一种优化环介导等温扩增反应的方法
阅读说明：本技术 一种优化环介导等温扩增反应的方法 (Method for optimizing loop-mediated isothermal amplification reaction ) 是由 王玉兰 滕新栋 付汝坤 杨慧丽 鲍春晓 于 2020-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,公开了一种优化环介导等温扩增反应的方法,所述优化环介导等温扩增反应的方法包括以下步骤：取石墨烯量子点、碳纳米管进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备；依据扩增需求进行待扩增物的选择,通过待扩增物的信息进行扩增引物的设计,同时依照获取的待扩增物的信息进行待扩增物体积与扩增条件进行设定,后进行环介导等温扩增反应体系的建立；将优化环介导等温扩增反应的扩增物加入到建立的环介导等温扩增反应体系中,进行核酸的扩增,制备得到核酸反应体系。本发明能够实现对环介导等温扩增反应体系的优化,对环介导等温扩增的优化效果更好,同时本发明的操作简单,优化效果好,适用于分子检测等使用。(The invention belongs to the technical field of biology, and discloses a method for optimizing a loop-mediated isothermal amplification reaction, which comprises the following steps: preparing an amplification product of an optimized loop-mediated isothermal amplification reaction by taking the graphene quantum dots and the carbon nano tubes; selecting a substance to be amplified according to the amplification requirement, designing an amplification primer according to the information of the substance to be amplified, setting the volume of the substance to be amplified and the amplification condition according to the acquired information of the substance to be amplified, and then establishing a loop-mediated isothermal amplification reaction system; and adding the amplification product of the optimized loop-mediated isothermal amplification reaction into the established loop-mediated isothermal amplification reaction system to amplify the nucleic acid to prepare the nucleic acid reaction system. The invention can realize the optimization of the loop-mediated isothermal amplification reaction system, has better optimization effect on the loop-mediated isothermal amplification, has simple operation and good optimization effect, and is suitable for molecular detection and the like.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种优化环介导等温扩增反应的方法。
背景技术
目前：环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，缩写为LAMP)是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术，可以广泛应用于食品安全检测等领域。该技术灵敏度高，在等温条件下扩增15min-1h即可产生109～1010倍的扩增子，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何优化环介导等温扩增反应，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，一直是该技术领域急需解决的技术难题。
