一种唾液产气微生物的分离方法
阅读说明：本技术 一种唾液产气微生物的分离方法 (Method for separating salivary aerogenic microorganisms ) 是由 高茜 米其利 罗娜 王雪 许力 管莹 向海英 曾婉俐 杨光宇 李雪梅 于 2020-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种唾液产气微生物的分离方法,包括如下步骤：(1)稀释采集的唾液；(2)将稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上,在厌氧环境中恒温培养；(3)待培养基上生长出菌落后,取无菌薄膜贴于培养基上,判断菌落是否产气；(4)选取产气的菌落进行划线纯化后,接种至同类型的培养基上；(5)重复执行步骤(3)和(4)；(6)对步骤(5)中得到产气菌落进行划线纯化,直到得到单菌落；(7)将单菌落接种至装有同类型的培养基并放置了杜氏小管的离心管中进行恒温培养,出现气泡的菌落即为唾液产气微生物。本公开的唾液产气微生物的分离方法在菌株分离的同时展开产气微生物的筛选,可有效提高唾液产气微生物的分离和筛选效率。(The invention discloses a method for separating salivary aerogenic microorganisms, which comprises the following steps: (1) diluting the collected saliva; (2) coating the diluted saliva on different types of culture media, and culturing at constant temperature in an anaerobic environment; (3) after the bacteria grow out of the culture medium, taking a sterile film to be pasted on the culture medium, and judging whether the bacterial colony generates gas or not; (4) selecting a colony generating gas, streaking and purifying the colony, and then inoculating the colony to a culture medium of the same type; (5) repeatedly executing the steps (3) and (4); (6) streaking and purifying the aerogenic colonies obtained in the step (5) until single colonies are obtained; (7) inoculating the single colony to a centrifugal tube filled with the same type of culture medium and placed in a Du's tubule for constant temperature culture, wherein the colony with bubbles is the salivary aerogenic microorganism. The method for separating the salivary aerogenic microorganisms can be used for screening the aerogenic microorganisms while separating the strains, and can effectively improve the separation and screening efficiency of the salivary aerogenic microorganisms.)
技术领域
本发明涉及微生物分离领域，更具体地，涉及一种唾液产气微生物的分离方法。
背景技术
唾液中的微生物丰富多样，具有各类生理学功能。唾液微生物的群落结构特征及其稳态与宿主的口腔及全身健康密切相关，其病理性改变可诱发龋病、牙周病等口腔感染性疾病，还与糖尿病、类风湿性关节炎、心血管疾病等系统性疾病有关。
唾液微生物中包括产气菌(又称为产气微生物)，例如产气荚膜菌、产气肠杆菌等。这些唾液中的产气微生物与口腔疾病及其他全身疾病有潜在密切关系，因此常常被作为临床疾病监测菌，对这类产气微生物的研究有利于的防及治疗口腔疾病。
目前，唾液产气微生物的分离需要先通过涂布分离获得纯培养菌株，再测试产气情况才能确定获得分离的唾液产气微生物。由于唾液产气微生物生理功能复杂且生存环境较难模拟，仅有较少的菌株可获得纯培养，导致进一步的产气筛选实验获得的产气菌株非常少。
因此，如何提供一种可有效提高唾液产气微生物的分离和筛选效率的方法成为本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可有效提高唾液产气微生物的筛选和分离效率的唾液产气微生物的分离方法的新技术方案。
根据本发明的第一方面，提供了一种唾液产气微生物的分离方法。
该唾液产气微生物的分离方法包括如下步骤：
步骤(1)：稀释采集的唾液；
步骤(2)：将稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上，在厌氧环境中恒温培养；
步骤(3)：待培养基上生长出菌落后，取无菌薄膜贴于培养基上，根据无菌薄膜下是否形成气泡来判断菌落是否产气；
步骤(4)：选取产气的菌落进行划线纯化后，接种至同类型的培养基上；
步骤(5)：重复执行所述步骤(3)和所述步骤(4)；
步骤(6)：对步骤(5)中得到产气菌落进行划线纯化，直到得到单菌落；
