一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法
阅读说明：本技术 一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法 (Preparation method of spider-web-shaped self-assembly functional nucleic acid hydrogel ) 是由 许文涛 黄昆仑 宋欢 张洋子 于 2021-02-03 设计创作，主要内容包括：本发明建立了一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法。该方法在自组装功能核酸水凝胶的基础上,引入靶标响应单元,通过包埋物的可控释放实现了靶标的可视化检测。本发明通过软刷子水凝胶与DNA超级三明治结构间的自组装增加了DNA双链区域,提高了水凝胶网络的刚性,同时为包埋物提供了嵌合位点；微观形态上呈纳米花相互交联形成的蜘蛛网状结构,且交联密度与纳米花的粒径大小可通过探针与DNA超级三明治结构的浓度以及施加的离心力进行调节。本发明所构建的蜘蛛网状功能核酸水凝胶制备方法具有速度快,形貌可控,靶标响应,包埋物可控释放且通用性强等优点,在包括分子检测、药物装载与递送等方面,具有非常好的应用前景。(The invention provides a preparation method of a spider-web-shaped self-assembly functional nucleic acid hydrogel. According to the method, a target response unit is introduced on the basis of self-assembly of the functional nucleic acid hydrogel, and the visual detection of the target is realized through the controllable release of the embedding substance. According to the invention, the self-assembly between the soft brush hydrogel and the DNA super sandwich structure increases the DNA double-chain area, improves the rigidity of the hydrogel network, and provides a chimeric site for an embedded object; the microscopic morphology is a spider-web structure formed by the mutual cross-linking of the nanoflowers, and the cross-linking density and the particle size of the nanoflowers can be adjusted by the concentration of the probe and the DNA super sandwich structure and the applied centrifugal force. The preparation method of the spider web-shaped functional nucleic acid hydrogel constructed by the invention has the advantages of high speed, controllable appearance, target response, controllable release of embedded substances, strong universality and the like, and has good application prospects in the aspects of molecular detection, drug loading and delivery and the like.)
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法。
背景技术
传统的核酸水凝胶制备方法多依赖于通过人工合成高浓度寡核苷酸链经互补配对形成基础单元结构再进一步自组装搭建成交联的水凝胶网络。该方法操作繁琐，核酸消耗量大，依赖于精密仪器，合成成本较高。获得的核酸水凝胶一方面微观形貌单一，并且在制备过程中难以调控其大小及形貌结构；另一方面，由于基础单元结构简单，因此通过传统方法制备核酸水凝胶在功能设计上难以创新，从而导致其应用受限。滚环扩增（RCA）技术由于可产生长核酸链并在反应过程中形成具有微观纳米花结构水凝胶状产物而成为了一种经济、有效的核酸水凝胶制备策略，克服了传统方法中核酸消耗量大，人工合成DNA链长度受限的问题。然而，目前基于RCA技术制备核酸水凝胶在机械强度提升、功能性增强以及微观形貌可控等方面的研究仍十分有限。
发明内容
本发明建立的核酸水凝胶制备的新方法，克服了现有水凝胶制备方法的不足，实现了快速、简单高效、形貌可控、靶标响应、包埋物可控释放的核酸水凝胶的制备。
