蒲公英甾醇合酶，编码蒲公英甾醇合酶的基因及其制备和应用
阅读说明：本技术 蒲公英甾醇合酶，编码蒲公英甾醇合酶的基因及其制备和应用 (Taraxasterol synthase, gene for coding taraxasterol synthase and preparation and application thereof ) 是由 章焰生 乔玮博 李长福 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蒲公英甾醇合酶,编码蒲公英甾醇合酶的基因及其制备和应用。该具蒲公英甾醇合酶活性的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；2)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质。本发明克隆到一个关键蒲公英甾醇合酶基因的全长序列,并利用酵母转化技术鉴定了此蒲公英甾醇合酶基因所编码的蛋白质为多功能环化酶,能够催化2,3-氧化鲨烯生成蒲公英甾醇,从而为利用酵母生产蒲公英甾醇提供了一个必要的基因资源。(The invention discloses a taraxasterol synthase, a gene for coding the taraxasterol synthase, and preparation and application thereof. The protein with taraxasterol synthase activity is the protein of a) or b) or c) or d) as follows: 1) protein with amino acid sequence shown as SEQ ID NO. 2; 2) a fusion protein obtained by connecting a label to the N end and/or the C end of the protein shown in SEQ ID NO. 2; 3) the protein with the same function is obtained by substituting and/or deleting and/or adding one or more amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2. The invention clones a key taraxasterol synthase gene full-length sequence, and utilizes a yeast transformation technology to identify that the protein coded by the taraxasterol synthase gene is multifunctional cyclase and can catalyze 2, 3-oxidosqualene to generate taraxasterol, thereby providing a necessary gene resource for producing the taraxasterol by utilizing yeast.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蒲公英甾醇合酶，编码蒲公英甾醇合酶的基因及其制备和应用。
背景技术
蒲公英甾醇广泛存在于蒲公英中，是蒲公英全草中的药用活性成分之一。据报道，蒲公英甾醇同样存在于非洲药用植物绿玉树中，在绿玉树的乳汁中含有较多的蒲公英甾醇。蒲公英甾醇，具有抑菌、消炎、镇痛、预防癌症和抗乙型肝炎病毒(HBV)等功效。其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，可用于制备α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂，亦可以作为治疗糖尿病的药物。同时有小鼠实验表明，蒲公英甾醇对小鼠哮喘和内毒血症具有保护作用。蒲公英甾醇的生物合成主要是通过氧化鲨烯环化酶(OSC)环化2,3-氧化鲨烯而成。目前，关于2,3-氧化鲨烯环化酶基因的克隆已有不少报道，但是有关合成蒲公英甾醇的基因，以及其相关的生物合成的工作，国内外尚未有报道。
本发明首次报道了蒲公英甾醇合酶的基因序列以及氨基酸序列，并以酿酒酵母为宿主菌，构建了含有来源于绿玉树的蒲公英甾醇合酶基因EtOSC6的重组工程菌，成功实现了蒲公英甾醇的异源生物合成。
发明内容
为此，本发明提供蒲公英甾醇合酶，编码蒲公英甾醇合酶的基因及其制备和应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明一方面提供一种具蒲公英甾醇合酶活性的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
2)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质；
4)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
优选地，所述标签为6*组氨酸标签、Flag标签、MBP标签、HA标签或c-Myc标签。
本发明另一方面提供编码所述的具蒲公英甾醇合酶活性蛋白的基因，其核酸分子为如下(a)或(b)或(c)的基因：
(a)其编码序列是SEQ ID NO：1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
(b)与(a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SEQ ID NO：2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸杂交，且编码SEQ ID NO：2所示的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述严格条件是在6×SSC(含0.5％SDS)的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC(含0.1％SDS)和1×SSC(含0.1％SDS)各洗膜一次。
