一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用
阅读说明：本技术 一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用 (Lignan compound for promoting hair growth and preventing and treating alopecia and application thereof ) 是由 李吉 邓智利 周应军 于 2020-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用,涉及木脂素化合物领域,具体为一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用,包括以下步骤：S1、材料准备；S2、人毛囊的分离培养；S3、分离培养hDPC；S4、MTS分析；S5、总RNA分离、cDNA合成和实时PCR；S6、免疫印迹试验；S7、统计分析。在促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用中,发现了VB-1增强了人真皮乳头细胞中Wnt/β-catenin信号,并显著促进了hDPCs的增殖,VB-1显示出促进头发生长的作用,表明它可作为脱发的一种新的治疗方法。(The invention discloses a lignan compound for promoting hair growth and preventing and treating alopecia and application thereof, relates to the field of lignan compounds, and particularly relates to a lignan compound for promoting hair growth and preventing and treating alopecia and application thereof, wherein the lignan compound comprises the following steps: s1, preparing materials; s2, separating and culturing human hair follicles; s3, separating and culturing hDPC; s4, MTS analysis; s5, total RNA separation, cDNA synthesis and real-time PCR; s6, immunoblotting test; and S7, statistical analysis. In the lignan compound for promoting hair growth and preventing and treating alopecia and the application thereof, VB-1 is found to enhance Wnt/beta-catenin signals in human dermal papilla cells and remarkably promote the proliferation of hDPCs, and the VB-1 shows the effect of promoting hair growth, thereby indicating that the lignan compound can be used as a novel treatment method for alopecia.)
技术领域
本发明涉及木脂素化合物技术领域，具体为一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用。
背景技术
毛囊是由表皮和间充质(真皮)成分组成的一种复杂的微型器官，在整个成熟期经历退行期、休止期和生长期的循环。这种头发周期是基于毛囊干细胞(HFSCs)的能力，它们是缓慢循环的、仍保留标签的。毛囊干细胞位于一个被称为凸起的位置，短暂地退出静止状态以启动生长阶段。HFSCs的激活和分化主要由一组特殊的间充质细胞控制，这些细胞位于毛囊的底部，称为真皮乳头(DP)。随着毛囊生长期的启动，凸起中的干细胞被激活，以促进新毛囊的生长，以响应DP信号。
