一种月季灰霉病菌生理小种的鉴定方法
阅读说明：本技术 一种月季灰霉病菌生理小种的鉴定方法 (Identification method of physiological races of gray mold of Chinese rose ) 是由 邱显钦 张颢 晏慧君 蹇洪英 陈敏 唐开学 王其刚 张婷 于 2020-11-28 设计创作，主要内容包括：一种月季灰霉病菌生理小种的鉴定方法,该方法包括灰霉病菌的分离纯化和扩繁,月季灰霉病菌孢子悬浮液制备,6份鉴定寄主材料,离体花瓣鉴定,以及花瓣病情等级划分。该方法仅用6份鉴定寄主材料,即可高效准确地在我国各地鉴定出月季灰霉病菌生理小种,节约成本、省工省时。(A method for identifying physiological races of gray mold of China rose comprises the steps of separation, purification and propagation of gray mold, preparation of gray mold spore suspension of China rose, 6 portions of identification host materials, in-vitro petal identification and petal disease grading. The method can efficiently and accurately identify the physiological races of gray mold of China in each place by only using 6 parts of identification host materials, thereby saving cost, labor and time.)
技术领域
本发明属木本花卉抗病育种技术领域，具体涉及月季灰霉病菌生理小种的鉴定方法。
背景技术
月季(Rosa hybrida)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa L.)植物，是目前世界上占比最大的鲜切花种类。我国切花月季的主产区集中在云南省昆明市及滇中地区。
月季灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一种真菌病害，是切花月季运输过程中最为严重的真菌病害。它不仅感染茎和叶，对花朵的危害最为严重。目前，生产中主要通过反复施用化学药剂来预防和控制月季灰霉病的发生，这样不仅增加了生产成本，还造成了对环境的污染和破坏，同时还严重降低了其观赏价值。
为了减轻月季生产商和经销商的经济损失和减少农药施用引起的环境污染，国内外研究者都在进行月季抗灰霉病品种的选育科研工作。然而，由于月季灰霉病菌生理小种较多，且存在变种等情况，因此目前国内外尚没有出现具有长效且广谱抗灰霉病菌的现代月季品种。
选育月季抗灰霉病品种的前提，就是要了解当地灰霉病菌的生理小种情况。迄今为止，国内外尚未有月季灰霉病菌生理小种的研究报道。目前，国内外对于其他植物灰霉病菌的生理小种的传统鉴定方法主要是：将不同地理来源的单孢病菌分别接种到鉴别寄主植物上，经过一定发病周期，结合观察和评价寄主花瓣的发病情况，以此鉴别出不同的生理小种。
一方面，因为月季灰霉病菌生理小种的划分具有明显的地域性和特异性，所以鉴别寄主植物材料最好选用鉴定地区本土的材料(同一个属但不同种/品种)；另一方面，如果采用国外的鉴别寄主植物材料，那么将涉及到寄主植物的专利费用、引种、驯化、繁殖等步骤和过程，这些程序使得生理小种鉴定工作不仅费时费力费资，而且因为不同地理环境分布不同的生理小种，所以国外的专利品种不一定适合国内的鉴定工作，因此很可能会影响后续鉴定工作的准确性。目前，国内外尚未有月季灰霉病菌生理小种鉴定的相关报道，所以适用于国内进行月季灰霉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系和方法尚未确定。
