基清除率的测定：

(1)将母液分别稀释100，50，25，10，1倍制备成浓度为10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，100μg/mL，500μg/mL的梯度稀释液。

(2)将7mmol/L的ABTS溶液和140mmol/L的过硫酸钾溶液以62.5：1的比例混合，室温避光静置过夜，形成ABTS储备液，使用前用去离子水稀释成5mmol/L的ABTS工作液。

(3)分别取0.15mL上述稀释液样品与2.85mL ABTS工作液混合，30℃下静置8min，以去离子水为空白在734nm下测定吸光度。

ABTS自由基清除率公式如下：

式中，A空白为0.15mL去离子水乙醇溶液和2.85mL ABTS工作液的吸光度，A样品为0.15mL样品和2.85mL ABTS工作液的吸光度。IC₅₀为ABTS自由基清除率达到50％时样品的浓度。

参考上述同样的检测方法检测实施例2中含核苷酸组合物片剂以及实施例3中含核苷酸组合物片剂的抗氧化性能，以仅有与实施例1的片剂相同量及相同配比的复配核苷酸作为对照实验1，以仅有与实施例3的片剂相同量及相同配比的复配核苷酸作为对照实验2，仅有与实施例1的片剂相同量及相同配比的茶多酚、白藜芦醇、辅酶Q10、烟酰胺的组合物作为对照实验3，仅有与实施例2的片剂相同量及相同配比的黄芪多糖、姜黄素、白藜芦醇、烟酰胺的组合物作为对照实验4，仅有与实施例3的片剂相同量及相同配比的海洋鱼低聚肽作为对照实验5，实验数据以均值±标准偏差表示，实验结果如表1所示。

表1.含核苷酸组合物的抗氧化性能

结果表明，与对照组1-5相比，实施例1-3的含核苷酸组合物均具有较高的抗氧化性能，复配核苷酸和功能活性成分复配后抗氧化性能呈现显著增强的效果，实施例1-3的含核苷酸组合物能够更有效的清除机体的自由基。

实验例7

为进一步验证本发明的含核苷酸组合物具有延缓衰老的作用，进行了体外实验进行评价。以人脐静脉内皮细胞、PC-12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)为模型，采用H₂O₂造模，对实施例1-3的含核苷酸的组合物进行评价实验，以仅有与实施例1的片剂相同量及相同配比的复配核苷酸作为对照实验1，以仅有与实施例3的片剂相同量及相同配比的复配核苷酸作为对照实验2，仅有与实施例1的片剂相同量及相同配比的茶多酚、白藜芦醇、辅酶Q10、烟酰胺的组合物作为对照实验3，仅有与实施例2的片剂相同量及相同配比的黄芪多糖、姜黄素、白藜芦醇、烟酰胺的组合物作为对照实验4，仅有与实施例3的片剂相同量及相同配比的海洋鱼低聚肽作为对照实验5，并以相同剂量的β-烟酰胺单核苷酸(NMN)为对照实验6，进行细胞毒性试验和细胞内ROS水平的评价试验。

1.细胞毒性试验

将对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为10⁵个/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每组6个平行孔。接种24小时后，细胞贴壁生长，弃上清，加入终浓度200μmol/L的H₂O₂的培养基培养4h，然后替换为终浓度分别为50μg/mL、10μg/mL的组合物培养液继续培养24小时。实验同时设置不加H₂O₂的空白对照和只加H₂O₂的模型组，用MTT法测定细胞存活状况：每孔加入50μL MTT储备液，终浓度为2mg/mL。继续培养4小时后，弃去上清，每孔加DMSO 100μL，10min后用自动酶标仪于490nm测定各孔吸光度A，计算细胞的存活率。实验数据以均值±标准偏差表示，实验结果如表2所示。

表2.人脐静脉内皮细胞和PC-12细胞的存活率

上述结果表明，与模型对照组相比，对照组1-6能够提高H₂O₂处理后细胞的存活率，实施例1-3的含核苷酸组合物能够显著提高H₂O₂处理后细胞的存活率，几乎和空白对照组试验结果无明显区别，进一步说明，实施例1-3的含核苷酸组合物具有非常优异的修复细胞效果。