优选地，所述基因来源于绿玉树。
本发明另一方面还提供含所述编码具蒲公英甾醇合酶活性的基因核酸分子的表达盒。
本发明另一方面还提供含所述编码具蒲公英甾醇合酶活性的基因核酸分子的表达载体。
优选地，所述表达载体是酵母表达载体或大肠杆菌表达载体。
本发明另一方面还提供含所述的所述编码具蒲公英甾醇合酶活性的基因核酸分子的转化细胞，所述转化细胞为细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或者植物细胞。
本发明另一方面还提供所述的具蒲公英甾醇合酶活性的蛋白质的制备方法，其包括扩增所述的编码具蒲公英甾醇合酶活性的的基因片段，将所述基因片段连入载体pEASY-Blunt Simple载体，将连有所述基因的pEASY-Blunt Simple载体质粒转化入DH5α感受态细胞，再将DH5α中所述含有该基因的载体克隆至酵母表达载体得到酵母表达质粒pESC-Ura-EtOSC6，将所述重组质粒pESC-Ura-EtOSC6转入酿酒酵母得，得到表达蒲公英甾醇合酶的菌株。
本发明另一方面还提供所述的蛋白质在如下任一中的应用，
(a1)制备用于含蒲公英甾醇物质的产品；
(a2)制备用于2，3-氧化鲨烯环化形成蒲公英甾醇物质的产品；
(a3)制备含蒲公英甾醇合酶的产品。
本发明利用转录组和代谢物整合分析，从绿玉树植物中分离得到一个关键OSC基因,并将此基因转入酵母细胞，转基因酵母能够催化2,3-氧化鲨烯生成蒲公英甾醇；本发明将为蒲公英甾醇的合成提供必要的基因资源与新的合成技术。
本发明具有如下优点：
本发明首次克隆到一个关键蒲公英甾醇合酶基因的全长序列，并利用酵母转化技术鉴定了此蒲公英甾醇合酶基因所编码的蛋白质为多功能环化酶，能够催化2,3-氧化鲨烯生成蒲公英甾醇，从而为利用酵母生产蒲公英甾醇提供了一个必要的基因资源。
本发明蒲公英甾醇的异源生物合成弥补了直接从植物中进行提取纯化蒲公英甾醇的生产成本高，环境污染大等缺陷，具有很大的应用前景。该基因的发现为代谢工程技术生产化合物蒲公英甾醇提供必要的基因资源，具有潜在的应用价值。
通过本发明表达蒲公英甾醇合酶的工程菌制备得到的蒲公英甾醇，具有抑菌、消炎、镇痛、预防癌症和抗乙型肝炎病毒(HBV)等功效。其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，可用于制备α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂，亦可以作为治疗糖尿病的药物。同时有小鼠实验表明，蒲公英甾醇对小鼠哮喘和内毒血症具有保护作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例的绿玉树根、茎、叶和乳汁转录组数据和代谢物整合分析：A为绿玉树根、茎、叶和乳汁候选基因转录组数据FPKM值热图分析；B为绿玉树根、茎、叶和乳汁蒲公英甾醇成分分析；
图2为本发明实施例的绿玉树总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图3为本发明实施例的PCR扩增蒲公英甾醇合酶基因(EtOSC6)的全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：M为DNA分子量标准，1为PCR扩增产物；
图4为本发明实施例的转基因酵母合成蒲公英甾醇的GC-MS检测图谱，其中：a:β-Amyrin；b:Cycloartenol；c:α-Amyrin；d:24-Methylenecycloartanol；e:Taraxasterol，其中Taraxasterol为蒲公英甾醇的标准样品。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、绿玉树根、茎、叶和乳汁转录组数据和代谢物整合分析蒲公英甾醇合酶基因的全长cDNA序列的获得
1、根据绿玉树根、茎、叶和乳汁转录组数据(NCBI登录号：根，SRR6282416；茎，SRR6282415；叶，SRR6282414；乳汁，SRP073643)整合分析，去除多余和重复序列后用Trinity软件(Grabherr等，2011)将转录组数据重新整合分析，共筛选到7个氧化鲨烯环化酶(OSC)基因。将用FPKM方法对各组织样本中7个OSC基因的转录本的丰度进行了计算和归一化，如图1A所示。
2、同时用GC-MS检测了四个不同组织中化合物蒲公英甾醇含量，如图1B所示。具体方法如下：
分别取100mg新鲜的根、茎、叶组织，液氮研磨法将样品研磨成粉末。用小刀割开绿玉树茎皮，收集约100mg乳汁。将样品粉末和乳汁重悬在1ml的乙酸乙酯：乙醇(4:1，v/v)混合溶剂中，超声萃取60min(每个样品3个生物学重复)。提取样品用高通量溶剂工作站挥干，重新溶解在0.5ml的甲醇溶液中。样品用0.44μm过滤后，用GC-MS检测分析。气相色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。进样量为1μl进样口温度250℃，采用非分流模式，载气为氦气，流速0.8ml/min，起始温度80℃，保持2min，20℃/min升至250℃，保持15min。EI电离源EI，电子能量70eV，全扫描模式，扫描范围50-600m/z。采用标准曲线法测定甾醇类化合物的浓度，蒲公英甾醇为标准对照品。
将绿玉树根、茎、叶和乳汁转录组数据和代谢物整合分析，推测EtOSC5和EtOSC6可能为目标基因，其中EtOSC5已被验证为大戟二烯醇合酶基因。
实施例2、蒲公英甾醇合酶基因的全长cDNA序列的获得
1、提取绿玉树不同组织的总RNA，如图2所示。具体方式如下：
称取约100mg绿玉树根、茎、叶组织于液氮中进行快速研磨，将磨好的样品粉末用EASYspin plus植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱)提取总RNA。
2、将RNA逆转录成cDNA。具体方式如下：