在出生后的头发周期中，真皮乳头细胞(DPCs)作为信号中心，控制周围上皮干细胞/祖细胞的增殖、迁移和分化，以完成头发再生过程。此外，DPCs通过与邻近的上皮干细胞相互作用，具有毛囊诱导能力。一些信号通路，特别是Wnt/β-catenin信号通路，已被证明在新毛囊的发育和毛发生长的启动中起着关键作用。在DPCs中表达的大量Wnt配体和抑制剂对于调节头发生长至关重要。在DP中β-catenin的缺失会过早诱导毛囊生长期和阻止毛囊的再生。
几种脱发疾病的特点是毛囊无法重新进入周期的再生阶段，特别是在雄激素性脱发的情况下，毛囊中雄激素受体信号的异位激活，主要是在DP中，改变了头发生长相关旁分泌因子(如DKK1、Wnts和TGF-β)的表达。这些旁分泌因子的失调会损害毛囊干/基质细胞的增殖和分化，导致生长期缩短，并导致进行性毛囊微型化，这是雄激素性脱发的主要特征。因此，DP被认为是雄激素性脱发的主要治疗靶点。目前雄激素性脱发的药理治疗主要集中在预防进一步脱发。然而，以激活HFSCs的增殖和重新启动头发周期的药物研发一直没有很好的结果。
天然化合物木脂素(VB-1)是一组广泛存在于植物体内的复杂多酚抗氧化剂。木脂素广泛应用于我国中草药中，且已被证明具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化和抗癌活性。临床研究表明，木脂素在癌症预防中具有潜在的作用。一些临床试验证实，木脂素也能抑制某些癌症的发展。例如，一些研究表明，卵巢癌和前列腺癌的低风险与高木脂素摄入量饮食有关。这可能是为什么地中海饮食(橄榄具有较高的木质素含量)与较低的癌症发病率有关。在体外培养的癌细胞中研究了木脂素的抗癌特性。在这些研究中，纯化的VB-l在细胞周期的G2/M期阻止癌细胞的增殖，并在一定浓度范围内有效地诱导细胞凋亡。虽然VB-1已被证明具有抗癌活性，但其药理作用尚不清楚。其药理价值值得进一步研究。
在这里，我们评估了VB-1对头发生长的影响。我们证明VB-1在一定浓度范围内以浓度依赖性的方式促进了hDPC的增殖。在所研究的头发生长相关基因中，DKKL在VB-1处理的hDPC(人真皮乳头细胞)中显著降低。通过免疫印迹分析，我们发现β-catenin的活性增加，AXIN2表达降低，提示VB-1在hDPCs中促进Wnt/β-catenin信号转导。另外，VB-1增强了DP标签基因在hDPC中的表达。此外，我们发现VB-1在器官培养试验中促进人毛囊的生长。综上所述，这些发现表明VB-1促进头发生长，可能是治疗脱发的一种新的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用，解决了上述背景技术中提出的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用，包括以下步骤：
S1、材料准备；
S2、人毛囊的分离培养；
S3、分离培养hDPC；
S4、MTS分析；
S5、总RNA分离、cDNA合成和实时PCR；
S6、免疫印迹试验；
S7、统计分析。
可选的，所述步骤S1、材料准备中，天然化合物木脂素-1。
可选的，所述步骤S2、人毛囊的分离培养中，包括以下步骤：
S201、从雄激素性脱发患者的头发移植手术中，分离非脱发部位的毛囊；
S202、用剪刀和镊子在光学显微镜下去除毛囊周围的脂肪组织，并在William’s E培养基中培养14天，辅以10mg/mL胰岛素、2mM的L-谷氨酰胺、10ng/ml氢化可的松和100U/mL链霉素，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
S203、毛囊用VB1在William’s E培养基中孵育，每隔48h，浸泡在37℃的PBS中拍照；
S204、在所有实验中，VB-1培养基每隔一天换一次新鲜培养基，从三个不同的志愿者中共分离出150个处于生长期毛囊，并用不同浓度的VB-1进行培养，实验重复5次，每个浓度组重复6次。
可选的，所述步骤S3、分离培养hDPC中，包括以下步骤：
S301、在Dulbecco改良的Eagle培养基中添加10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素，培养分离的hDPC；
S302、培养基每2天更换一次；
S303、细胞融合度到80-90％的时候，用0.25％(w/v)胰蛋白酶-EDTA收获hDPCs，以1：3的比例传代，此项研究中使用3-5代细胞。
可选的，所述步骤S4、MTS分析中，包括以下步骤：
S401、将细胞铺于96孔培养皿中，4h后，加入MTS工作液20ul/孔，摇匀混合；
S402、将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，在随后的12h、24h、48h和72h时间点记录OD490nm值。