石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots)一般是横向尺寸在100nm以下，纵向尺寸在几个纳米以下，具有一层、两层或者几层的石墨烯结构，具有生物低毒性、优异的水溶性、化学惰性、稳定的光致发光、良好的表面修饰等特性，在生物、医学、材料、新型半导体器件等领域具有重要潜在应用。但是现有技术中进行石墨烯量子点用于环介导等温扩增反应的优化的方案对环介导等温扩增的优化效果较差，且操作复杂。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中进行石墨烯量子点用于环介导等温扩增反应的优化的方案对环介导等温扩增的优化效果较差，且操作复杂。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法。
本发明是这样实现的，一种优化环介导等温扩增反应的方法，所述优化环介导等温扩增反应的方法包括以下步骤：
步骤一，分别制备石墨烯量子点、碳纳米管，按照质量份数称取石墨烯量子点8-12份、碳纳米管2-3份作为进行优化环介导等温扩增反应的扩增物制备的原料，对石墨烯量子点进行纯化处理；
所述对石墨烯量子点进行纯化处理包括：
(1.1)室温下，将初始石墨烯量子点溶液与分子筛以一定比例混合得到反应物；
(1.2)将所述反应物进行离心得到含有石墨烯量子点的石墨烯量子点-分子筛；
(1.3)向所述石墨烯量子点-分子筛中加入脱附剂，在70～100℃的条件下脱附出石墨烯量子点；
步骤二，对碳纳米管进行纯化处理，并将纯化处理后的石墨烯量子点和碳纳米管粉末分别进行初步粉碎；对初步粉碎后的石墨烯量子点进行球磨，得到粒径＜800nm的石墨烯量子点粉末，对粉碎后的碳纳米管进行球磨，得到粒径＜200μm的碳纳米管粉末，收集球磨处理后得到的石墨烯量子点粉末与碳纳米管粉末并进行混合，得到混合物；
所述对碳纳米管进行纯化处理，包括：
在碳纳米管生长区域加沿碳纳米管生长方向的平行磁场，使磁场与磁性纳米颗粒相互作用进而使磁性纳米颗粒受到生长方向的磁场力，磁性纳米催化剂颗粒在磁场力的作用下带动碳纳米管定向生长，得到纯化后的碳纳米管；
步骤三，将处理后得到的混合物分散在去离子水中，进行加热、析出处理，进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备，得到优化环介导等温扩增反应的扩增物；
所述进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备，包括：
(3.1)将处理后得到的混合物置于去离子水中，进行超声分散；
(3.2)待水中的固态物质分散均匀后，对水溶液进行加热；
(3.3)加热结束后对水溶液进行充分搅拌，静置1-2h；
(3.4)对静置后的水溶液进行迅速降温，得到优化环介导等温扩增反应的扩增物；
步骤四，依据扩增需求进行待扩增物的选择，并对待扩增物的特性进行查阅，通过获取的待扩增物的信息进行扩增引物的设计，同时依照获取的待扩增物的信息进行待扩增物体积与扩增条件进行设定，后进行环介导等温扩增反应体系的建立；
步骤五，将优化环介导等温扩增反应的扩增物加入到建立的环介导等温扩增反应体系中，进行环介导等温扩增反应体系的初步反应，待扩增反应开始后，再次向环介导等温扩增反应体系中加入优化环介导等温扩增反应的扩增物，进行核酸的扩增，制备得到核酸反应体系，完成对环介导等温扩增反应的优化。
进一步，步骤一中，所述石墨烯量子点的制备方法为：
(1)称取柠檬酸固体并对其进行研磨，得到柠檬酸粉末；
(2)将柠檬酸粉末加入坩埚中进行高温加热；
(3)加热结束后，取出坩埚内的固体物，加入过量的超纯水，对固体物进行超声溶解；
(4)待固体物充分溶解后，对混合液进行抽滤，除去液体即得石墨烯量子点，常温下避光保存。
进一步，步骤(2)中，所述高温加热的加热温度为160-290℃，加热时间为35-50min。
进一步，步骤一中，所述碳纳米管的制备方法为：
(1)选择一具有两相对表面的基底；
(2)在基底上旋涂一磁性流体，在基底的两相对表面形成一催化剂层；
(3)将基底的两相对表面形成有催化剂层的基底装载于一化学气相沉积反应腔内；
(4)向所述反应腔内通入碳源气，进行化学气相沉积生长碳纳米管。
进一步，步骤(2)中，所述催化剂层的厚度为300-800nm。
进一步，步骤(3.1)中，所述超声频率为50-55kHz。
进一步，步骤(3.2)中，所述设定加热温度为90-100℃，加热时间为8-12min；
进一步，步骤四中，所述通过获取的待扩增物的信息进行扩增引物的设计，包括：
(1)通过获取的待扩增物的信息设计出多个上游引物和下游引物；
(2)排除设计的引物中敏感性和特异性低于设定阈值的单向引物；
(3)对排除操作后剩余的上游引物和下游引物互相配对，产生引物对，排除不合理的及敏感性和特异性较低的引物对；
(4)计算剩余各引物对的P值，进行聚类分析，取出每类中P值最小的引物对作为设计得到的扩增引物。
进一步，所述敏感性阈值为0.5-0.9和特异性阈值为0.5-0.9。
进一步，步骤五中，所述优化环介导等温扩增反应的扩增物的总添加量为环介导等温扩增反应体系的1/20。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明使用石墨烯量子点、碳纳米管进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备，得到的石墨烯量子点、碳纳米管进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备能够实现对环介导等温扩增反应体系的优化，对环介导等温扩增的优化效果更好，同时本发明的操作简单，优化效果好，适用于分子检测等使用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的优化环介导等温扩增反应的方法的流程图。
