Tak1抑制剂抑制pdl1的检测方法及其在制备抗pdl1药物中的应用
阅读说明：本技术 Tak1抑制剂抑制pdl1的检测方法及其在制备抗pdl1药物中的应用 (Detection method for PDL1 inhibited by TAK1 inhibitor and application of detection method in preparation of anti-PDL 1 drugs ) 是由 范义辉 毛仁芳 马盼盼 金鑫鑫 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法,包括如下步骤：(1)探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制：利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞,分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达；(2)检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平；(3)验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用：用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后,用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平。本发明采用的TAK1抑制剂是一种具有良好开发前景的潜在的抗肿瘤药物,在基因水平明显下调PDL1的表达,有望为临床上治疗乳腺癌提供可行性和理论依据。(The invention provides a detection method for inhibiting PDL1 by a TAK1 inhibitor, which comprises the following steps: (1) the expression regulation mechanism of PDL1 molecule in tumor cells is explored: treating tumor cells with a small molecule inhibitor, characterizing the expression of PDL1 by gene level and protein level, respectively; (2) detecting the level of phosphorylation of ERK in the tumor cell; (3) the inhibition effect of the TAK1 inhibitor on tumor cell PDL1 is verified: after treating tumor cells with the TAK1 inhibitor, the protein expression level of PDL1 in the cells was detected by immunofluorescence technique. The TAK1 inhibitor adopted by the invention is a potential anti-tumor drug with good development prospect, the expression of PDL1 is obviously reduced at the gene level, and the feasibility and theoretical basis are hopefully provided for clinically treating breast cancer.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法及其在制备抗PDL1药物中的应用。
背景技术
程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1, PD1）是一种广泛表达在T细胞表面的重要免疫抑制性分子，为免疫球蛋白超家族，是一个含有268个氨基酸残基的跨膜蛋白。PD-1主要抑制慢性炎症、感染或癌症中激活的T细胞活性，其有两个相关配体，即程序性死亡-配体1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）和程序性死亡-配体2（Programmed cell death 1 ligand 2，PD-L2）。一般地，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞能够高表达PD-L1或PD-L2，显著抑制T细胞的抗肿瘤活性，从而达到免疫逃逸的目的。其中，PD-1又称为表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或B7同源体（B7homolog 1，B7-H1），是由9号染色体上的CD274基因在干扰素调节因子1（IRF1）和信号转导激活转录1（STAT1）反应元件的控制下编码。研究发现，PD-L1是一种40kDa的跨膜蛋白，在多种恶性肿瘤中上调，并且通常在肿瘤细胞表面上表达。