具体实施方式

根据本发明，可以在包含活细胞和细胞培养基的二维或三维细胞培养系统中测定选自由细胞表面分子和细胞外基质分子组成的组中的分子，而不会实质性地损害活细胞的生长能力。特别地，在包括细胞培养基的二维或三维细胞培养系统中的细胞可以继续生长，而不会因分子测定而受到实质性损害。

细胞培养系统是受活细胞影响的复杂细胞环境。这样的环境由大量的细胞基质和营养物质以及细胞代谢物和各种其他成分组成，由于是各种物质的混合物，这样的环境是复杂的。这种复杂性由于其本身可能就会对某些检测分子的测定方法造成干扰。此外，细胞代谢本身也会引起干扰性的副反应。

根据本发明的方法是原位方法。术语“原位方法(in-situ method)”或“原培养方法(in-culture method)”是指在包括活细胞的体外细胞培养系统中进行的方法。在根据本发明的方法中，活细胞因此不会从包含细胞培养基的二维或三维细胞培养系统中去除。在根据本发明方法的过程中，细胞仍保留在细胞培养系统中。细胞培养系统包括适于细胞培养的容器和细胞培养基，容器可选地包含用于三维细胞培养的三维框架。细胞可以在该方法的各个步骤中进行洗涤，但洗涤步骤也可以使用细胞相容性培养基来进行。由于在方法实施过程中仅使用细胞相容性培养基对细胞进行处理，因此细胞生长不会受到实质性损害，即使在测定一种或多种分子后，细胞仍可以继续生长。即使是在不同的天数连续测定分子，也不会实质性地损害细胞的生长。因此，根据本发明的方法特别地适合于监测分子在特定时间段内的电位变化。

根据本发明，至少检测的第一步，即将分析物探针与分子结合，在该细胞培养系统中进行(即在细胞和细胞培养基存在的情况下)。分析物探针或其一部分(例如，检测元件)可保留在复杂的细胞环境中，而无需纯化处理，探针或其剩余部分不会对细胞生长产生任何实质性影响，因此不会显著地损害细胞生长。或者，分析物探针或其一部分可在复杂的细胞环境中降解，特别地，被细胞或其分解代谢酶自然地降解。

根据本发明的原位方法测定的分子是细胞表面分子或细胞外基质分子。

细胞表面分子是与细胞膜或细胞的细胞室或细胞器的生物膜相关的分子。外周膜蛋白(与膜表面结合的蛋白质)与内在膜蛋白之间存在区别，内在膜蛋白是与膜双脂层中的疏水成分整合的蛋白质，内在膜蛋白多数作为跨膜蛋白跨越膜双脂层。

细胞外基质(ECM)是动物组织(特别是结缔组织)的一部分，存在于细胞之间称为细胞间隙中的地方。根据现今的观点，ECM包括大分子的整体，其位于组织和器官中的细胞质膜外。糖胺聚糖(GAG)是由某些糖的双糖单元组成的长链多糖，在ECM中大量发现。以下应在此提到：透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和硫酸角质素。除了透明质酸，所有GAG都可与蛋白质结合，从而形成蛋白多糖。几乎所有的细胞都具有与ECM接触的受体。通常使用不同的吸附蛋白、衔接蛋白或其他粘附蛋白，它们本身是ECM的组分，一方面与基质的其他组分相互作用，另一方面与细胞受体相互作用。

细胞表面分子的优选示例是膜蛋白，例如受体蛋白、转运蛋白、细胞-细胞识别蛋白、细胞基质蛋白、酶、信号传递蛋白，或者细胞膜或细胞壁的其他成分。细胞外基质分子的优选示例是糖蛋白，例如胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白，或者糖胺聚糖，例如透明质酸、硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素。细胞表面分子也可以是重组蛋白。

根据本发明(在该方法中)的分析物探针具有适于结合所需分子的检测元件，以及一种或多种识别元件。它通常是这两种成分的化合物，具有或不具有连接元件(接头)。这两种元件之间的化学连接优选地为共价键。

分析物探针优选地为小分子，例如大小小于50kD。分析物探针可能的大小或分子量为50Da至40kDa、100Da至30kDa或200Da至20kDa，或优选地为400Da至10kDa。在核酸的情况下，检测元件可由长度为6-80个核苷酸的寡核苷酸组成。10至60个核苷酸是优选的。

寡核苷酸序列可由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物以及经化学修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成。优选地，识别元件由具有8到100个核苷酸(例如16-20个核苷酸)的寡核苷酸序列组成，然而，序列可以更长。

检测元件是一种可以与选定分子结合的分子(或者是分析物探针的分子组成部分)。这种结合反应是特异性反应，以获得相应的特异信号。分子的结合存在多种键合机制，优选地为复合物形成反应或离子间相互作用。非共价键是可逆的，通过改变结合条件可以断开连接，例如通过提高温度或增加盐浓度，或通过加入会导致键变性的化学物质/洗涤剂。因此，在根据本发明方法的步骤iv)中，优选地通过改变结合条件来使整个分析物探针从分子中释放。共价反应也是可能的。分子上合适的键是配体-配体键或配体-受体键。特别地，在细胞表面分子的情况下，这些细胞表面分子的相应配体可以用作检测元件。

通常，检测元件可以是肽、蛋白质或核酸。

通用检测元件包括抗体或抗体片段或具有抗原结合部分的衍生物。适体是类似的通用检测元件。可以获得对应几乎任何分子的抗体(通常包括片段或所述衍生物)和适体，并根据本发明来使用。