准确预测月季灰霉病菌的种类，及时检测其生理小种的分化演替，对于防治月季灰霉病、引进抗病材料和选育抗病新品种具有重要意义。鉴于我们国内尚缺乏一套适合国内各个地区用于对月季灰霉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系，且传统的抗性鉴定方法中所采用的寄主发病情况统计法，存在耗时费力、鉴定周期较长等技术问题，所以，探索出一套鉴别准确和筛选快速，且适用于国内月季灰霉病菌生理小种鉴定的鉴别寄主体系和方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够适用于中国的月季灰霉病菌生理小种的鉴定方法，同时具有操作简单、鉴定准确、筛选快速的特点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种月季灰霉病菌生理小种的鉴定方法，其特征在于：分别将采自于不同采集地点的感染了灰霉病菌的月季花瓣上的灰霉病菌进行分离纯化和扩繁，一个采集地点的灰霉病菌材料为一个样本，分别制备成月季灰霉病菌孢子悬浮液；采集鉴定寄主材料上无病虫害的花瓣，先用解剖镜镜检无真菌菌落或菌丝后，再用70％v/v乙醇和无菌水清洗，用无菌的滤纸吸干花瓣表面的水分后，将花瓣铺在盛有营养基质的培养皿中，每一种鉴定寄主材料的花瓣放置在一个培养皿内；每一种月季灰霉病菌孢子悬浮液分别接种在各培养皿内的花瓣上培养，按接种花瓣病情等级鉴定月季灰霉病菌生理小种，所述接种花瓣病情等级划分为2个等级：0级：抗病，花瓣无病斑或<20％花瓣面积发病；1级：感病，≥20％花瓣面积发病。
进一步，所述灰霉病菌进行分离纯化和扩繁过程如下：
①在超净工作台上，用已灭菌的解剖针从采自于不同地点的感染了灰霉病菌的月季花瓣上，分别蘸取灰霉病菌转移到组培瓶内的月季组培苗的花瓣上，每蘸取一份灰霉病菌材料，须更换新的已灭菌的解剖针，保证不同采集地点的灰霉病菌不混合，且来自于月季野生种的灰霉病菌转移到粉蕾木香(Rosa pseudobanksiae)组培苗的花瓣上，来自于月季栽培品种的灰霉病菌转移到‘云玫’(Rosa‘Yunmei’)组培苗的花瓣上；一个灰霉病菌材料样本接种于一个组培瓶内的月季组培苗的花瓣上，然后将接种了灰霉病菌的组培瓶在组培室内，在培养条件为：光照强度为1800～3200lx，光周期为10-16h光期、8-14h暗期，室内空气相对湿度80～95％，室温22～28℃的条件下培养3～7d；
②用步骤①同样的方法转移上述组培苗上的灰霉病菌单菌落到相应的新的月季组培苗的花瓣上，在步骤①同样的培养条件下培养3～7d；
③重复步骤②3次；
④重复步骤②1次，但培养时间为10～15d；
步骤①至步骤④培养期间，组培瓶内的培养基质均为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.0g/L，且组培瓶瓶口用透气性塑料膜封盖。
进一步，所述制备成月季灰霉病菌孢子悬浮液的过程如下：
用已灭菌的毛刷将经进行分离纯化和扩繁的灰霉病菌刷到含有0.03％v/v吐温20的无菌蒸馏水中，每刷一份月季灰霉病菌，须更换新的已灭菌的毛刷，不同采集地点的月季灰霉病菌刷入不同容器内盛有含有0.03％v/v吐温20的无菌蒸馏水中，保证不同采集地点的月季灰霉病菌不混合；将每个容器内的月季灰霉病菌孢子浓度用含有0.03％v/v吐温20的无菌蒸馏水调至1×104～5×104个/ml，即得月季灰霉病菌孢子悬浮液。
进一步，所述鉴定寄主材料为：‘桃之夭夭’(Rosa‘Taozhiyaoyao’)、‘月月粉’(Rosa chinensis‘Pallida’)、‘金粉莲’(Rosa‘Jinfenlian’)、‘星语星愿’(Rosa‘Xingyuxingyuan’)、‘映日荷花’(Rosa‘Yingrihehua’)和‘思春’(Rosa‘Sichun’)。