例如，在黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等组织中都有PD-L1蛋白的高表达。乳腺癌（breast cancer，BC)一直是肿瘤研究领域的热点之一，其死亡率在女性恶性肿瘤中位居首位。近几十年来，尽管乳腺癌的发病率一直在增加，但由于诊断和治疗技术的快速发展，其死亡率持续下降。临床上一般采用手术、化疗、靶向治疗等方法进行治疗，但由于肿瘤耐药问题的广泛存在，其临床治疗效果一直不理想。例如，在恶性程度较高的三阴性乳腺癌中，治疗手段相对缺乏，PD1单抗Pembrolizumab（MK-3475）是一种高选择性的人源化IgG4/k型抗PD1单克隆抗体，在针对复发/转移性三阴性乳腺癌的 KEYNOTE-12Ib期临床试验中，客观缓解率（ORR）为18.5%，但还是会出现不良反应，包括关节痛、乏力、恶心、肌痛等。
转化生长因子激酶1（TGF beta-Activated Kinase 1，TAK1）是丝裂源激活蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAP3K）家族成员之一。1995年，Yamaguchi等首次在酵母体内进行MAPK信号通路的遗传选择实验中被证实，是细胞内重要的信号分子。TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol（5Z7），是一种不可逆的ATP竞争性抑制剂，主要由真菌分泌提纯而成。有研究发现，小分子5Z-7抑制TAK1或基因沉默可大量诱导弥漫性大Ｂ细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞死亡。机制上，抑制TAK1可显著降低核因子κB（NF-κB）活性，并且发现TAK1的抑制通过抑制慢性NF-κB信号来促进DLBCL细胞的死亡。
乳腺癌是一种异质性疾病，目前确定的危险因素还无法完全阐述其发病机理。随着信号通路、细胞凋亡等分子生物学方法在肿瘤研究中的应用，乳腺癌分子靶点和靶向治疗逐渐成为抗乳腺癌研究的趋势和热点。鉴于传统治疗方法的局限性，免疫疗法以其高特异性和记忆性，对改善肿瘤患者的生存率和预后情况具有潜在作用。免疫检查点是阻碍机体免疫细胞抗肿瘤的主要原因，也是发生免疫逃逸的罪魁祸首。目前针对免疫检查点，主要是采用单克隆抗体抑制剂的方法来提高抗肿瘤的效果。PDL1和PDL2是目前肿瘤免疫治疗，特别是免疫检查点阻断疗法的核心靶点。抑制PD-L1和PD-L2功能，可以激活T细胞的抗肿瘤免疫，杀伤肿瘤细胞。TAK1抑制剂的抗肿瘤作用已在多种肿瘤治疗中得到广泛开展，本发明旨在研究TAK1抑制剂在制备抗PD-L1药物中的应用，为TAK1抑制剂的临床实践提供更多的理论依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法及其在制备抗PDL1药物中的应用，为TAK1抑制剂的临床实践提供更多的理论依据。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法，包括如下步骤：
（1）探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制：利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞，分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达；
（2）检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平；
（3）验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用：用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后，用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平。
其中，步骤（1）中，小分子抑制剂为TAK1抑制剂5Z7，处理浓度为0、1和3 μM。
其中，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231。
其中，步骤（1）中采用Western Blot方法和实时定量PCR方法检测PDL1蛋白水平和基因水平的表达。
其中，步骤（1）的具体步骤包括：
（1-1）复苏细胞：从-80℃中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，摇动令其尽快融化（慢冻速溶）；从37℃水浴中取出冻存管，加入1mL的完全培养基，混匀；1000rpm离心3min，弃去上清液；加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，均匀接种于60mm的培养皿中，5%CO2，37℃培养箱静置培养；次日更换一次培养液，继续培养；待细胞密度达到90%时，胰酶消化细胞，根据后续实验确定铺孔的数目（6孔板），继续培养；
（1-2）TAK1抑制剂5Z7的处理：选择处理的浓度依次为0、1和3μM，加药处理时间为24h；
（1-3）蛋白质免疫印迹
（1-3-1）蛋白样品的制备：配制裂解缓冲液（含10μL PMSF与990 μL Lysisbuffer）置于冰浴中备用；细胞经预冷PBS清洗后转移至灭菌离心管，离心后弃去上清；用含有PMSF的裂解液重悬细胞，冰浴上裂解30min（摇床）；4℃，高速离心15min后完全吸取上清（蛋白）；蛋白与5×Loading buffer混匀后，按4：1的比例吸取，95℃金属浴煮沸5min，置于-20℃储存；