向无RNase的PCR管中加入以下成分：RNA:8μl(约1.5μg)，DNase I:1μl，10×DNaseI buffer：1μl，RNase抑制剂：0.5μl。将上述物质混匀，37℃温育30min。然后加入1μl 100mMEDTA，65℃孵育10min终止反应。在上述混合物的PCR管中加入1μl Oligo(dT)18和1μl dNTPMIX(10mM),65℃，预变性5min，然后立即置于冰上。然后依次加入4μl的5×逆转录酶buffer，0.5μl的RNase抑制剂和1μl逆转录酶，混匀后42℃保温1小时，合成第一链cDNA。然后70℃10min，终止反应。cDNA于-80℃冰箱保存。
3、从绿玉树的转录组数据库拼接unigene集中得到EtOSC6的cDNA序列信息，用下列的PCR反应体系就可获得EtOSC6。
PCR技术扩增蒲公英甾醇合酶基因EtOSC6，所使用引物对为：EtOSC6-F:5’-CTAAAG GGC GGC CGC ACT AGT ATG TGG AAG CTT GAG GTT GCA G-3’；
EtOSC6-R:5’-TGG CGA AGA ATT GTT AAT TAA TCA TAT ATT TTT TTT GTA TAAA-3’。
20μl PCR反应体系为：2μl cDNA模板，引物EtOSC6-F与EtOSC6-R各1μl，10μl 2×PrimerSTAR Max Premix(Takara公司)，ddH2O 6μl。
PCR反应条件：98℃预变性2min；循环程序为95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸5min。反应结束后取5μl反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，泳道M为DL5000Plus DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物，目的片段大小为2300bp左右。目的条带用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自北京艾德莱)回收。回收并纯化PCR产物，将其连接到pEASY-Blunt Simple载体(北京全式金)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，之后进行菌落PCR，反应结束后取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆，提取阳性克隆的质粒送至测序公司(北京擎科)测序。结果表明，该片段的长度为2277bp，其脱氧核糖核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例3、蒲公英甾醇合酶基因的应用
将实施例2中测序结果正确的蒲公英甾醇合酶基因克隆进酵母表达载体pESC-Ura，构成含有蒲公英甾醇合酶基因的酵母表达质粒pESC-Ura-EtOSC6。将重组质粒pESC-Ura-EtOSC6转入酿酒酵母，以酵母细胞的空载体(pESC-Ura)为对照组实验，挑取多个转基因酵母单菌落于5ml含20μg/ml麦角甾醇，13μg/ml氯化血红素和0.5％Tween 80的SD-Ura缺陷型培养基中，30℃250转/分钟培养24小时，取1ml用甘油保存菌种，获得以pESC-Ura-EtOSC6为载体，以酿酒酵母为宿主菌构建的产蒲公英甾醇工程菌。剩余菌液5000转离心收集，用双蒸水洗涤1次后，重悬于30ml含2％半乳糖的SD-Ura培养基中(重悬后OD600控制在0.4-0.6之间)，加入20μg/ml麦角甾醇，13μg/ml氯化血红素和0.5％Tween 80至培养基中，30℃诱导培养48小时。离心收集上述培养得到的菌体和菌液，上清培养基加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层有机相。菌体收集到2ml离心管中加入200ml直径为200μm的酸洗玻璃珠和1ml丙酮，用组织研磨仪研磨震荡(频率为30赫兹)30min后，离心收集上清。将上述乙酸乙酯相和丙酮用旋转蒸发仪蒸干后溶于200μL甲醇溶液，进行GC-MS检测。GC-MS检测结果如图4所示，含空载体pESC-Ura的对照中，没有蒲公英甾醇的生成，而转入含有蒲公英甾醇合酶基因EtOSC6的载体(pESC-Ura-EtOSC6)导致了蒲公英甾醇的生物合成。
本发明将蒲公英甾醇合酶基因构建到酵母工程菌中，利用酵母内源系统翻译此基因所编码的蛋白质，被命名为EtOSC6，EtOSC6蛋白质为如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，该蒲公英甾醇合酶蛋白能够以酵母本底的2,3-氧化鲨烯为底物，合成蒲公英甾醇，如图4所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献：
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序列表
<110> 上海大学
<120> 蒲公英甾醇合酶，编码蒲公英甾醇合酶的基因及其制备和应用
<130> GG20853652A
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2277
<212> DNA
<213> Euphorbia tirucalli
<400> 1
atgtggaagc ttgaggttgc agacggcagt gagaatccgt tgctatttac cactaataat 60
tttgtcggcc gacagatttg gaaattccat cctcatgttg gctctactgc cgaacttcaa 120
caaattcaaa ctgcaagaga aaatttctcc cgtaatcgtt ttcaagttaa agcaagtagt 180
gatcttttca agaattttca gcttatcaaa gaaaatcaaa ttgatctaag tacagcgggg 240
gttagattgg gagaagatga agaaataagt aatgaaacaa tggaaatagt agtaaggaaa 300
gctgtcagat tctgttcagc aatccaagca agtgatggtc attggccttc tgaattttca 360
ggacaattgt ttctactgcc tcctttgatt atatgtctct atattatggg aatgctcgac 420