本发明的一个目的是提供一种制备方法，所述方法基于一种体外恒温核酸扩增技术，所述体外恒温核酸扩增技术的反应体系包括锁式探针和连接引物，其特征在于，所述锁式探针的5’端经过磷酸化修饰且含有与连接引物互补的区域；所述连接引物能够与锁式探针的5’端和3’端杂交形成2段相邻的碱基互补配对区域；
所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。
所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。
所述连接酶包括可用于体外核酸扩增技术的连接酶。
所述扩增反应体系中的序列包括现有技术或公知常识所定义的序列，公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。
所述方法还包括下述1）-3）中的至少一种：
1）所述体外核酸扩增技术包括滚环扩增反应，所述滚环扩增反应的反应过程包括：连接反应和扩增反应两部分；
2）所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交的过程，反应过程包括：80～100℃，5～10min，缓慢降温；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板的过程，反应过程包括：16～30℃，20min～3h；
3）所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增的过程，反应过程包括：30～37℃，10h～30h。
4）所述锁式探针包括具长链结构且5’端经过磷酸化修饰的化合物。
再具体的，5’端磷酸化修饰的化学结构为：
具体的，所述方法还包括下述1）-6）中的至少一种：
1）所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；
2）所述连接引物包括序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
3）所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；
4）所述连接引物包括将序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
5）所述滚环扩增反应的产物经琼脂糖电泳分析得到大于5000bp的DNA长单链；
6）所述滚环扩增反应的产物呈具有一定粘弹性的水凝胶状态。
本发明的另一个目的是提供一种制备方法，所述方法包括蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备，所述蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备体系包括RCA产物、一对L型探针A、B以及一对探针1、2。所述A、B和1、2只用于区别不同的互补序列，不用于排序。
本发明的另一个目的是提供一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法，包括长单链DNA产物，一对L型探针A、B，以及一对探针1、2；
所述长单链DNA产物与L型探针A、B能够自组装成具有纳米花微观结构的软刷子DNA水凝胶；
所述探针1、2能够通过互补配对形成DNA超级三明治结构，并与软刷子DNA水凝胶通过物理相互作用进一步组装形成嵌有纳米花的蜘蛛网状微观结构，最终形成蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶。
可选的，上述制备方法中，所述蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶可在加入靶标时发生解组装，所述靶标为探针1的核酸适配体序列对应结合的靶标。
可选的，上述制备方法中，所述一对L型探针A、B具有如下结构：
1）所述L型探针A、B序列包括与RCA长单链DNA产物的互补区域和非互补区域；
2）所述L型探针A序列中的互补区域是与RCA长单链DNA产物中各单元序列任意互补且长度为20nt的核酸序列；
3）所述L型探针B序列中的互补区域是与RCA长单链DNA产物中各单元序列任意互补、长度为20nt且与A无重复的核酸序列；
4）所述L型探针A、B序列中的非互补区域是与RCA长单链DNA产物不发生结合且与探针2完全相同的非互补核酸序列；
5）所述L型探针A序列是由5’端至3’端方向，按照非互补区域至互补区域的顺序排列的核酸序列；
6）所述L型探针B序列是由5’端至3’端方向，按照互补区域至非互补区域的顺序排列的核酸序列。
可选的，上述制备方法中，所述探针1具有如下结构：
1）所述探针1序列为一段可结合特定靶标的特异性核酸适配体序列，包括A、B两部分序列，二者长度相同或相差1nt，且长度之和为探针1序列长度；
2）所述探针1序列是由5’端至3’端方向，按照序列A至序列B的顺序排列的核酸序列；
3）所述探针1的特异性核酸适配体序列使蜘蛛网状水凝胶具有靶标响应性和通过解组装可控释放包埋物的效果。
可选的，上述制备方法中，所述探针2具有以下结构：
1）所述探针2序列为靶标的特异性核酸适配体序列，包括分别与探针1中A、B序列互补的C、D序列，C、D序列长度之和为探针2序列长度；
2）所述探针2序列是由5’端至3’端方向，按照序列C至序列D的顺序排列的核酸序列，其中C序列与探针1的B序列长度相同，即B、C序列完全互补；D序列比A序列在3’端方向增多至少1nt长度，即A、D序列互补后与B、C互补区域之间存在至少1nt的间隔区域。