（1-3-2）电泳跑胶及转膜显色：将蛋白样品105℃再次煮沸5 min；按照蛋白胶的配方配制10%的分离胶，上层配制5%的浓缩胶，各孔加入10μL蛋白样品；调节电泳仪电压至80V，当溴酚蓝指示剂到达下层分离胶时再次调节电泳仪电压至120V；依据标准蛋白marker将待考察的样品区域胶割下；PVDF膜剪成与割离的蛋白胶相同大小，置于转膜buffer中平衡3 min；
按照如下叠放顺序：电源正极-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-电源负极，300mA湿转1h；PVDF膜置于5%脱脂奶粉中，封闭2h；TBST漂洗PVDF膜3min，加入牛奶或一抗稀释液稀释的一抗（1：1000），4℃孵育过夜；次日TBST漂洗5 min*3，加入适量的二抗（1：2000），室温孵育2h；最后TBST漂洗10min*3，使用ECL试剂显色；
（1-4）实时定量PCR
（1-4-1）细胞总RNA提取：利用Trizol法从上述处理的细胞中提取总RNA，具体如下：细胞弃去培养液，利用PBS清洗一次，加入胰酶消化细胞并收集在无RNA酶的EP管中；加入1mL RNA isolater（诺唯赞R401-01），室温放置5min；加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min；12000r，4℃离心15min，分为三层，小心吸取上层至一个新的无RNA酶的EP管中，加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置2h（增加沉淀）；12000r，4℃离心10min，管底有白色沉淀；弃上清，加入1mL预冷的75%乙醇（DEPC水配制），7500r，4℃离心5min，尽可能的弃去上清；在通风橱中干燥沉淀10-30min，加入30μL的DEPC水溶解RNA，65℃水浴加热5min，测浓度后放置于-80℃保存；
（1-4-2）cDNA的合成及qPCR检测：把上面测量后RNA按照HiScript® II Q RTSuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（诺唯赞R223-01）的说明书逆转合成cDNA，具体如下：
①基因组去除：在RNase-free的离心管中配制如下混合液，模板RNA 1µg；4×gDNAwiper Mix，4µL；RNase-free ddH2O补足至16μL，用移液器轻轻吹打混匀，42℃ 2min；
②配制逆转录反应体系：在第①步的反应管中直接加入4µL的5 × HiScript IIqRT SuperMix II；
③进行逆转录反应：50℃ 15min，85℃ 5s，产物加水稀释8倍，置于-20℃保存，随后利用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix（诺唯赞Q111-02）试剂盒检测PDL1和PDL2的基因表达水平。
进一步，步骤（1-4）通过基因转录水平进行检测，分别设计了PDL1和PDL2的RT-PCR引物，分别在SUM159和MDA-MB-231细胞中验证；引物分别为：
PDL1-RT-F：GTAGCACTGACATTCATCTTC；
PDL1-RT-R：TTCCTTCCTCTTGTCACGCTC；
PDL2-RT-F：CATAGCCACAGTGATAGCCCT；
PDL2-RT-R： GGCTCCCAAGACCACAGGTTC。其中，步骤（3）中免疫荧光实验的具体方法如下：
让肿瘤细胞生长在放入24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上，接种密度达到60%，加药处理细胞24h；每孔用500μL的PBS洗细胞3次，每次5min；之后每孔加200ul 4% 多聚甲醛，室温固定15min；去除多聚甲醛，每孔用500μL PBS洗细胞3次，每次5min；每孔加入500μL的1%BSA，室温封闭2h；去除封闭液，每孔加200μL一抗（BSA稀释），4℃过夜；去除抗体，每孔用500 μLPBS洗细胞3次，每次5min；每孔加200μL荧光二抗，室温孵育2h；去除二抗，每孔用500PBS洗细胞3次，每次5min；每孔加入Hochest（1:200PBS稀释），室温10min，500μL PBS洗细胞3次，每次5min；载玻片上滴一小滴抗褪色剂，将盖玻片从孔中取出，面朝下盖到抗褪色剂上，使其轻轻接触到载玻片上（小心气泡）；将玻片置于暗处5min使其晾干，此时即可在荧光显微镜下进行观察。
本发明还提供一种TAK1抑制剂在制备抗PDL1药物中的应用。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的研究发现，在乳腺癌细胞SUM159和MDA-MB-231中，TAK1抑制剂5Z7能够显著下调PD-L1的蛋白水平，并且在转移能力较强的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，其抑制能力高于SUM159细胞。TAK1还可以通过磷酸化的方式激活MAPKKs，从而导致MAPKs的激活（ERK)。磷酸化修饰被认为是TAK1依赖的信号转导过程中重要调节机制，5Z7在蛋白水平降低了磷酸化ERK。本发明采用的TAK1抑制剂是一种具有良好开发前景的潜在的抗肿瘤药物，在基因水平明显下调PDL1的表达，有望为临床上治疗乳腺癌提供可行性和理论依据。