在所讨论的方法的具体实施方式中，抗体、抗体片段或衍生物都可用作检测元件。

优选的抗体片段或衍生物是单链抗体或其抗原结合域Fab、Fv、F(ab)₂、Fab'、F(ab')₂、scFv、scfc、V_HH。抗体可以是IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、IgW和IgY类，或衍生自这些抗体的片段或衍生物。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。抗体与分析物探针其他元件的键可以是共价键或通过复合物形成——例如，适体可以结合抗体，例如在Fc部分与分析物探针的其余元件连接。共价键优选凭借抗体的赖氨酸残基。与抗体的共价键也可以通过常见的交联剂如EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)而形成。这里，羧基连接到伯胺基，例如赖氨酸残基。在其他实施方式中，寡核苷酸序列的官能团还可结合到伯胺(-NH₂)、巯基(-SH)、羰基(-CHO)或其他常用基团。凭借光反应性基团的键也是可能的。根据具体实施方式，使用结合亲和力低的抗体或抗体片段作为检测元件。蛋白质(如抗体)对配体的亲和力越低，Kd值就越大。特别地，使用Kd值高而对目标分子亲和力较低的抗体的优点在于，分析物探针(包括检测元件和识别元件)可以更容易地从目标分子中分离出来。这例如可以通过改变培养基中的离子浓度或通过灌注在检测元件上施加剪切力的作用而进行。

在优选的实施方式中，使用适体作检测元件和/或识别元件。例如，在WO 2009/012420 A1、WO2005/113817 A2、DE 102010038842 A1、WO 2012/130951 A1、EP 1918372A1、Baumstummler等人(Letters in Applied Microbiology 59,2014:422-431)和Terazono等人(Journal of Nanobiotechnology 2010,8:8)中公开了将适体用于检测方法，根据本发明适体可用作检测元件，如现有技术中所知。特别地，慢速率修饰适体(SOMAmer，上述Baumstummler等人)是优选的。

根据特定的实施方式，适体基于肽并且称为肽基适体。在这种情况下，适体由短(5-20)氨基酸序列组成，该序列与一小而非常稳定的蛋白质主链相连，形成适体。这种结构提供了一种特别的构象，增加了与所需分子特异性结合的可能性。通常，肽基适体可被视为缩小的免疫球蛋白T细胞受体。肽基适体及其应用的示例为Adnectin A，一种拟用于癌症的双特异性分子；Anticalin，抗细胞毒性T淋巴细胞CD152的适体；或者DARPin，一种用于治疗各种眼病(例如黄斑水肿)的VEGF-A抑制剂。(Sergey Reverdatto,David S.Burz,andAlexander Shekhtman,Peptide Aptamers:Development and Applications,Curr TopMed Chem.2015；15(12):1082–1101.)

根据另一个特定的实施方式，适体基于核苷酸并且称为核苷酸基适体。优选的核苷酸基适体为长度在25-90个碱基之间的短单链DNA或RNA寡核苷酸。这些寡核苷酸能够结合特定的分子，呈现出合适的3D结构。适体可以与蛋白质、细菌毒素、低分子量物质(如抗生素和氨基酸)、细胞、细胞表面分子、细胞基质分子和病毒颗粒结合。它们的解离常数在皮摩尔和纳摩尔的范围内。这意味着它们可以像抗体一样牢固地结合。

根据特定的实施方式，使用抗体和适体的组合(特别地，例如抗体-适体缀合物)，作为检测元件。抗体-适体缀合物特别地包括抗体、抗体片段或抗体衍生物，其优选地共价结合至合成寡核苷酸(例如适体)。合成寡核苷酸的长度优选地为40、50、60、70或更多个碱基。合成寡核苷酸优选地用作识别元件。在检测元件与所需目标分子结合后，识别元件优选地使用限制性酶(例如EcoRI、HindIII等)通过消化分离，并与培养上清液一起转移到不同的容器中。然后可以按类似于适体基检测元件的情况进行分析。

另一种将抗体、抗体片段或衍生物与适体结合的可能方法是通过使用Fc特异性适体作为检测元件。抗体、抗体片段或衍生物的恒定Fc部分因此可以非共价结合并再次分离，例如通过改变培养基中的离子浓度。这使得从不同动物物种的细胞中获得的不同抗体、抗体片段或衍生物可用于例如多重测定，因为每种动物物种都将独特的Fc部分整合到其抗体中。

检测元件与分子的共价键的示例是光反应性反应，例如通过光适体。当暴露在光下时，检测元件可以共价结合到分子上。例如，在美国专利号5,763,177、美国专利号6,001,577、美国专利号6,291,184和美国专利号6,458,539中描述了光适体，光适体通常有光反应性基团。

适体可以利用SELEX产生。在分子生物学中，缩略词SELEX(指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment))应理解为一种组合方法，用于定向进化寡核苷酸链，例如单链DNA或RNA。这些寡核苷酸链可以作为配体与选定目标特异性结合。

通过创建具有不同碱基序列的寡核苷酸的大随机文库，并通过系统进化进行指数富集，从该碱基序列序列库中筛选出与所需分子结合最强的配体。为此，将候选适体与固定化配体混合，并洗掉未结合的适体。在所讨论的方法的优选实施例中，首次SELEX轮中或进一步的一SELEX轮中，候选适体与细胞一起在细胞培养基中孵育。因此，在包含细胞培养基的复杂细胞环境中，选择特异性结合相应细胞和待测定的分子的适体。在复杂的细胞环境中进行选择的优点是选择的适体不会由于大量细胞物质、营养物质、细胞代谢物和各种其他成分或细胞代谢而使其结合特异性受到负面影响。正是这些适体能够在这种复杂的细胞环境中特异性地结合所限定的分子，根据本发明将它们称为细胞培养选择的适体。

在这一步之后，候选适体另外进行阴性选择和蛋白质选择。在上述几轮选择后，这些适体在进一步的轮中选择，以选择特异性结合所限定的分子的适体。在这里，所限定的分子与固体载体(优选地为磁珠)结合，然后进行选择。在阴性选择中，在完全没有分子的情况下进行选择。这一步的目的是从文库中去除只结合固体载体而不结合分子的适体。所有与固体载体结合的适体都保留在上面，优选地其余适体接受进一步的选择。