进一步，所述采集鉴定寄主材料上无病虫害的花瓣是采集鉴定寄主材料上花朵从内到外第1～2层的无病虫害的花瓣。
进一步，所述再用70％v/v乙醇和无菌水清洗过程如下：将所述花瓣用70％v/v乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～5次；所述将花瓣铺在盛有营养基质的培养皿中是将花瓣正面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L。
进一步，所述每一种月季灰霉病菌孢子悬浮液分别接种在各培养皿内的花瓣上培养是：采用喷雾法或滴液法将月季灰霉病菌孢子悬浮液接种到所述培养皿内的每片花瓣上，保证肉眼可见每片花瓣被灰霉病菌孢子悬浮液覆盖；接种完成后，将培养皿在室内光强1800-3200lx、光周期为10-16h光期、8-14h暗期，室内空气相对湿度85～95％、室温22-28℃的条件下培养5～7d。
进一步，每个样本设置3～5个重复。
进一步，采用SAS V9.0软件对接种花瓣病情等级划分数据进行ANOVA分析；花瓣病斑面积最终数据为：总病斑面积/总花瓣面积×100％±标准误差。
进一步，所述鉴定月季灰霉病菌生理小种是将接种花瓣病情等级的0级用0表示，接种花瓣病情等级的1级用1表示，一一对应地将不同鉴定寄主材料与不同采集地点来源的月季灰霉病菌之间的抗/感性结果列表，并与如下表1月季灰霉病菌生理小种类型对照表进行比对，鉴定出月季灰霉病菌生理小种的类型；
表1月季灰霉病菌生理小种类型对照表
表1中0：抗病；1：感病；
A型月季灰霉病菌生理小种表示：所述的6份鉴定寄主材料与A型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病；即统计结果为0。
B型月季灰霉病菌生理小种表示：所述的6份鉴定寄主材料中只有‘思春’1份鉴定寄主材料与B型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为感病，即统计结果为1；其余5份鉴定寄主材料与B型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
C型月季灰霉病菌生理小种表示：所述的6份鉴定寄主材料中有‘思春’和‘映日荷花’2份鉴定寄主材料与C型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1；其余4份鉴定寄主材料与C型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
D型月季灰霉病菌生理小种表示：所述的6份鉴定寄主材料中有‘思春’、‘映日荷花’和‘星语星愿’3份鉴定寄主材料与D型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1；其余3份鉴定寄主材料与D型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
E型月季灰霉病菌生理小种表示：所述的6份鉴定寄主材料中有‘思春’、‘映日荷花’、‘星语星愿’和‘金粉莲’4份鉴定寄主材料与E型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1；其余2份鉴定寄主材料与E型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为抗病，即统计结果为0。
F型月季灰霉病菌生理小种表示：所述的6份鉴定寄主材料中只有‘桃之夭夭’寄主材料与F型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果为抗病，即统计结果为0；其余5份鉴定寄主材料与F型月季灰霉病菌生理小种之间的抗/感鉴定结果均为感病，即统计结果为1。