附图说明
图1为本发明中TAK1抑制剂处理SUM159和MDA-MB-231细胞后WB检测PDL1的表达图；
图2为本发明中TAK1抑制剂处理SUM159和MDA-MB-231细胞后RT-PCR检测PDL1的表达图；
图3为本发明中TAK1抑制剂处理SUM159和MDA-MB-231细胞后WB检测p-ERK的表达图；
图4为本发明中不同浓度的TAK1抑制剂处理SUM159细胞后免疫荧光检测PD-L1的表达图；
图5为本发明中不同浓度的TAK1抑制剂处理MDA-MB-231细胞后免疫荧光检测PD-L1的表达图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供一种TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法，包括如下步骤：
（1）探究肿瘤细胞中PDL1分子的表达调控机制：利用小分子抑制剂处理肿瘤细胞，分别通过基因水平和蛋白水平来表征PDL1的表达；
（2）检测肿瘤细胞中ERK的磷酸化水平；
（3）验证TAK1抑制剂对肿瘤细胞PDL1的抑制作用：用TAK1抑制剂处理肿瘤细胞后，用免疫荧光技术检测细胞中PDL1的蛋白表达水平。
本发明还提供一种TAK1抑制剂在制备抗PDL1药物中的应用。
下面结合具体实施例详细阐述本发明的技术方案。
为了获得抑制PD-L1的新方法，检测了不同小分子抑制剂抑制肿瘤细胞中PD-L1的表达情况，TAK1抑制剂5Z7处理乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231，PD-L1和PD-L2的表达显著下降。TAK1抑制剂5Z7处理乳腺癌细胞系SUM159和MDA-MB-231。实验中，选择5Z7处理浓度分别为0、1和3μM，通过Western Blot方法和实时定量PCR（RTPCR）方法检测PDL1蛋白水平和基因水平的表达。具体实验步骤包括：
（1-1）复苏细胞：从-80℃中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，摇动令其尽快融化（慢冻速溶）；从37℃水浴中取出冻存管，加入1mL的完全培养基，混匀；1000rpm离心3min，弃去上清液；加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，均匀接种于60mm的培养皿中，5%CO2，37℃培养箱静置培养；次日更换一次培养液，继续培养；待细胞密度达到90%时，胰酶消化细胞，根据后续实验确定铺孔的数目（6孔板），继续培养。
（1-2）TAK1抑制剂5Z7的处理：选择处理的浓度依次为0、1和3μM，加药处理时间为24 h。
（1-3）蛋白质免疫印迹
（1-3-1）蛋白样品的制备：配制裂解缓冲液（含10μL PMSF与990μL Lysis buffer）置于冰浴中备用；细胞经预冷PBS清洗后转移至灭菌离心管，离心后弃去上清；用含有PMSF的裂解液重悬细胞，冰浴上裂解30min（摇床）；4℃，高速离心15min后完全吸取上清（蛋白）；蛋白与5×Loading buffer混匀后，按4：1的比例吸取，95℃金属浴煮沸5min，置于-20℃储存。
（1-3-2）电泳跑胶及转膜显色：将蛋白样品105℃再次煮沸5min；按照蛋白胶的配方配制10%的分离胶，上层配制5%的浓缩胶，各孔加入10μL蛋白样品；调节电泳仪电压至80V，当溴酚蓝指示剂到达下层分离胶时再次调节电泳仪电压至120V；依据标准蛋白marker将待考察的样品区域胶割下；PVDF膜剪成与割离的蛋白胶相同大小，置于转膜buffer中平衡3min。
按照如下叠放顺序：电源正极-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-电源负极，300mA湿转1h；PVDF膜置于5%脱脂奶粉中，封闭2h；TBST漂洗PVDF膜3min，加入牛奶或一抗稀释液稀释的一抗（1：1000），4℃孵育过夜；次日TBST漂洗5 min*3，加入适量的二抗（1：2000），室温孵育2h；最后TBST漂洗10min*3，使用ECL试剂显色。
（1-4）实时定量PCR：通过基因转录水平进行检测，分别设计了PDL1和PDL2的RT-PCR引物，分别在SUM159和MDA-MB-231细胞中验证；引物分别为：
PDL1-RT-F：GTAGCACTGACATTCATCTTC；
PDL1-RT-R：TTCCTTCCTCTTGTCACGCTC；
PDL2-RT-F：CATAGCCACAGTGATAGCCCT；
PDL2-RT-R： GGCTCCCAAGACCACAGGTTC。（1-4-1）细胞总RNA提取：利用Trizol法从上述处理的细胞中提取总RNA，具体如下：细胞弃去培养液，利用PBS清洗一次，加入胰酶消化细胞并收集在无RNA酶的EP管中；加入1mL RNA isolater（诺唯赞R401-01），室温放置5min；加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min；12000r，4℃离心15min，分为三层，小心吸取上层至一个新的无RNA酶的EP管中，加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃静置2h（增加沉淀）；12000r，4℃离心10min，管底有白色沉淀；弃上清，加入1mL预冷的75%乙醇（DEPC水配制），7500r，4℃离心5min，尽可能的弃去上清；在通风橱中干燥沉淀10-30min，加入30μL的DEPC水溶解RNA，65℃水浴加热5min，测浓度后放置于-80℃保存。