可选的，所述步骤S7、统计分析中，包括以下步骤：所述步骤7、统计分析中，包括以下步骤：统计分析使用GraphPadPrism7.0软件，并使用t-test检验。
可选的，所述一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物在头发再生中的应用。
本发明提供了一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用，具备以下有益效果：
1、该促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用，通过细胞计数和连续细胞培养检测hDPCs的增殖情况；用RT-PCR方法检测lefl、wnt5a、bmp2、bmp4、alpl和vcan的表达；用RT-PCR或免疫印迹法检测dkkl、tgf-01、活性β-catenin和AXIN2的表达；在没有或存在VB-1的情况下测量发轴生长；结果，我们证明了VB-1在一定浓度范围内以浓度依赖性的方式显著促进hDPC的增殖；在所研究的头发生长相关基因中，在VB-1处理的hDPC中，dkkl明显下调；β-catenin的活性增加和AXIN2蛋白水平的降低表明VB-1在体外促进了hDPCs中的Wnt/β-catenin信号转导，在VB-1治疗后，DP标签基因的表达也被上调；通过体外毛囊器官培养实验，进一步证实了VB-1促进人毛囊的生长。
2、该促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用中，发现VB-1明显增强了人真皮乳头细胞中Wnt/β-catenin信号，并显著促进了hDPCs的增殖，VB-1显示出促进头发生长的作用，表明它可作为脱发的一种新的治疗方法。
附图说明
图1为本发明图1VB-1促进了hDPC的增殖示意图；
图2为本发明图2VB-1增加了hDPC的特征基因的表达示意图；
图3为本发明图3VB-1在hDPC中促进Wnt/β-catenin信号传递示意图；
图4为本发明图4VB-1促进培养毛囊中毛轴的伸长示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
请参阅图1至图4，本发明提供一种技术方案：一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物及其应用，包括以下步骤：
S1、材料准备；
S2、人毛囊的分离培养；
S3、分离培养hDPC；
S4、MTS分析；
S5、总RNA分离、cDNA合成和实时PCR；
S6、免疫印迹试验；
S7、统计分析。
本发明中，步骤S1、材料准备中，天然化合物木脂素-1(VB-1)。
本发明中，步骤S2、人毛囊的分离培养中，包括以下步骤：
S201、从雄激素性脱发患者的头发移植手术中，分离非脱发部位的毛囊；
S202、用剪刀和镊子在光学显微镜下去除毛囊周围的脂肪组织，并在William’s E培养基中培养14天，辅以10mg/mL胰岛素、2mM的L-谷氨酰胺、10ng/ml氢化可的松和100U/mL链霉素，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
S203、毛囊用VB1在William’s E培养基中孵育，每隔48h，浸泡在37℃的PBS中拍照；
S204、在所有实验中，VB-1培养基每隔一天换一次新鲜培养基，从三个不同的志愿者中共分离出150个处于生长期毛囊，并用不同浓度的VB-1进行培养，实验重复5次，每个浓度组重复6次。
本发明中，步骤S3、分离培养hDPC中，包括以下步骤：
S301、在Dulbecco改良的Eagle培养基中添加10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素，培养分离的hDPC；
S302、培养基每2天更换一次；
S303、细胞融合度到80-90％的时候，用0.25％(w/v)胰蛋白酶-EDTA收获hDPCs，以1：3的比例传代，此项研究中使用3-5代细胞。
本发明中，步骤S4、MTS分析中，包括以下步骤：
S401、将细胞铺于96孔培养皿中，4h后，加入MTS工作液20ul/孔，摇匀混合；
S402、将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，在随后的12h、24h、48h和72h时间点记录OD490nm值。
本发明中，步骤S7、统计分析中，包括以下步骤：统计分析使用GraphPadPrism7.0软件，并使用t-test检验，其中P<0.05被认为具有统计学差异，P<0.01具有显著差异。
本发明中，一种促进头发生长和防治脱发的木脂素化合物在头发再生中的应用。