最后，剩下的就是对目标分子具有高亲和力(结合强度)的候选适体。适体的个体特性是高的化学稳定性、低的免疫原性、高的特异性和亲和力以及特异性地影响蛋白质与蛋白质的相互作用的能力。适体通常不是生物合成，而是化学合成的。这使得适体的生产更低廉。这种合成允许进行多种修饰，例如加入荧光报告分子或亲和标签。优选的适体或修饰的适体是光适体和spiegelmer。分析物探针、检测元件和/或第一识别元件可由核酸(例如DNA或RNA或其混合物)组成。由于稳定性更高，因此DNA是优选的。核苷酸可以进行修饰，例如甲基化、芳基化、乙酰化。经修饰的核苷酸为，例如，2’-氟、2’-甲氧基和/或2’-氨基修饰的核苷酸、2’-氟、2’-甲氧基和/或2’-氨基修饰的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。另一种可能的是LNA(锁定核酸)或PNA(肽核酸)，尤其是在不应被切割或应防止切割的部分是LNA或PNA。

检测元件优选地以高亲和力与分子结合，例如结合常数(解离常数)Kd为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11或10^-12或更低，以及在这些Kd值之间的范围内。

根据进一步实施方式，检测元件以低亲和力与分子结合，例如Kd高于10^-3、10^-2、10^-1、10¹、10²、10³或10⁴或更高，以及在这些Kd值之间的范围内。特别地，当检测元件是抗体或抗体片段时，检测元件以低亲和力与分子结合。

分析物探针的识别元件可以是能够随后产生信号的化学单元。它不必承载(bear)信号(即使这是一个选项)，但可以根据它产生信号。因此，识别元件通常是随后结合的标记物(根据英语术语，也称为标记或标签)，这种结合用于产生信号。合理地，经步骤iv)的分离(通过转移或在细胞环境中降解)之后，没有或只有微量的信号产生成分留在细胞环境中。通常的识别元件是具有特征序列的寡核苷酸，该序列随后被识别用于检测，例如通过与另一种物质、固相或另一种识别元件结合。识别元件也可以是能被特异识别用于检测的肽。然后类似于寡核苷酸产生信号。同样，任何其他形式的能被随后特异识别用于检测的化学物质都是可能的。根据本发明的分析物探针可以包含一种或多种识别元件。特别地，分析物探针可包含多达5、10、20种或更多种识别元件。

该方法还可以包括洗涤步骤，或者包括用于使分析物探针短期内变性或在微量滴定板的微珠或孔上固定组分的步骤。这些步骤也可用于分离识别元件。

优选地，除了与检测元件形成复合物外，分子经过步骤ii)和iv)在化学上保持不变，并且优选地，在细胞培养系统中可以保持不变。这特别适用于细胞或细胞成分，但通常适用于任何仍可被环境和其中所含细胞利用的分子。

本发明的方法包括在包含活细胞和细胞培养基的二维或三维细胞培养系统中，通过其检测元件将分子与分析物探针结合的步骤。这也就是步骤ii)。包含活细胞和细胞培养基的二维或三维细胞培养系统是上述复杂的细胞环境。优选地，复杂的细胞环境包含活细胞，这些活细胞不会因该步骤而实质性受损或仅受到最低程度的影响。特别地，细胞生长不应实质性受害。特别地，在该步骤中，细胞并非分离出来而是在原位并保留在细胞培养系统中进行测定，也就是说，在整个分析过程中细胞保留在其培养基中。例如，细胞可以预先培养1天或更长，或者2、3、4天或更长。在步骤ii)之后，在细胞特定时间内再次接受所讨的方法的步骤ii)之前，优选进一步培养细胞，例如培养1、2、3、4天或更长。优选地，除了改变培养基和任何传代外，细胞培养系统不改变。

特别地，细胞培养系统包括容器和培养基，而不包含特定的气氛成分。因此，在所讨论的方法的步骤ii)中，可以将细胞从培养箱中取出，通常培养箱中的气氛条件是为了促进可能的最佳生长。动物细胞可能的最佳生长的氛围条件优选地为35-38℃，特别优选地为约37℃，以及0-10％CO₂，特别优选地为3-6％CO₂。

相对于分子，分析物探针可以过量存在。

细胞相容液体，特别是细胞培养基优选地用于根据本发明的方法中。步骤ii)至v)优选地在该液体中进行。该液体被用作复杂细胞环境的一部分。它可以是一种适用于细胞生长或护理细胞的培养基。所限定的细胞培养基为基于氨基酸、碳水化合物、无机盐和维生素的成分的组。通常含有的盐至少为氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠。通常含有的维生素至少为叶酸、烟酰胺、核黄素和B12。此外，细胞培养基还可含有FCS(胎牛血清(FetalCalf Serum))或FBS(牛胎儿血清(Fetal Bovine Serum))。优选的细胞培养基为MEM、α-MEM、DMEM、RPMI及其变体或修改。

细胞培养系统可以有二维或三维培养的细胞。典型的二维方法包括在细胞培养皿中培养细胞悬浮液，细胞在其中可以附着和繁殖。这种方法基本上简单、廉价且在世界范围内广泛应用，但这种培养方式下的细胞在生理上与体内的细胞有所不同。为此，针对三维培养细胞的新概念正在深入研究发展。例如，细胞可以在特殊的生物反应器中用三维基质(支架)进行培养。在另一变体中，它们使用特殊的微量滴定板、悬滴进行转化，或者转化为细胞微珠/球体。在三维中，在以前许多情况下，细胞特异性表征是不可能的，或者只能在培养期结束时使用特殊、耗时的分析方法进行表征。利用本发明，现在可以在三维细胞培养系统中进行原位检测方法。

三维细胞培养系统是指在体外条件下对细胞进行微结构三维培养。培养物或其细胞应采用空间定向。这主要是以水凝胶的形式发生的，这些水凝胶由结构蛋白(例如纤维蛋白、胶原蛋白、明胶(聚甲基丙烯酸甲酯或基质凝胶)，以及固体支架(例如聚苯乙烯、聚乳酸或其他化学物质)制成。在三维环境中，许多细胞系形成球体，随细胞嵌入后，球体的直径随着时间的推移而增大。非球形细胞也经常表现出与二维培养截然不同的形态。二维培养是指在没有三维培养中使用的三维结构成分的表面上单层和分层培养。该细胞培养系统还包括动态细胞培养系统，其中单个细胞、细胞球体或细胞聚集体处于悬浮状态。动态细胞培养系统的示例可以是旋转瓶生物反应器、中空纤维生物反应器、“WAVE”/细胞袋生物反应器或灌注生物反应器。在生物反应器中，培养基可以单向地、双向地、脉动的、均匀地或随机地进行输送。