acagatgcag ttttatccga tgaacataga aaagaaatgt tgcgctatat ttataatcat 480
caaaatgaag atgggggatg gggatttcat atagagagcc atagtacaat gttctgtaca 540
actcttaatt acatttcctt gcgtttgctt ggccaacaat taactgatga agaaggcgaa 600
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ggccccatta ccgatgtcat catacaatta agaaaagaac tctatactca accttatcat 900
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ttggcttatt gggcagaaga tccaactcaa gaagcactca aacttcacct cgctagaatt 1200
cccgattact tgtggattgc tgaagatggg atgaaaatgc agaacttggg cacccagctc 1260
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ggagatttga agaatacgtt gcggtataaa tcaaaagggg catggccttt ggctgatcga 1440
gatcaaggat ggcaagtctc tgactgcaca gctgaatcag taacggtttt aatgttactg 1500
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gtggattttc tacttccctt gcaaagcaaa aacggtggtt tttcggcttg ggagccagca 1620
tcttctcatc catggttgga gattttgaat cctactgaga tttttgctgt cgttatggtc 1680
gaaaatgagt atgtggagtg cacagcttcg atggttgaat gttttgtgct gtttaagact 1740
ctacatcctg aatataggaa ggaggatgta gaaattgcag tggctaaagc aactcgttac 1800
cttgaaaata cacaaaattc cgatggttct tggtatggga attggggaat ttgctatata 1860
tatggcacat tttttgcact aagaggattg gcttgtgttg gaaagacata taagaacagc 1920
agagtagtca gtaaagcttg tgattttctg ctctccaaac aactcacttc tggaggttgg 1980
ggagagagct atctctcttg ctcaaatttg aaatacacac cacttgaagg aaacaaatca 2040
aatctggtac aaactgcttg ggcaatgatg ggtcttattt atgcaggaca ggctgagagg 2100
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gcatatagaa acatatttcc actttgggct ctggctttat acaaaaaaaa tatatga 2277
<210> 2
<211> 758
<212> PRT
<213> Euphorbia tirucalli
<400> 2
Met Trp Lys Leu Glu Val Ala Asp Gly Ser Glu Asn Pro Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Asn Asn Phe Val Gly Arg Gln Ile Trp Lys Phe His Pro His
20 25 30
Val Gly Ser Thr Ala Glu Leu Gln Gln Ile Gln Thr Ala Arg Glu Asn
35 40 45
Phe Ser Arg Asn Arg Phe Gln Val Lys Ala Ser Ser Asp Leu Phe Lys
50 55 60
Asn Phe Gln Leu Ile Lys Glu Asn Gln Ile Asp Leu Ser Thr Ala Gly
65 70 75 80
Val Arg Leu Gly Glu Asp Glu Glu Ile Ser Asn Glu Thr Met Glu Ile
85 90 95
Val Val Arg Lys Ala Val Arg Phe Cys Ser Ala Ile Gln Ala Ser Asp
100 105 110
Gly His Trp Pro Ser Glu Phe Ser Gly Gln Leu Phe Leu Leu Pro Pro
115 120 125
Leu Ile Ile Cys Leu Tyr Ile Met Gly Met Leu Asp Thr Asp Ala Val
130 135 140
Leu Ser Asp Glu His Arg Lys Glu Met Leu Arg Tyr Ile Tyr Asn His
145 150 155 160
Gln Asn Glu Asp Gly Gly Trp Gly Phe His Ile Glu Ser His Ser Thr
165 170 175
Met Phe Cys Thr Thr Leu Asn Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Leu Gly Gln
180 185 190
Gln Leu Thr Asp Glu Glu Gly Glu Asp Asn Ala Leu Ser Lys Ala Gln
195 200 205
Asn Trp Ile Leu Asp His Gly Gly Val Ile His Ile Glu Thr Trp Gly
210 215 220