步骤(7)：将单菌落接种至装有同类型的培养基并放置了杜氏小管的离心管中进行恒温培养，出现气泡的菌落即为唾液产气微生物。
可选的，所述步骤(1)具体如下：
将采集的唾液在0.5h内采用无菌水稀释至唾液的体积百分含量为千分之一。
可选的，所述步骤(2)中的培养基包括BHI培养基、TSA培养基、厌氧琼脂培养基、EG培养基和血琼脂培养基。
可选的，所述步骤(2)具体如下：
将稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上，放入厌氧罐中置于37℃培养箱中培养48h。
可选的，所述步骤(2)具体如下：
取150μL稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上，放入厌氧罐中置于37℃培养箱中培养48h。
可选的，所述步骤(3)中的无菌薄膜为大肠菌群测试片的上层薄膜。
可选的，所述步骤(4)具体如下：
挑选不同形态、颜色和大小并有气泡产生的菌落连续划线纯化，并接种至同类型的培养基上。
可选的，所述步骤(5)中重复执行所述步骤(3)和所述步骤(4)的次数为1次。
可选的，所述步骤(7)具体如下：
将单菌落接种至装有同类型的培养基并放置了杜氏小管的离心管中，将离心管放置于37℃培养箱中培养，出现气泡的菌落即为唾液产气微生物。
可选的，还包括步骤(8)：
对唾液产气微生物进行富集培养。
本公开的唾液产气微生物的分离方法在菌株分离的同时展开产气微生物的筛选，可有效提高唾液产气微生物的分离和筛选效率。而且，采用不同类型的培养基同时进行分离培养，有利于最大限度地获得更多的产气菌株。
具体实施方式
现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。
本公开提供了一种唾液产气微生物的分离方法，包括如下步骤：
步骤(1)：稀释采集的唾液。
为了提高分离和筛选效率，步骤(1)可具体如下：
将采集的唾液在0.5h内采用无菌水稀释至唾液的体积百分含量为千分之一。
步骤(2)：将稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上，在厌氧环境中恒温培养。
为了最大限度地获得更多的产气菌株，步骤(2)中的培养基可包括BHI培养基、TSA培养基、厌氧琼脂培养基、EG培养基和血琼脂培养基。
为了提高分离和筛选效率，步骤(2)可具体如下：
将稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上，放入厌氧罐中置于37℃培养箱中培养48h。
进一步的，步骤(2)具体如下：
取150μL稀释的唾液涂布于不同类型的培养基上，放入厌氧罐中置于37℃培养箱中培养48h。
步骤(3)：待培养基上生长出菌落后，取无菌薄膜贴于培养基上，根据无菌薄膜下是否形成气泡来判断菌落是否产气。
步骤(3)中的无菌薄膜可为大肠菌群测试片的上层薄膜。
具体实施时，可取一包未开封的大肠菌群测试片，揭下上层薄膜，将上层薄膜剪成合适的形状贴于培养基上方，观察产气情况。若存在产气的菌落，将会在薄膜下出现气泡。若不存在产气的菌落，则薄膜下不会出现气泡。
此外，可采用明确具有产气能力的大肠杆菌进行阳性对照，以验证试验体系是否正常。
步骤(4)：选取产气的菌落进行划线纯化后，接种至同类型的培养基上。
为了提高分离和筛选效率，步骤(4)可具体如下：
挑选不同形态、颜色和大小并有气泡产生的菌落连续划线纯化，并接种至同类型的培养基上。
步骤(4)中同类型的培养基是指与步骤(2)中的培养有产气菌株的培养基相同类型的培养基。
步骤(5)：重复执行步骤(3)和步骤(4)。
具体实施时，为了在保证分离效果的基础上加快分离筛选的的速度，重复执行步骤(3)和步骤(4)的次数为1次。也即是说，执行两次步骤(4)和步骤(5)。
步骤(6)：对步骤(5)中得到产气菌落进行划线纯化，直到得到单菌落。
本领域技术人员可根据是否得到单菌落来确定步骤(6)的重复次数。具体实施时，步骤(6)可重复执行2-3次。
步骤(7)：将单菌落接种至装有同类型的培养基并放置了杜氏小管的离心管中进行恒温培养，出现气泡的菌落即为唾液产气微生物。
为了提高分离和筛选效率，步骤(7)具体如下：
将单菌落接种至装有同类型的培养基并放置了杜氏小管的离心管中，将离心管放置于37℃培养箱中培养，出现气泡的菌落即为唾液产气微生物。
步骤(7)中同类型的培养基是指与步骤(2)中的培养有产气菌株的培养基相同类型的培养基。
为了获取更多的唾液产气微生物，本公开的唾液产气微生物的分离方法还包括步骤(8)：
对唾液产气微生物进行富集培养。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。
实施例1
(1)唾液样品处理
将采集的唾液在0.5h内采用无菌水稀释到唾液的体积百分含量为千分之一。
(2)平板涂布
将稀释好的唾液吸取150μL分别涂布于BHI培养基、TSA培养基、厌氧琼脂培养基、EG培养基和血琼脂培养基中的平板上。
(3)产气情况观察
将培养基置于厌氧罐中放入37℃培养箱中培养48h，待菌落长出后，取一包未开封的大肠菌群测试片，揭下上层薄膜，将上层薄膜剪成合适的形状贴于培养基上方，观察产气情况。若存在产气的菌落，将会在薄膜下出现气泡。若不存在产气的菌落，则薄膜下不会出现气泡。可采用明确具有产气能力的大肠杆菌进行阳性对照，以验证试验体系是否正常。
(4)菌株分离
挑选不同形态、颜色和大小并有气泡产生的菌落连续划线纯化，并接种到同类型的培养基上，进行纯培养。
(5)获取单菌落
重复执行(3)产气情况观察和(4)菌株分离的操作，得到产气菌落。对产气菌落进行划线纯化，直到得到单菌落。
(6)验证产气情况
根据上述纯化后培养基中单菌落的形态、大小和颜色，进行分类编号。将不同编号的单菌落接种到装有同类型的培养基并放置了杜氏小管的离心管中。将离心管放置于37℃培养箱中，培养至管中出现气泡，管中有气泡产生的菌落即为具有产气能力的唾液产气微生物。
选取唾液产气微生物进行富集培养，将培养好的菌落保存于进行菌株保藏。
虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法