细胞可以选自原核细胞、真核细胞、有细胞壁的细胞，特别地为植物细胞和真菌细胞，无细胞壁的细胞，特别地为动物细胞。优选地，所述细胞为哺乳动物细胞，特别优选为人类细胞，但也可以为非人类细胞。

细胞可以为干细胞，例如多能干细胞、专能干细胞或单能干细胞、分化组织细胞、血细胞或淋巴细胞。这些细胞可以来自永生细胞系，例如肿瘤细胞系。也有可能采用发生分化的方式培养细胞。因此，细胞也可以改变分化程度。优选地，这应由培养条件(例如生长或分化因子)确定，而不受分析物探针结合的影响。

活细胞优选地附着或固定在表面或细胞外三维框架上。然而，细胞也可以以细胞聚集体或球体(或与其组合)的形式存在于悬浮液中。细胞优选地为粘附结合细胞。或者，细胞可以非粘附结合。特别优选为悬浮的细胞。3D培养的示例大多为非粘附结合，是在凝胶中进行培养，特别在水凝胶中，例如纤维蛋白或基质凝胶。该表面也可以是其他细胞，例如饲养细胞，它们会影响待分析细胞的生长。

根据本发明的方法还包括去除未结合分析物探针的可选步骤(步骤iii)。是否执行该步骤取决于测定结合分析物探针或其第一识别元件的进一步检测方法的类型。这里可能的选择性步骤，例如，仅对分子结合的识别元件的特异切割，或者相反——仅对游离(非分子结合)的分析物探针的识别元件的特异切割，以及对它们定量测定，以测定由其他分析物探针结合分子而减少的量。然而，最简单的方法通常是通过洗涤或降解去除未结合的分析物探针，以使在方法的进一步阶段不会再检测到它们。例如，可以通过酶降解来进行降解，例如通过核酸酶或肽酶/蛋白酶进行降解。

根据本发明的方法的基本步骤，是将分析物探针或一种或多种识别元件从分子的结合中释放出来，并将分析物探针或一种或多种识别元件转移到与细胞培养系统不同的容器中(步骤v)，其有助于实现对细胞培养系统干扰最小的目标。释放可以通过以任意数量的步骤进行。一般通过切断化学连接(例如检测元件和第一识别元件之间的化学连接)来进行释放。然后将游离的识别元件转移到另一个容器中，从而将其与细胞能够继续生长的细胞培养系统分离。这使得细胞能够继续生长而不受检测方法的干扰。

在优选实施方式中，通过改变结合条件将分析物探针从分子中释放出来。特别地，通过改变盐浓度来进行释放。复杂细胞环境中的盐浓度可以暂时增加或降低，而不会对细胞的生长造成实质性损害。细胞培养基的盐浓度优选地增加至300-600mM NaCl，更优选地增加至400-500mM NaCl，或者至500mM NaCl。为了不对细胞生长造成实质性损害，盐浓度不应显著地增加或降低超过15分钟，优选地不超过10分钟。

转移可以通过例如，第一识别元件或分析物探针的另一部分的亲和结合来进行。为此，例如与固相(例如，固体珠粒)结合的捕获单元可以结合识别元件。使用该捕获单元或固相，识别元件可以很容易地从复杂的环境中去除并转移到新容器中。在新容器中，识别元件可以从固相中分离或留在固相上。还可以通过任何其他步骤来进行这种转移。珠粒优选地为微珠，其上依次是结合单元，例如与分离部分(第一识别元件或其一部分)互补的寡核苷酸。根据方法的不同，与溶解的检测元件(尤其是适体(缓冲液变化/消耗))或者识别元件结合。这些珠粒优选地不要像明克斯(Luminex)珠粒或维拉科德(Vera-Code)珠粒那样进行修饰。可以使用相同尺寸的珠粒，在多路测定(multiplex measurement)的情况下，不同的识别元件通过不同等分试样与不同的分子结合。通过物理分离，例如分离在不同的试管或孔板的单个孔中，可以同时分析不同的目标/珠粒群。

根据本发明的方法还包括检测识别元件的步骤，步骤vi)。这可以以任何方式进行——现在不考虑细胞生长条件——在与细胞培养系统不同的容器中进行。可能的检测方法为，例如，与已标记的探针(标记探针)结合并测定标签。标记探针可以具有与识别元件互补的结合元件，并由此与识别元件相结合。标签优选地提供可量化的信号。例如，信号可以例如是光信号(特别是荧光)或放射性信号。

当目标分子进行了直接标记，根据本发明的方法也特别适于测定任何分子的浓度，尤其是细胞表面分子和细胞外基质分子的浓度。当溶解的/切断的第一识别部分的浓度与目标分子/蛋白质的浓度相对应或者成比例，则进行间接检测。优选地但非排他地，溶解的/切断的第一识别部分由核酸序列组成，并且可以通过任何常规的标准核酸测定方法来完成。

在该方法的特别优选的实施方式中，分析物探针在检测元件和第一识别元件之间没有连接元件。在步骤iv)中，可将分析物探针完全从分子的结合中释放，从而使带有一种或多种识别元件的整个分析物探针从分子的结合中分离。

其他实施方式为具有连接元件的分析物探针。在步骤iv)中，连接元件可被切割以将识别元件从分子的键合中分离，使得具有至少一个识别元件的检测探针部分从分子的键合中分离。连接元件可以具有切割位点，特别是酶切割位点。合适的切割位点可以例如是肽或寡核苷酸的形式。化学修饰也是可能的，例如具有光敏修饰的寡核苷酸主链。连接元件也可以通过光敏化学交联剂与检测元件结合。这种光敏性使得在步骤iv)中能够通过暴露于光下而进行切割。