2.细胞内ROS水平的评价试验

过氧化氢作用细胞后产生大量ROS，攻击细胞膜、蛋白质及核酸，导致细胞损伤。将对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为10⁵个/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每组6个平行孔。接种24小时后，细胞贴壁生长，弃上清，加入终浓度200μmol/L的H₂O₂的培养基培养4h，然后替换为终浓度分别为50μg/mL的组合物培养液继续培养24小时。实验同时设置不加H₂O₂的空白对照和只加H₂O₂的模型组，用活性氧检测试剂盒进行细胞内活性氧的状况评价：每孔加入10μmol/L的DCFH-DA母液(DMSO溶解)，终浓度为1μmol/L。继续培养2小时后，弃去上清，每孔加PBS 100μL洗涤2次，离心后使用200μL的PBS重悬细胞，使用荧光酶标仪于激发波长485nm，发射波长为525nm条件下测定各孔荧光强度，计算细胞的活性氧含量。实验数据以均值±标准偏差表示，实验结果如表3所示。

表3.人脐静脉内皮细胞和PC-12细胞内的活性氧含量

上述结果表明，和模型对照以及对照组1-6的组合物相比，实施例1-3的含核苷酸组合物能够显著降低模型细胞内的活性氧，实施例1-3的含核苷酸组合物对氧化损伤的细胞具有良好的保护和修复作用。

实验例8

衰老的机制涉及多个方面，为了更好的验证本发明的含核苷酸组合物对延缓衰老的作用，我们以快速老化倾向小鼠(SAMP 8，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)为模型动物，以本发明含核苷酸组合物为干预物进行长期喂养来开展体内研究，考察实施例1-3中含核苷酸的组合物对小鼠自主活动能力、学习记忆能力、脑损伤及嗅觉的改善作用以及肌肉衰减的改善作用。取110只快速老化倾向小鼠，体重为(20±5)g，随机分成11组，以饲喂基础饲料为阳性对照组，以3月龄的SAMP 8为阴性对照组，以仅饲喂有与实施例1的片剂相同量及相同配比的复配核苷酸作为对照实验1，以仅饲喂有与实施例3的片剂相同量及相同配比的复配核苷酸作为对照实验2，仅饲喂有与实施例1的片剂相同量及相同配比的茶多酚、白藜芦醇、辅酶Q10、烟酰胺的组合物作为对照实验3，仅饲喂有与实施例2的片剂相同量及相同配比的黄芪多糖、姜黄素、白藜芦醇、烟酰胺的组合物作为对照实验4，仅饲喂有与实施例3的片剂相同量及相同配比的海洋鱼低聚肽作为对照实验5，并以相同剂量的β-烟酰胺单核苷酸(NMN)为对照实验6，结合多种行为形态学检测方法验证本发明的含核苷酸组合物对延缓衰老的作用效果。

1.含核苷酸的组合物对小鼠自主活动能力的改善---开阔场实验

本研究在实验动物9月龄时，即含核苷酸的组合物干预6个月后(每次1片，每天1次)，进行开阔场实验。开阔场行为分析主要反映动物自主活动能力和对新环境的探索，习惯以及伴随的情绪变化，是用于评价小鼠自发活动能力的实验。它的原理是小鼠有畏惧空旷明亮场地的天性，同时面对新鲜事物又会产生好奇心去探索，小鼠焦虑时，会减少探索中央区域，倾向于待在边缘区域；跨格次数及站立次数是动物探索行为及兴奋性的反映，中央格时间反映动物对环境的认知能力，正常动物会避开空旷环境，迅速离开中央格，沿周边活动。实验数据以均值±标准偏差表示，实验结果如表4所示。