图2是本发明实施例提供的石墨烯量子点的制备方法的流程图。
图3是本发明实施例提供的碳纳米管的制备方法的流程图。
图4是本发明实施例提供的进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备的流程图。
图5是本发明实施例提供的通过获取的待扩增物的信息进行扩增引物的设计的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的优化环介导等温扩增反应的方法包括以下步骤：
S101，按照质量份数称取石墨烯量子点8-12份、碳纳米管2-3份作为进行优化环介导等温扩增反应的扩增物制备的原料，分别对石墨烯量子点和碳纳米管进行纯化处理，并将纯化处理后的石墨烯量子点和碳纳米管粉末分别进行初步粉碎；
S102，对初步粉碎后的石墨烯量子点进行球磨，得到粒径＜800nm的石墨烯量子点粉末，对粉碎后的碳纳米管进行球磨，得到粒径＜200μm的碳纳米管粉末，收集球磨处理后得到的石墨烯量子点粉末与碳纳米管粉末并进行混合，得到混合物；
S103，将处理后得到的混合物分散在去离子水中，进行加热、析出处理，进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备，得到优化环介导等温扩增反应的扩增物；
S104，依据扩增需求进行待扩增物的选择，并对待扩增物的特性进行查阅，通过获取的待扩增物的信息进行扩增引物的设计，同时依照获取的待扩增物的信息进行待扩增物体积与扩增条件进行设定，后进行环介导等温扩增反应体系的建立；
S105，将优化环介导等温扩增反应的扩增物加入到建立的环介导等温扩增反应体系中，进行环介导等温扩增反应体系的初步反应，待扩增反应开始后，再次向环介导等温扩增反应体系中加入优化环介导等温扩增反应的扩增物，进行核酸的扩增，制备得到核酸反应体系，完成对环介导等温扩增反应的优化。
如图2所示，步骤S101中，本发明实施例提供的石墨烯量子点的制备方法为：
S201，称取柠檬酸固体并对其进行研磨，得到柠檬酸粉末；
S202，将柠檬酸粉末加入坩埚中进行高温加热；
S203，加热结束后，取出坩埚内的固体物，加入过量的超纯水，对固体物进行超声溶解；
S204，待固体物充分溶解后，对混合液进行抽滤，除去液体即得石墨烯量子点，常温下避光保存。
步骤S202中，本发明实施例提供的高温加热的加热温度为160-290℃，加热时间为35-50min。
本发明实施例提供的对石墨烯量子点进行纯化处理包括：室温下，将初始石墨烯量子点溶液与分子筛以一定比例混合得到反应物；将所述反应物进行离心得到含有石墨烯量子点的石墨烯量子点-分子筛；向所述石墨烯量子点-分子筛中加入脱附剂，在70～100℃的条件下脱附出石墨烯量子点。
如图3所示，步骤S101中，本发明实施例提供的碳纳米管的制备方法为：
S301，选择一具有两相对表面的基底；
S302，在基底上旋涂一磁性流体，在基底的两相对表面形成一催化剂层；
S303，将基底的两相对表面形成有催化剂层的基底装载于一化学气相沉积反应腔内；
S304，向所述反应腔内通入碳源气，进行化学气相沉积生长碳纳米管。
步骤S302中，本发明实施例提供的催化剂层的厚度为300-800nm。
步骤S101中，本发明实施例提供的对碳纳米管进行纯化处理，包括：在碳纳米管生长区域加沿碳纳米管生长方向的平行磁场，使磁场与磁性纳米颗粒相互作用进而使磁性纳米颗粒受到生长方向的磁场力，磁性纳米催化剂颗粒在磁场力的作用下带动碳纳米管定向生长，得到纯化后的碳纳米管。
如图4所示，步骤S102中，本发明实施例提供的进行优化环介导等温扩增反应的扩增物的制备，包括：
S401，将处理后得到的混合物置于去离子水中，设定超声频率为50-55kHz进行超声分散；
S402，待水中的固态物质分散均匀后，对水溶液进行加热，设定加热温度为90-100℃，加热时间为8-12min；
S403，加热结束后对水溶液进行充分搅拌，静置1-2h；
S404，对静置后的水溶液进行迅速降温，得到优化环介导等温扩增反应的扩增物。
如图5所示，步骤S104中，本发明实施例提供的通过获取的待扩增物的信息进行扩增引物的设计，包括：
S501，通过获取的待扩增物的信息设计出多个上游引物和下游引物；
S502，排除设计的引物中敏感性和特异性低于设定阈值的单向引物；
S503，对排除操作后剩余的上游引物和下游引物互相配对，产生引物对，排除不合理的及敏感性和特异性较低的引物对；
S504，计算剩余各引物对的P值，进行聚类分析，取出每类中P值最小的引物对作为设计得到的扩增引物。
本发明实施例提供的敏感性阈值为0.5-0.9和特异性阈值为0.5-0.9。
步骤S105中，本发明实施例提供的优化环介导等温扩增反应的扩增物的总添加量为环介导等温扩增反应体系的1/20。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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