使用2种或更多种的识别元件能够区分2种或更多种的目标分子。检测元件A与识别元件A结合到分子A上，而检测元件B与识别元件B结合到分子B。分离步骤后(例如通过改变盐浓度)，由检测元件和识别元件组成的分析物探针保留在上清液中，并且可以转移。利用检测装置，例如，带有信号单元的标记探针，可以基于识别元件来测定转移的分析物探针。例如，用不同的标记探针(A'或B')作为识别元件或通过空间分离，可以确定与它们结合的不同分子的不同识别元件(A或B)。这样就可以并行(多路)地进行多次测定。在一个实施方式中，可以同时分析多达25种、多达50种、多达100种、多达200种、多达500种、多达1000种以及多达10000种分析物。

在寡核苷酸的情况下，可以选择识别元件序列，使得既不会出现自二聚体(autodimer)，也不会出现与检测元件或连接元件的二聚体。如果不能避免二聚化，则可以通过与识别元件互补的RNA序列阻止与其他元件的结合。例如，所述RNA序列可以在检测之前用核糖核酸酶降解。

在寡核苷酸的情况下，本发明也可以描述为：一种用于测定分子的方法，其具有以下步骤：提供由寡核苷酸制成的分析物探针，该分析物探针具有作为检测元件的适体，该适体适用于结合所需分子，并具有至少一种第一识别元件；通过适体，将分析物探针与分子结合；去除未结合的分析物探针；通过改变盐浓度将分析物探针从分子的结合中释放；将释放的分析物探针的识别元件与标记探针结合，该标记探针为此特异地结合，并且该标记探针包括寡核苷酸以及其具有与所述识别元件杂交的序列(作为结合元件)；任选地去除未与标记探针结合的识别元件；检测与标记探针结合的识别元件。

将分析物探针与识别元件一起转移后，在新容器中，所述识别元件可通过标记探针测定或通过结合第二识别元件的中间步骤来测定，该第二识别元件又与标记探针结合。这种第二识别元件可在现场提供或制造，例如在第一识别元件处直接通过PCR进行。

优选地，通过进行定量PCR以定量地放大至少第一识别元件的信号。因此，生成的第二次级(secondary)识别元件的量是第一识别元件的量的倍数，或者与第一识别元件的量相关。在该实施方式中，第一识别元件优选地为PCR引物，次级识别元件是TaqMan标记探针。与第一识别元件或第二识别元件结合的标记探针，或者与第一识别元件相关的任何其他识别元件结合的标记探针用于产生信号。例如，该信号可用于产生色度、荧光或者质谱测定，以及用于通过基于图形的检测、毛细管电泳法、色谱法、HPLC或序列测定(例如NGS)的测定。

分析物探针的识别元件优选地为寡核苷酸。在步骤vi)可通过PCR检测，优选地为qPCR、RT-PCR、数字PCR、降落PCR、不对称PCR、固相PCR或嵌套式PCR，或间接地通过与互补结合元件结合来检测，其中优选地互补结合元件(例如，标记探针)是可光检测的。分析物探针的第一识别元件可以具有信号物质。例如，它可以有荧光素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶或其他一些酶报告元件。步骤vi)中的检测可通过容器中与环境或样品不同的相应物质来进行。在步骤vi)中，分析物探针的识别元件优选地通过质谱测定法、流式细胞术或测序(优选地为下一代测序(NGS))进行测定。

根据另一实施方式，在寡核苷酸探针的情况下，可以将识别元件转移到合适的杂交缓冲液中，并且可以进行标准的杂交方法。为确保两条链的高效结合，例如，寡核苷酸溶液可在37-60℃，优选37-50℃下孵育2小时或更短时间，且每个单个珠粒群置于微量滴定板的单个孔中。此外或之后，加入插层荧光染料或互补荧光标记的检测链。然后，在孔板读数仪或流式细胞仪或类似设备中对溶液进行测定。在一个实施方式中，该测定可用于同时分析针对不同分子的多达25种、多达50种、多达100种、多达200种、多达500种、多达1000种和多达10000种识别元件。可选地或除了空间分离，不同分子的测量也可以在不分离识别元件(多路)的情况下进行，从而可以将不同的互补样品固定在珠粒群上。释放的识别元件可以与不同的标记探针结合。为了区分这些分子，使用了不同的信号，例如具有不同吸收/发射光谱的荧光染料，这些荧光染料被偶联到互补标记探针上。

在另一实施方式中，使用了不同尺寸的珠粒，每种尺寸包含独特的标记探针，该标记探针与已被检测元件结合的相应分子的不同识别元件结合。空间分离不是必要的。根据方法的不同，使用第一识别元件(例如检测元件本身(在结合改变方法的情况下))或者切割第一识别元件以用于测定。可通过流式细胞仪进行测定，根据珠粒的尺寸的函数而得到信号，例如荧光信号(参见US2010/279888A1)。优选地，通过这些不同尺寸的微珠同时分析多达5种或更多种的目标分子。通过将这些珠粒进行空间分离，例如在不同的Eppendorf管或孔板孔中，可以同时分析数量不定的分子。

在一个实施方式中，通过DNA杂交芯片进行测定。为此，特别是使用寡核苷酸分析物探针。根据该方法，识别元件在芯片上单个点上与样品杂交。在该方法中，分离第一识别元件后，将其转移到合适的杂交缓冲液中，并进行标准杂交方法。为了确保两条链的最有效结合，寡核苷酸溶液例如可以与芯片在37-60℃，优选为37-50℃下孵育12小时。此后，可加入插层荧光染料或互补荧光标记探针。芯片在荧光扫描仪中进行洗涤和读数。结果为图像中荧光信号的强度，可以使用软件对其进行量化。在一个实施方式中，通过使用芯片可以同时分析多达25种、多达50种、多达100种、多达200种、多达500种、多达1000种和多达10000种识别元件。

在上述方法中，特别是在使用适体作为识别元件的情况下，可以在检测之前扩增识别元件。例如，在适体或识别元件与芯片、珠粒或孔板杂交之前，可以使用适体或识别元件通过PCR来完成。