与现有技术相比，本发明的主要创新点和有益效果是：
1.通过大量的实验，本发明从所收集的873份蔷薇属植物中，筛选出6份寄主材料，作为本发明的鉴定寄主材料，仅用这6份鉴定寄主材料，即可高效准确地在我国各地鉴定出月季灰霉病菌生理小种，节约成本、省工省时，是一套适用于我国各地进行月季灰霉病菌生理小种鉴定的鉴定寄主材料和鉴定方法。
2.这些鉴定寄主材料均来源于国内，不仅完全具有自主知识产权，且在全国范围内栽培和繁殖均具有适应性，同时具有较强的鉴别能力。这为国内研究者在当地进行月季灰霉病菌生理小种鉴定工作提供了可操作的寄主材料，同时为抗月季灰霉病育种材料的选择提供了指导。
3.采用离体花瓣接种的方法鉴定月季灰霉病，即将月季灰霉病菌接种在鉴定寄主材料离体的花瓣上，本发明研究发现灰霉病菌侵染寄主组织主要是月季花瓣，故采用离体花瓣接种更为科学，结果更准确可靠。并且确定了花瓣无病斑或<20％花瓣面积发病设置为0级，用0表示，花瓣病斑≥20％花瓣面积发病设置为1级，用1表示；将0和1输入到月季灰霉病菌生理小种类型对照表中进行比对，即可明确生理小种的类型。如若不是以20％花瓣发病面积作为月季离体花瓣灰霉病发病的等级划分，将无法区分出不同的生理小种。
4.鉴定时间短，从灰霉病菌悬浮液接种鉴定寄主材料花瓣到完成生理小种鉴定工作仅需要5～7d时间，而传统方法需要14d以上(传统方法是对整个植株或者叶片进行接种鉴定，前期工作就会用大量时间进行植株的扩繁等工作)。
5.本发明采用的鉴定寄主植物材料均为四季开花的栽培品种，这样能保证每个季节均可进行月季灰霉病菌生理小种的鉴定工作；再者，本发明采用的是鉴定寄主材料的离体花瓣，因为花瓣是灰霉病最大的寄主植物组织，而传统方法为扦插苗，故本方法不仅占用空间少，且操作简便结果准确可靠；本发明在相对封闭的培养皿中进行灰霉病菌侵染寄主实验，可排除不同的生理小种菌类型通过空气而混合的可能性，从而保证了实验结果的准确性。
本发明涉及的上述生物材料均可以从商业渠道购买。如可从云南丽都花卉发展有限公司购买，该公司地址：云南省玉溪市通海县四街镇，邮政编码：652702。
同时，本发明涉及的上述生物材料均在表8所列非专利文献公开，申请人在基地均有活体所述生物材料保存，申请人保证自本专利申请日起20年内向公众发放。申请人联系地址:云南省昆明市盘龙区北京路2238号，云南省农业科学院花卉研究所，邮编：650205。
具体实施方式
以下实施例无特殊说明的为常规方法。所涉及的试剂等材料均为市售。
实施例1我国国内月季灰霉病菌生理小种的鉴定
由于云南省是我国月季野生资源的分布中心及月季品种的栽培中心，也是我国月季灰霉病的主要发生地。所以，本实施案例以云南省为主，并涵盖国内其他6个省份，合计12个不同地区为采集地点。
(1)月季灰霉病菌的分离纯化和扩繁
①在超净工作台上，用已灭菌的解剖针(灭菌方法：120℃高温灭菌20分钟)从采自于如下国内12个不同地点的感染了灰霉病菌的月季花瓣上，分别蘸取灰霉病菌转移到按常规植物组织培养方法培养的组培瓶内的月季组培苗的花瓣上，每蘸取一份灰霉病菌材料，须更换新的已灭菌的解剖针，保证不同采集地点的灰霉病菌不混合，且来自于月季野生种的灰霉病菌转移到粉蕾木香(Rosa pseudobanksiae)组培苗的花瓣上，来自于月季栽培品种的灰霉病菌转移到‘云玫’(Rosa‘Yunmei’)组培苗的花瓣上；一个采集地点的灰霉病菌材料为一个样本，一个样本接种于一个组培瓶内的月季组培苗的花瓣上，然后将接种了灰霉病菌的组培瓶在组培室内，培养条件为：光照强度为2800lx，光周期为12h光期、12h暗期，室内空气相对湿度85％，室温24～25℃的条件下培养3～7d。月季灰霉病菌可参考文献(NoackR.Breeding and selection strategies for disease and pest resistance.In:Encyclopedia of Rose Science.Roberts AV,Debener T,Gudin S eds.,Oxford:Elsevier Academic Press,2003,1:144-147)中的诊断方法对感染了灰霉病菌的月季花瓣进行诊断。