Lys Ile Tyr Leu Ser Val Leu Gly Val Tyr Glu Trp Ala Gly Cys Asn
225 230 235 240
Pro Val Pro Pro Glu Ile Val Leu Leu Pro Ser Phe Leu Pro Phe Ser
245 250 255
Ala Glu Lys Leu Trp Cys Tyr Phe Arg Thr Ile Tyr Asn Pro Ile Ala
260 265 270
Tyr Leu Tyr Gly Lys Lys Phe Val Gly Pro Ile Thr Asp Val Ile Ile
275 280 285
Gln Leu Arg Lys Glu Leu Tyr Thr Gln Pro Tyr His Gln Ile Asn Trp
290 295 300
Asn Gln Ala Arg His Ser Cys Phe Lys Glu Gly Val Tyr Val Ala Arg
305 310 315 320
Ser Leu Val Arg Asp Met Val Phe Asp Gly Ile Tyr His Val Gly Glu
325 330 335
Thr Ile Leu Lys Cys Trp Pro Phe Ser Lys Leu Arg Glu Lys Ala Leu
340 345 350
Gln Arg Leu Met Glu Ile Leu Arg Phe Glu Asp His His Ser Arg Phe
355 360 365
Leu Thr His Ala Cys Leu Glu Lys Ala Trp His Met Leu Ala Tyr Trp
370 375 380
Ala Glu Asp Pro Thr Gln Glu Ala Leu Lys Leu His Leu Ala Arg Ile
385 390 395 400
Pro Asp Tyr Leu Trp Ile Ala Glu Asp Gly Met Lys Met Gln Asn Leu
405 410 415
Gly Thr Gln Leu Trp Asp Ala Val Phe Tyr Ile Gln Ala Ile Ile Ala
420 425 430
Ser Asn Leu Ile Asp Glu Tyr Gly Ile Thr Leu Arg Arg Ala His Glu
435 440 445
Phe Ile Lys Gln Thr Gln Ile Arg Glu Asn Pro Pro Gly Asp Leu Lys
450 455 460
Asn Thr Leu Arg Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Trp Pro Leu Ala Asp Arg
465 470 475 480
Asp Gln Gly Trp Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ser Val Thr Val
485 490 495
Leu Met Leu Leu Ser Gln Met Gln Pro Glu Val Val Gly Asn Asn Val
500 505 510
Glu Pro Gln Arg Leu Tyr Asp Ala Val Asp Phe Leu Leu Pro Leu Gln
515 520 525
Ser Lys Asn Gly Gly Phe Ser Ala Trp Glu Pro Ala Ser Ser His Pro
530 535 540
Trp Leu Glu Ile Leu Asn Pro Thr Glu Ile Phe Ala Val Val Met Val
545 550 555 560
Glu Asn Glu Tyr Val Glu Cys Thr Ala Ser Met Val Glu Cys Phe Val
565 570 575
Leu Phe Lys Thr Leu His Pro Glu Tyr Arg Lys Glu Asp Val Glu Ile
580 585 590
Ala Val Ala Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Glu Asn Thr Gln Asn Ser Asp
595 600 605
Gly Ser Trp Tyr Gly Asn Trp Gly Ile Cys Tyr Ile Tyr Gly Thr Phe
610 615 620
Phe Ala Leu Arg Gly Leu Ala Cys Val Gly Lys Thr Tyr Lys Asn Ser
625 630 635 640
Arg Val Val Ser Lys Ala Cys Asp Phe Leu Leu Ser Lys Gln Leu Thr
645 650 655
Ser Gly Gly Trp Gly Glu Ser Tyr Leu Ser Cys Ser Asn Leu Lys Tyr
660 665 670
Thr Pro Leu Glu Gly Asn Lys Ser Asn Leu Val Gln Thr Ala Trp Ala
675 680 685
Met Met Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln Ala Glu Arg Asp Pro Lys Pro
690 695 700
Leu Gln Lys Ala Ala Arg Leu Leu Ile Asn Ser Gln Glu Lys Ser Gly
705 710 715 720
Glu Phe Pro Gln Gln Glu Ile Thr Gly Ala Phe Leu Gln Thr Cys Met
725 730 735
Leu His Tyr Ala Ala Tyr Arg Asn Ile Phe Pro Leu Trp Ala Leu Ala
740 745 750
Leu Tyr Lys Lys Asn Ile
755
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