在一个实施方式中，通过分子信标探针进行检测。这些探针由核苷酸序列组成，核苷酸序列末端彼此互补。在一端具有荧光团(例如EDANS)，而另一端与猝灭剂(例如DABCYL)结合，其能够猝灭荧光信号。中间部分由与分析物探针的任何部分互补的序列组成。在正常状态下，该序列呈发夹结构的形式，两个互补的末端形成茎，中间部分形成环。荧光信号由此被猝灭剂猝灭。具有第一识别元件的分析物探针从分子中释放出来。

在相关或其他实施方式中，它仍然可以与起始探针的成分结合。释放具有第一识别元件的分析物探针后，将其转移到分子信标探针上。识别元件与分子信标的寡核苷酸序列结合，并且防止形成发夹结构。当猝灭剂不能再猝灭荧光信号，结果是荧光信号。在进一步实施方式中，上述检测在对释放的分析物探针或识别元件进行PCR扩增的期间或之后而进行。

在一个实施方式中，在分离之后通过qPCR对识别元件进行检测和定量测定。qPCR是指在受控条件下进行PCR反应以测定分子浓度。

在一个实施方式中，通过TaqMan PCR测定浓度。TaqMan探针基于第一识别元件的互补序列，例如基于适体或识别元件本身，并且在5'端含有荧光团，例如6-羧基荧光素，在3'端含有猝灭剂，例如6-羧基四甲基荧光素。TaqMan探针与识别元件结合，在PCR过程中产生信号。为此，聚合酶复制第一识别元件的序列，其中5'-3'核酸外切酶活性释放荧光团，而猝灭剂不能再猝灭信号。信号随扩增轮数的增加而增大，PCR产物取决于与循环次数和起始物质浓度。

在另一实施方式中，通过在扩增期间加入插层荧光染料来测定浓度。该染料(例如SYBR-Green)在双链DNA存在下比在单链DNA存在下产生更强的荧光信号。在PCR过程中形成双链DNA，这反过来增加了染料的信号。信号强度取决于循环次数和起始物质的浓度。

在另一实施方式中，可以通过在扩增期间加入荧光标记核苷酸来测定浓度。该荧光染料(例如荧光素)，在扩增过程中与掺入的尿嘧啶偶联。信号强度取决于循环次数和标记尿嘧啶的浓度，因此也取决于起始物质的浓度。

在另一实施方式中，通过毛细管凝胶电泳进行检测。具有荧光团的独特质量标签(mass tag)附着在第一识别元件上。所标记的第一识别元件随后被转移到仪器中，其中所述所标记的第一识别元件可基于质量标签被识别和通过荧光信号被量化。

在另一实施方式中，通过质谱仪进行检测。例如，特殊的质量标签可以通过酶附着在第一识别元件上。因为标签有不同的质量，所以基于质量进行区分。该方法不需要染料标记。

在另一实施方式中，通过高效液相色谱(HPLC)进行检测。一方面，该方法使目标分子能够被分离，另一方面，通过测定标准品，其可以识别和定量地测定目标分子。在这种情况下，待检测的物质与洗脱液(流动相)混合，并从分离柱(固定相)中洗脱。

特别地，本发明还可以以试剂盒的形式提供，试剂盒具有所列出的全部或多个部分的成分。

实施例

通过以下实施例进一步描述本发明，但不必限于本发明的这些具体实施方式。

实施例1：分析物探针的结构

如图1所示，分析物探针可由以下部分组成：

1.左起，适体(1a)作为单链，可以包含一种或两种作为识别序列的识别元件(3a、5a)。

2.左起，这里显示为单链。这些识别序列可附着在适体的5'或3'端。在适体和识别序列之间可以提供连接元件(2a)(RNA或DNA)。连接元件可以是单链(2.左起，2a)或双链(3.左起，2a和2b)。

3.左起，2b显示了与链2a互补的连接元件的一条链。在双链的实施方式中，识别元件和检测元件可以存在于不同的链或相同的链上。双链性(double strandedness)使得能够用双链特异的限制性酶来切割连接元件。此外，可以提供qPCR识别序列(qPCR标签，4a)。

4.左起，可选地，另一连接元件(6)具有肽序列或化学交联剂。

5.左起，适体具有作为可诱导信号单元的识别元件(7)，例如是可以在通过底物的影响而传递信号的酶，这也是可能的。酶例如是，荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶。2b/3b/4b/5b表示与2a、3a、4a、5a互补的链(DNA或RNA)。梳状结构显示可杂交核酸或杂交的核酸，前提是配对物显示了。

表1包含了图1所示的根据本发明的分析物探针的示例性元件的列表。

表1：图1中分析物探针的元件

在分析物探针的示例性实施方式中，根据图2提供的是抗体(9)而非适体。

1.左起，抗体通过接头(8)与分析物探针的其余部分连接。其他元件可以参见图1。

2.左起，或者抗体可以通过特异性结合抗体的适体(9a)结合，例如通过抗体的Fc部分。

3.左起，在图2右边的实施方式中，抗体通过连接元件2a、2b与酶识别元件(13)结合。合适的酶例如是荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶或其他。

表2包含了图2所示的根据本发明的分析物探针的示例性元件的列表

表2：图2中分析物探针的元件

实施例2：工艺流程

图3和4示意性地示出了根据本发明的方法的工艺。从上至下，从左至右，按箭头方向：细胞以2D或3D进行培养。分析物探针(图3中具有抗体检测元件；图4中作为适体)通过检测元件与细胞结合。在图3中通过改变缓冲条件并因此干扰与细胞的结合来释放识别元件，在图4中通过核酸内切酶。然后细胞可以进一步培养(左下角)。识别元件现从细胞中分离出来，并转移到另一个容器中，以及提交分析，例如通过PCR和扩增测定、比色法，通过与标记探针杂交、毛细管电泳、质谱测定、HPLC、NGS。图5示出了使用具有适体1a的分析物探针的工艺流程，其作为检测元件与细胞表面分子(15)结合。探针还具有作为识别元件的引物结合位点(3a和5a)。通过改变缓冲液(pH和/或离子强度)将分析物探针从细胞表面分子中释放出来。将从细胞表面分子释放的分析物探针转移到一个新的容器中，通过PCR检测探针。这里，正向引物3a*和结合到引物位点5a的反向引物5b，以及第一代扩增物(amplificate)(以及随后每一代)含有位点3b，位点3b与正向引物3a*结合以进一步的反应。所示为聚合酶(18)。标记探针1a*结合到PCR产物上与适体对应的点上，由此也可通过qPCR定量地测定适体，以及因此间接地测定了起始结合的适体。