结果
VB-1促进人真皮乳头细胞的增殖：
为了评估VB-1对培养的hDPCs的影响，我们首先检测了不同剂量VB-1(0、0.01、0.1、1和10μM)处理的细胞的增殖情况；在培养8天内，0.1μM的VB-1组扩增的hDPCs数量大于对照组(0μM)，在0.01和1μM时无显着性差异；然而，高浓度的VB-1(10μM)显著抑制hDPCs的增殖，并可能增加细胞的凋亡(图1，1A和1B)；这些结果被MTS法进一步证实了不同剂量VB-1处理的hDPCs(图1，1D)；有趣的是，我们还发现0.1μM VB-1参与了菌落生长(图1，1A)，表明hDPCs的头发诱导能力增加；同样，在添加0.1μM VB-1的培养基中，hDPC的每段培养日数低于其他组(图1，1C)；总的来说，这些在培养24h的hDPC中，VB-1对LEFL、wnt5a、bmp2、bmp4、alpl和vcan mRNA表达的剂量依赖性效应(0-10μM)；数据显示为各自基因表达与GAPDHmRNA表达的比值；实验以三项进行；数据报告为平均+SEM，用T-test检验；*表示p<0.05，**表示p<0.01；结果表明，VB-1促进了hDPCs的增殖，提高了这些细胞的毛诱导能力。
VB-1可改善hDPCs的毛发诱导特性：
以往的研究表明，DPCs在体外毛囊重建试验中起着不可或缺的作用；然而，DPC在培养过程中很快就失去了诱导头发的特性，极大地限制了它们在头发重组中的应用；为了确定VB-1是否影响hDPC的毛发诱导能力，我们用不同浓度的VB-1(0、0.01、0.1、1和10μM)处理了培养的hDPC；我们的结果表明，DP、LEF1和Wnt5a、ALL和VCAN的Wnt信号相关基因在0.1μM VB-1处理的hDPC中明显上调，而在其他组和VB-1还增加了bmp2和bmp4的表达，并增加了两个额外的标记；这些结果表明，VB-1可以促进hDPC的头发诱导能力。
VB-1激活HDPC中的Wnt/β-catenin信号：
为了确定VB-1在头发生长中的作用，我们研究了它对hDPC中头发生长相关基因表达的影响。我们发现，与对照组相比，dkk1在0.1μM VB-1治疗下显著下调，在10μM VB-1存在下上调(图3，3A)；然而，另一种头发生长相关基因tgf-β的表达无统计学意义(图3，3B)；免疫印迹分析，根据图3，VB-1在hDPC中促进Wnt/β-catenin信号传递，其中，(A)VB-1浓度依赖性效应(0-10μM)对培养24h的人DPCs dkl mRNA表达的影响；(B)VB-1浓度依赖性效应(0-10μM)对培养24h的hDPCs中tgf-p mRNA表达的影响；(C)用VB-1(0-10μM)处理24h的hDPCs中活性β-catenin表达的免疫印迹分析；(D)对活性β-catenin蛋白表达的定量分析；(E)用VB-1(0-10μM)处理的hDPC中AXIN2基因表达的实时PCR分析；(F)用VB-1(0-10μM)处理的hDPC中AXIN2表达的免疫印迹分析；(G)AXIN2蛋白表达的定量分析；数据为平均±SEM；用T-test检验，其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，“ns”表示无显着性差异。
结果表明，在0.1μM VB-1处理的hDPC中，活性β-catenin蛋白水平升高，而在高浓度VB-1处理的hDPC中则降低(图3，3C)；此外，Wnt/β-catenin信号的负调节因子axin2的mRNA水平在0.1μM VB-1处理的hDPC中降低；高浓度的VB-1(1和10μM)增加了axin2的表达(图3，3E)；免疫印迹分析证实VB-1对AXIN2的抑制作用呈剂量依赖性(图3，3F和3G)；这些结果表明，VB-1在一定浓度范围内以浓度依赖的方式诱导HDPCs中Wnt/β-catenin信号激活。
VB1促进培养的人类毛囊的毛干伸长：
由于DP对头发生长的调节至关重要，我们进一步探讨了VB-1对头发伸长的可能影响，分离的人头皮毛囊在不同剂量的VB-1存在下培养14天，附图4VB-1促进培养毛囊中毛轴的伸长中，(A)第0、2、4、6、8、10、12、14天头发的典型图片；(B)数据显示为用VB-1处理的毛囊的拉长长度；数据为平均±SEM；用T-test检验，其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
在没有或存在VB-1的情况下培养，结果我们发现0.1μM VB-1显著促进了培养的人毛囊中头发轴的伸长(图4,图4A和4B)。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。