②用步骤(1)①同样的方法转移上述组培苗上的灰霉病菌单菌落到相应的新的月季组培苗的花瓣上，在步骤(1)①同样的培养条件下培养3～7d；
③重复步骤(1)②3次；
④重复步骤(1)②1次，但培养条件时间改为10～15d；
步骤(1)①至步骤(1)④培养期间，组培瓶内的培养基质均为MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.0g/L，且组培瓶瓶口用透气性塑料膜封盖。
国内12个不同地点：云南省6个县市：大理州大理市(简写：DL)、普洱市(简写：PE)、红河州蒙自市(简写：MZ)、玉溪市(简写：YX)、昆明市(简写：KM)、曲靖市(简写：QJ)；四川省1个市：成都市(简写：CD)；贵州省1个市：贵阳市(简写：GY)；北京市(简写：BJ)；河南省1个市：南阳市(简写：NY)；广东省1个市：深圳市(简写：SZ)；江苏省1个市：无锡市(简写：WX)。
(2)月季灰霉病菌孢子悬浮液的制备
用已灭菌的毛刷(灭菌方法：120℃高温灭菌20分钟)将步骤(1)④中组培苗花瓣上的灰霉病菌刷到含有0.03％(体积分数)吐温20的无菌蒸馏水中，每刷一份灰霉病菌材料，须更换新的已灭菌的毛刷，不同采集地点的灰霉病菌刷入不同容器内的所述含有0.03％(体积分数)吐温20的无菌蒸馏水中，保证不同采集地点的灰霉病菌不混合；将每个容器内的灰霉病菌孢子浓度用含有0.03％(体积分数)吐温20的无菌蒸馏水调至5×104个/ml，即得月季灰霉病菌孢子悬浮液，用于接种备用。
(3)月季寄主材料的准备
采集如下鉴定寄主材料，采集鉴定寄主材料的花朵从内到外第1～2层的无病虫害的花瓣，先将采集的花瓣用解剖镜镜检，确保所采集的花瓣无任何真菌菌落或菌丝后，再用体积分数70％乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～5次，用无菌的滤纸吸干花瓣表面的水分，花瓣正面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中(花瓣背面光滑，真菌不易接种成功，正面有利于接种成功，每个培养皿中3片花瓣)，每一种鉴定寄主材料的花瓣放置在一个培养皿内；所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L；
所述鉴定寄主材料为：‘桃之夭夭’(Rosa‘Taozhiyaoyao’)、‘月月粉’(Rosachinensis‘Pallida’)、‘金粉莲’(Rosa‘Jinfenlian’)、‘星语星愿’(Rosa‘Xingyuxingyuan’)、‘映日荷花’(Rosa‘Yingrihehua’)和‘思春’(Rosa‘Sichun’)。
(4)月季灰霉病菌的接种和培养
采用喷雾法或滴液法将步骤(2)12个采集地点的灰霉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述各培养皿内的每片花瓣上，保证肉眼可见每片花瓣正面被灰霉病菌孢子悬浮液覆盖，一个采集地点的灰霉病菌孢子为一个样本，每个样本设置3个重复，一个采集地点的灰霉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述每一个培养皿的每片花瓣上；接种完成后，将培养皿在室内光强2800lx、光周期为12h光期、12h暗期，空气相对湿度85％、室温24-25℃的条件下培养5～7d；
(5)月季寄主材料的病情观测和统计
接种花瓣病情划分为2个等级：0级：抗病，花瓣无病斑或<20％花瓣面积发病；1级：感病，≥20％花瓣面积发病。