（1-4-2）cDNA的合成及qPCR检测：把上面测量后RNA按照HiScript® II Q RTSuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（诺唯赞R223-01）的说明书逆转合成cDNA，具体如下：
①基因组去除：在RNase-free的离心管中配制如下混合液，模板RNA 1µg；4×gDNAwiper Mix，4µL；RNase-free ddH2O补足至16μL，用移液器轻轻吹打混匀，42℃ 2min；
②配制逆转录反应体系：在第①步的反应管中直接加入4µL的5 × HiScript IIqRT SuperMix II；
③进行逆转录反应：50℃ 15min，85℃ 5s，产物加水稀释8倍，置于-20℃保存，随后利用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix（诺唯赞Q111-02）试剂盒检测PDL1和PDL2的基因表达水平。
蛋白水平检测结果如图1所示，结果分析表明在SUM159和MDA-MB-231细胞中，TAK1抑制剂5Z7能够显著抑制PDL1蛋白的表达。同理，mRNA水平检测结果如图2所示，结果分析表明在SUM159和MDA-MB-231细胞中，TAK1抑制剂5Z7能够显著抑制pdl1基因的转录。
前期结果表明，SUM159和MDA-MB-231细胞中PD-L1和PD-L2的表达，依赖肿瘤细胞中ERK的激活。此外，在两种细胞中，TAK1抑制剂5Z7处理前后检测了ERK的磷酸化水平，结果如图3所示，结果分析表明在SUM159和MDA-MB-231细胞中，TAK1抑制剂5Z7能够显著抑制ERK的磷酸化水平。
为了进一步验证TAK2抑制剂5Z7对肿瘤细胞PD-L1的抑制作用，又用免疫荧光技术检测细胞中PD-L1的蛋白表达水平。接着，利用免疫荧光技术在SUM159和MDA-MB-231细胞中检测PDL1的表达水平，实验中，，选择5Z7处理浓度分别为0、3和5μM。SUM159细胞的检测结果如图4所示，结果分析TAK1抑制剂5Z7处理SUM159细胞以后，免疫荧光强度明显减弱，这表明PDL1蛋白水平显著下调。类似的实验结果在MDA-MB-231细胞中也得到证实，试验结果如图5所示。
上述的免疫荧光实验的具体方法如下：
让肿瘤细胞生长在放入24孔细胞培养板中的圆形盖玻片上，接种密度达到60%，加药处理细胞24h。每孔用500μL的PBS洗细胞3次，每次5min；之后每孔加200ul 4% 多聚甲醛，室温固定15min；去除多聚甲醛，每孔用500μL PBS洗细胞3次，每次5min；每孔加入500μL的1%BSA，室温封闭2h；去除封闭液，每孔加200μL一抗（BSA稀释），4℃过夜；去除抗体，每孔用500 μLPBS洗细胞3次，每次5min；每孔加200μL荧光二抗，室温孵育2h；去除二抗，每孔用500PBS洗细胞3次，每次5min；每孔加入Hochest（1:200PBS稀释），室温10min，500μL PBS洗细胞3次，每次5min；载玻片上滴一小滴抗褪色剂，将盖玻片从孔中取出，面朝下盖到抗褪色剂上，使其轻轻接触到载玻片上（小心气泡）；将玻片置于暗处5min使其晾干，此时即可在荧光显微镜下进行观察。
综上，TAK1抑制剂5Z7在乳腺癌细胞中（主要是SUM159和MDA-MB-231）能够显著抑制PDL1基因和蛋白两个水平的表达，并且可能是通过减弱ERK的磷酸化水平的方式来降低PDL1基因的转录，从而抑制了PDL1在肿瘤细胞中的表达。因此，TAK1抑制剂5Z7可以增强T细胞在乳腺癌中的免疫治疗效果，可以作为未来的一个治疗靶点，本发明的结论可以为乳腺癌的治疗提供必要的指导意义。
抑制肿瘤细胞中PD-L1的功能，可以激活T细胞的抗肿瘤免疫。在临床上，部分病人对抗PD-L1治疗具有较好的反应。目前抗PD-L1主要通过抗体来实现。本发明发现了小分子抑制剂可以抑制肿瘤细胞中的PD-L1表达，从而可以获得抗PD-L1相似的作用。TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol是一种具有良好开发前景的潜在的抗肿瘤药物，在多种肿瘤治疗中备受关注。本发明发明，在乳腺癌细胞SUM159和MDA-MB-231中，5Z7明显抑制了PDL1的表达。因此，TAK1抑制剂可以抑制肿瘤细胞的PD-L1表达，激活T细胞的抗肿瘤免疫。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> TAK1抑制剂抑制PDL1的检测方法及其在制备抗PDL1药物中的应用
<141> 2020-12-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
Gly Thr Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala
1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys
20
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