图6示出了具有抗体(9)作为检测元件的分析物探针，抗体(9)通过接头基团与连接元件(2a、2b)结合，连接元件(2a、2b)又与识别元件(3a)连接，例如正向引物序列、qPCR标签(4a)和反向引物的结合位点(5a)(在检测期间，qPCR标签可以利用两个引物结合位点通过PCR进行扩增和检测)。分析物探针与细胞表面分子(15)结合。在核酸内切酶的作用下，识别元件(引物和PCR标签)被切割，转移到另一容器中，并且通过qPCR测定。引物5b(反向引物)和3a*(正向引物)利用聚合酶(18)用于PCR。在第一步中，可使用标记探针4a*(荧光标记qPCR探针)来测定切割出来的识别元件，并且因此间接地测定分析物探针结合的细胞。

实施例3：适体研发

为了选择合适的适体作为检测元件，选择了DNA适体文库(三联生物技术(TrilinkBiotechnologies))，该文库由随机的40个碱基的序列和两侧确定的引物组成。前两轮的SELEX直接针对脂肪细胞源性间充质干细胞(adMSC/赛默飞世尔(Thermofischer))而进行，然后进行10轮针对His标记的CD105蛋白(义翘神州(SinoBiological))的SELEX。在第一轮针对细胞的SELEX前，用PCR(Biomers For Primer/biotRevPrimer，Solis BioDyne Hot-Start FIREpol DNA聚合酶)扩增适体文库，然后与链霉亲和素珠粒(普洛麦格(Promega))孵育。孵育后，用0.1M NaOH使双链变性5分钟，转移到新的艾本德(Eppendorf)管中，并且用0.1M HCl调节pH值至7。

在第一轮SELEX中，在T-75瓶(格林尼生物(Biogreiner))中使用5ml无FCS的Alpha-Mem(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich))洗涤adMSC(P3)。用3ml无FCS的Alpha-Mem稀释适体文库，转移到细胞中并在37℃下孵育30分钟。然后，用5ml无FCS的Alpha-Mem洗涤细胞3次，为了释放未洗掉的任何适体，这些适体在37℃下用DMEM(ROTH)+500mM NaCl(西格玛-奥德里奇)孵育10分钟。将洗脱液转移到15ml福尔肯(Falcon)中，并根据生产商的说明利用3k Amicon超速离心柱(默克(Merck))减少体积。用PCR扩增洗脱液，并如上所述进行第二轮针对细胞的SELEX。在第3-12轮中，细胞替换成HIS标记的CD105蛋白。CD105蛋白在进行SELEX轮前与磁性抗HIS珠粒(普洛麦格)偶联。在前6轮和第12轮中，在孵化前进行了阴性选择。为此，将适体文库与“空的HIS珠粒”在无FCS的Alpha-Mem中在旋转器上孵育20分钟，然后磁分离彼此。然后将上清液(未结合的适体)与HIS-CD105(与抗His珠粒偶联)一起在旋转器上室温孵育30分钟。孵育后，用无FCS的Alpha-Mem洗涤构建体3次，用DMEM+500mM NaCl洗脱适体10分钟。用3k Amicon超速离心柱浓缩适体洗脱液，然后用于PCR。SELEX的第3-8轮针对2μg CD105蛋白质(32pmol)，第9-12轮针对1μg CD105蛋白质(16pmol)。在不同时间在80V下进行30和40分钟的琼脂糖电泳，作为SELEX的对照。PCR产物在3％琼脂糖凝胶(50ml TAE(西格玛)+1g琼脂糖(龙沙(Lonza))，并通过PEQGreen(Peqlab)在照明器下可见)。SELEX的第12轮结束后，进行最终的PCR，并且制备所获得的适体级分，用于细胞培养实验。

实施例4：用不同浓度的适体检测二维细胞培养中的CD105

脂肪细胞源性间充质干细胞(adMSC)在Tx175瓶中在Alpha-Mem(西格玛)+10％FCS(西格玛)+HEPES 12mM(西格玛)+MOPS 12mM(西格玛)+NaBi 5mM(西格玛)+0.5％PenStrep(西格玛)、37℃无CO₂的孵育器中孵育。在培养期间，每2-3天用新培养基替换细胞培养中的培养基。在75-80％汇合时，将细胞传代并转移到新的Tx175瓶中。adMSC传代至P2，并以约10000C的细胞数量接种于96孔板的孔中。作为阴性对照(非特异性结合)，将没有细胞但有培养基的单独孔孵育。

经过一周更换2次培养基后，用实施例3中制备的分析物探针进行细胞试验。所使用的分析物探针包含实施例3中选择的特异性结合CD105(检测元件)的适体以及作为识别元件的qPCR标签。

处理的适体用无FCS Alpha-Mem作系列稀释，稀释度为1:250、1:500、1:1000、1:5000、1:10000(图7)。接下来，将稀释液加热至95℃2分钟，接着在4℃5分钟。5分钟结束时，将其恢复至室温。用200μL无FCS Alpha-Mem洗涤细胞，将50μL的每种适体稀释液以一式三份加至细胞和空白孔(阴性对照/非特异性结合)中。孔板在37℃下孵育30分钟。然后用150μL无FCS Alpha-Mem洗涤培养物2次以及以每孔50μL DMEM+500mM NaCl孵育10分钟。将上清液转移到微量滴定板中保存，用箔纸密封并在4℃下储存至qPCR测定。采用25μL的批次进行qPCR，25μL批次由5μL SybrGreen 2xMastermix(西格玛)、1μL FrPrimer(10pmol/μL)、1μLRevPrimer(10pmol/μL)、17μL ddH2O、1μL洗脱液组成。95℃启动10分钟后，在95℃进行循环程序(40次)15秒，在48℃1分钟，在72℃30秒，然后在95℃运行融解曲线分析1分钟、在48℃30秒和在95℃30秒(图7)。