采用SAS V9.0统计分析软件(STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM，简称SAS)对上述接种花瓣病情划分数据进行ANOVA分析，每份不同采集地点的月季灰霉病菌生理小种接种花瓣后感染的花瓣病斑面积最终数据为：总病斑面积/总花瓣面积×100％±标准误差。
(6)鉴定生理小种
将步骤(5)的统计结果，0级用0表示，1级用1表示，一一对应地将不同鉴定寄主材料与不同采集地点来源的月季灰霉病菌之间的抗/感性结果列入表格(见下表2、表3)，表格中直观反应出的0/1组合矩阵类型即为月季灰霉病菌生理小种的类型，0/1组合矩阵类型与表1月季灰霉病菌生理小种类型对照表进行比对，判断鉴定出月季灰霉病菌生理小种的类型(A型至F型，表2和表3)。
试验结果：
根据下述表2和表3，可直观统计出所采集的全国范围内的12个县市地区月季灰霉病菌生理小种的类型，即A型至F型共计6个生理小种类型(A型、B型、C型、D型、E型、F型)。从表2和表3中可以查询并判断出某个地区的生理小种的类型，例如采自北京地区的为C型月季灰霉病菌生理小种,它对所述6份鉴定寄主材料中的‘映日荷花’和‘思春’2份鉴定寄主材料感病，即统计结果为1，其余4份鉴定寄主材料均为抗病，即统计结果为0。该发明方法不仅可鉴定出月季灰霉病菌生理小种的类型，同时还可指导该地区月季育种，选择对该地区月季灰霉病菌生理小种具有抗性的育种材料。
表2实施例1不同鉴定寄主材料与6个不同地理来源的月季灰霉病菌之间的抗/感结果
表3实施例1不同鉴定寄主材料与6个不同地理来源的月季灰霉病菌之间的抗/感结果
注：表2和表3中0：抗病；1：感病。
对比实验1：月季灰霉病菌孢子悬浮液接种于鉴定寄主材料的离体叶片
对比实验1除将鉴定寄主材料的花瓣换为鉴定寄主材料的叶片外，其余操作与实施例1相同，用于比较实施例1中所述的月季灰霉病菌孢子悬浮液接种于所述鉴定寄主材料的离体花瓣与所述月季灰霉病菌孢子悬浮液接种于所述鉴定寄主材料的离体叶片的差异。对比实验1统计的结果是：接种后的叶片只有两种情况，一种是无病斑，另一种是<20％叶片面积发病，接种叶片病情仅能划分为1个等级，即0级：最终，无法完成对不同采集地点的月季灰霉病菌生理小种的鉴定工作。
对比实验2接种花瓣病情等级划分对比(花瓣发病面积30％为基准)
对比实验2以花瓣发病面积30％为基准划分花瓣病情等级，其余操作与实施例1相同，结果是(见下表4、表5)：原本6个生理小种的灰霉病菌(A型至F型)(表2和表3)，将会鉴定为4个生理小种(仅有A型、B型、C型和D型)，结果不仅混淆了生理小种，而且鉴定结果的不准确将会延误抗病育种等科研工作的开展。
表4对比实验2不同鉴定寄主材料与6个不同地理来源的月季灰霉病菌之间的抗/感结果
注：表4中0：抗病；1：感病。
表5对比实验2不同鉴定寄主材料与6个不同地理来源的月季灰霉病菌之间的抗/感结果
注：表5中0：抗病；1：感病。
对比实验3：接种花瓣病情等级划分对比(花瓣发病面积10％为基准)
对比实验3以花瓣发病面积10％为基准划分花瓣病情等级，其余操作与实施例1相同，结果是(见下表6、表7)：原本6个生理小种的灰霉病菌(A型至F型)(表2和表3)，将会鉴定为4个生理小种(仅有B型,C型,E型和F型)，结果不仅混淆了生理小种，而且鉴定结果的不准确将会延误抗病育种等科研工作的开展。
表6对比实验3不同鉴定寄主材料与6个不同地理来源的月季灰霉病菌之间的抗/感结果
注：表6中0：抗病；1：感病。
表7对比实验3不同鉴定寄主材料与6个不同地理来源的月季灰霉病菌之间的抗/感结果
注：表7中0：抗病；1：感病。
对比实验2和对比实验3充分说明如若不是以20％花瓣发病面积作为月季离体花瓣灰霉病发病的等级划分，将无法区分出不同的生理小种。
表8本发明涉及的生物材料在非专利文献公开列表
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