表4.含核苷酸的组合物对小鼠自主活动能力的影响

综上可知，与对照组1-6相比，实施例1-3组的含核苷酸的组合物明显改善了快速老化倾向小鼠的自发活动性和探索能力。

2.含核苷酸的组合物对小鼠非空间学医记忆能力的改善---新物体识别实验

本研究在实验动物9月龄时，即含核苷酸的组合物干预6个月后(每次1片，每天1次)，进行新物体识别实验。新物体识别实验是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法，用于检测小鼠的非空间学习记忆能力，它是建立在小鼠对新异物体的自发探索行为的基础上的，对记忆保持能力的测试。该方法具有让老鼠在自由活动状态下进行学习记忆测试的特点，能更近似地模拟人类的学习记忆行为。同时，通过新物体(形状、大小等)的灵活变换，该实验还允许测试动物长期或短期记忆机制的形成以及在特定阶段的记忆形成的影响评判。该实验能反映小鼠自发的记忆能力，是目前一种新型的评价脑部功能的重要行为学方法。

表5.含核苷酸的组合物对小鼠新旧物体探索时间(s)的影响

由上述实验结果可知，与对照组1-6相比，实施例1-3组小鼠对新物体的探索时间均明显长于旧物体，说明了实施例1-3的含核苷酸的组合物明显改善了快速老化倾向小鼠的自发的记忆能力。

3.含核苷酸的组合物对小鼠脑损伤的改善---筑巢实验

本研究在实验动物9月龄时，即含核苷酸的组合物干预6个月后(每次1片，每天1次)，进行筑巢实验。筑巢行为是小鼠的一种本能行为，操作简单、无损伤，可以反映小鼠脑损伤情况。有研究显示，小鼠筑巢行为能力受到神经递质的调控以及众多脑区的控制。脑区功能正常完好的小鼠，其筑巢能力优秀。在实验前一天弃去旧垫料，放入定量刨花，每个笼内均匀放入16块软纸片(4.5cm×4.5cm)，作为小鼠作巢材料。分别于实验开始后12h、18h、24h对各组小鼠筑巢效果进行四分制盲法评分，实验得分结果以三位实验人员的平均打分值，记为该时间点小鼠筑巢行为的得分，实验结果如表7所示。

表6.各组小鼠在12h、18h、24h的筑巢评分

由上述实验结果可知，在12h(筑巢初期)时，各组小鼠的筑巢质量无明显差异；随着小鼠筑巢时间的延长、每组小鼠撕咬软纸片迹象增多，筑巢质量也均有提高，在筑巢24h时，实施例1-3组小鼠筑巢质量得分较高，几乎和阴性对照组试验结果无明显区别，表明实施例1-3的含核苷酸组合物能够有效提升衰老小鼠筑巢能力以及改善小鼠脑区受损程度。

4.含核苷酸的组合物对小鼠嗅觉记忆的改善---嗅觉记忆实验

本研究在实验动物9月龄时，即含核苷酸的组合物干预6个月后(每次1片，每天1次)，进行嗅觉记忆实验。嗅敏动物的学习记忆能力、寻食能力等与嗅觉有很高的相关性，可以通过观察、记录其行为学的改变，从而判断其嗅觉功能的变化。嗅觉记忆实验原理是随着某种具有特殊气味的物体暴露次数的增加，动物气味产生适应，根据这一特点，反应动物对该气味的记忆能力，实验分为适应期(第一天)和检测期(第二天)。实验中选择的两种气味：薄荷香精、柠檬香精气味，小鼠对这两种气味没有偏好，每种气味允许小鼠自由探索30s，分别重复四次，然后记录小鼠每次嗅探离心管的时间。嗅探时间定义为：当小鼠朝向离心管且鼻子距离离心管周围1cm范围内所花费的时间，排除小鼠啃咬或攀爬离心管所花费的时间，实验结果如表7所示。

表7.含核苷酸的组合物对小鼠嗅探时间(s)的影响

由表7结果可知，与阳性对照实验组和对照实验1-6相比，实施例1-3组小鼠仅需较短的时间就能够适应上述气体，由此可知，实施例1-3的含核苷酸组合物能够改善小鼠的气味适应行为，对老年小鼠的嗅觉记忆具有保护作用。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。