融解曲线分析显示了所需PCR产物(CD105适体)的峰值，然而，从1:5000稀释度开始，发现了越来越多不需要的DNA片段，这就是选择1:500稀释度的洗脱液用于实验的原因。

根据PCR结果，通过PCR(FrPrimer/biotRevPrimer)方式扩增1:500稀释度的洗脱液，作为进一步实验的分析物探针，并用链霉亲和素珠粒制备用于进一步测定。

实施例5：在连续时间内在二维和三维细胞培养物中检测CD105

脂肪细胞源性间充质干细胞在Tx175瓶中在Alpha-Mem+10％FCS+HEPES 12mM+MOPS 12mM+NaBi 5mM+0.5％PenStrep、37℃无CO₂的培养箱中培养。在培养期间，每2-3天用新培养基替换细胞培养中的培养基。在75-80％汇合时，将细胞传代并转移到新的Tx175瓶中。

在将细胞转移到ALVETEX(Reprocell公司)之前，根据生产商的说明准备板，用于细胞培养。用100μL 70％乙醇润湿ALVETEX板5分钟，然后用1xPBS洗涤2次。在最后步骤中，将100μL含FCS的Alpha-Mem移入微量滴定板的孔中，将板转移到37℃下。

传4代后，用Handystep移液管(普兰德(Brand))按约10000/孔的细胞数将细胞转移到ALVETEX和MIMETIX。

作为阴性对照(非特异性结合)，使用不含细胞但含有培养基的单独孔。作为进一步的视觉对照，在96孔板中平行地进行2D细胞培养。

每2-3天用新Alpha-Mem+10％FCS替换培养基。依次在数天中的第4天(T1)、第10天(qPCR的T2失败)、第17天(T3)和第24天(T4)对三维细胞培养物进行测定，依次在数天中的第4天(T1)、第11天(T2)和第18天(T3)对二维细胞培养物进行测定。每次测定后，进一步培养细胞，直到实验结束(第24天(3D)、第18天(2D)以及以后)。

所使用的分析物探针包含实施例3中选择的CD105适体，其特异性结合CD105(检测元件)，以及包含作为识别元件的qPCR标签。

分析物探针用无FCS的Alpha-Mem稀释1:500，并加热至95℃3分钟，然后在冰上冷却5分钟，然后可以在室温下使用。用150μL无FCS的Alpha-Mem洗涤细胞1次，向每孔转移50μL适体溶液，在37℃下孵育30分钟。然后用150μL无FCS的Alpha-Mem洗涤3-4次，去除多余的适体。结合的适体用50μL DMEM+500mM NaCl洗脱10分钟，转移到微量滴定板上保存。所述微量滴定板用箔纸密封，并在4℃下储存至qPCR。采用25μL批次进行qPCR，25μL批次由12.5μL的2倍GreenMastermix LowRox(默瑞生物(BiotechRabbit))、1μL FrPrimer(10pmol/μL)、1μL RevPrimer(10pmol/μL)、5.5μL ddH2O、5μL洗脱液组成。95℃下启动3分钟后，在95℃进行循环程序(40次)15秒、在48℃30秒、在72℃30秒，然后在95℃运行融解曲线分析1分钟、在48℃30秒和在95℃30秒(图8(二维)和图9(三维))。

融解曲线分析表明，在二维细胞培养系统(图8a)中和在三维细胞培养系统(图9a)中，CD105适体的PCR产物在所有三个测量点中都是恒定的，并且提供了关于PCR产物纯度的结论。

在实验过程中使用培养基上清液监测细胞的代谢活性。为此，在第一次测定之前和测定后一天，对培养基中的pH指示剂的颜色变化，直接地视觉上评估培养基上清液。该评估显示，根据本发明的方法，细胞的代谢活性仅受到轻微损害或完全没有受损。

实施例6：微流控

细胞培养

将细胞浓度为10⁶个细胞/mL分离自脂肪(adMSC)的间充质干细胞的冷冻管从液氮罐中取出解冻，然后接种在T瓶中。细胞在37℃/5％CO₂下孵育，每2-3天更换培养基。当约50％汇合后，用PBS和蕲蛇酶传代和重新接种。

在微流控系统的实验中，细胞在96孔板中平行培养。为此，将50000细胞/100μL的生长培养基转移到规定数量的孔中。在微流控芯片的情况下，使用显微镜用注射器将细胞悬浮液施加在芯片上。确认芯片中有细胞后，将其孵育半小时以进行附着，然后通过系统开始生长培养基的流动。在这两种系统中，细胞汇合地生长并且用含5％FBS的生长培养基替换培养基。对于阴性对照，使用仅含有5％FBS的生长培养基而不含细胞的孔和微流控室。

对照：96孔板

在开始之前，溶液被预热至室温。然后，将CD105适体探针稀释至1:500，加热至95℃3分钟，然后放置在冰上直到进一步处理。用150μL结合缓冲液洗涤细胞，用50μL稀释的探针进行处理，在37℃下孵育30分钟。然后用结合缓冲液洗涤细胞6次，并加入50μL洗脱缓冲液。在37℃下孵育10分钟后，取2μL等量试样作为qPCR测试的样品。

微流控PDMS芯片：

在使用微流控芯片之前，先如上所述制备分析物探针。所采用的分析物探针包含实施例3中选择的CD105适体(其特异性结合CD105(检测元件))，以及作为识别元件的qPCR标签。

加入各种溶液的时间如下：

10分钟-结合缓冲液

30分钟-稀释分析物探针

60分钟-结合缓冲液

10分钟-洗脱缓冲液

收集50μL洗脱液，并使用2μL作为样品用于qPCR测试。

qPCR

制备用于qPCR的MasterMix(参见表3)，从中取23μL转移到qPCR板的孔中。然后加入样品，用胶带将qPCR板密封并转移到qPCR仪。进入并启动表4中所述的程序。

表3：qPCR

表4：qPCR程序