可选的，上述制备方法中，所述L型探针A、B，探针1、2为如下序列：
1）所述L型探针A包括序列表中的SEQ ID NO：3所示核酸序列和/或SEQ ID NO：3所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
2）所述L型探针B包括序列表中的SEQ ID NO：4所示核酸序列和/或SEQ ID NO：4所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
3）所述探针1包括序列表中的SEQ ID NO：5所示核酸序列和/或SEQ ID NO：5所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
4）所述探针2包括序列表中的SEQ ID NO：6所示核酸序列和/或SEQ ID NO：6所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
可选的，上述制备方法中，其特征在于，所述蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法还包括以下步骤：
1）在L型探针与RCA产物进行自组装之前，需要先将RCA产物的水凝胶状态通过搅拌的方式进行扰乱，直到RCA产物的粘弹性消失；
2）将L型探针加入到搅拌之后的RCA产物中，通过1分钟的短时间搅拌方式使L型探针与RCA产物进行部分互补杂交。
另一方面，本发明中上述所述探针1可以是ATP特异性核酸适配体序列，也可以是任意的核酸适配体序列。任意核酸适配体序列包括多种途径筛选获得的，能够和靶标特异性结合的核酸适配体序列。探针1选用任意的核酸适配体序列，与上述对应结构的探针2结合，当不存在特异性靶标时，探针1与探针2 能够完成蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶；当存在特异性靶标时，探针1能够与靶标特异性结合，使蜘蛛网状水凝胶发生解组装，释放包埋物。
即本发明的蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的应用，可通过靶标与其特异性核酸适配体序列相结合导致水凝胶网络解组装，从而实现水凝胶中荧光染料、药物等包埋物的释放。进一步的，本发明的水凝胶可通过靶标响应释放包埋物进行可视化检测。进一步的，本发明的水凝胶在分子检测、药物装载与递送的应用。
因此核酸适配体的限制并非仅局限于本申请实施例中的ATP适配体，其他核酸适配体同样可通过自组装作用，以及与靶标的结合达到对蜘蛛网状水凝胶的自组装以及可控释放。
本发明的再一个目的是提供一种制备方法，所述方法包括对蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶中包埋物的装载及纯化，其特征在于，通过靶标响应释放包埋物进行可视化检测，同时去除制备过程中核酸扩增反应体系引入的复杂组分和装载后多余的包埋物。
具体的，所述制备方法还包括下述步骤：
1）将包埋物水溶液与透明的蜘蛛网状DNA水凝胶在混匀仪中常温避光孵育，转速为150 rpm，孵育时间为90 min，随后将上清和胶体分离；
2）将分离出的蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶浸入ddH2O中一定时间；
3）去除上清，剩下即为纯化后的蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶。
本发明的有益效果包括：
1、本发明在通过RCA获得的DNA长单链与L型探针快速自组装形成软刷子DNA水凝胶的基础上，引入经探针1、2互补配对形成的DNA超级三明治结构，通过进一步高效自组装形成了嵌有DNA纳米花的蜘蛛网状新型微观结构；
2、本发明因引入的DNA超级三明治结构而增加了具有刚性的DNA双链结构，显著改善DNA水凝胶的机械强度，并为染料、药物等包埋物提供了嵌合位点；
3、本发明中引入的探针1可以根据分析检测需要，改换成其他靶标特异性核酸适配体序列，在靶标加入时，通过靶标与其特异性核酸适配体间的强亲和力作用，导致水凝胶内染料、药物等包埋物的释放，并通过加入靶标的浓度实现包埋物的可控释放；
4、本发明通过调节探针与DNA超级三明治结构的浓度以及施加的离心力可实现蜘蛛网微观结构的交联致密度。
附图说明
图1为蜘蛛网状DNA水凝胶的自组装原理以及高速离心对水凝胶的影响。（A）由RCA产物与L型探针A、B自组装形成的软刷DNA水凝胶；（B）基于软刷DNA水凝胶和DNA超级三明治结构（由一对探针1、2经互补配对自发形成）自组装形成的蜘蛛网状DNA水凝胶；（C）在高速离心下，蜘蛛网状DNA水凝胶被破坏。
图2为高速离心前（A）、后（B）的蜘蛛网状DNA水凝胶。
图3为通过（A）琼脂糖凝胶电泳，（B-C）激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）和（D-I）扫描电子显微镜（SEM）证明RCA产物和DNA超级三明治结构之间的交联状态以及高速离心的影响（比例尺=2μM）。
图4为高速离心前（A）、后（B）蜘蛛网状DNA水凝胶的微观结构（比例尺=2μM）。
图5为L型探针A、B和DNA超级三明治结构的浓度对蜘蛛网状DNA水凝胶的微观结构（A-H）和流变学性质（I-L）的影响。
图6为ATP响应型蜘蛛网状DNA水凝胶示意图。（A）ATP响应型蜘蛛网状DNA水凝胶的制备。（B）装载亚甲基蓝（MB）的蜘蛛网状DNA水凝胶。（C）ATP触发蜘蛛网状DNA水凝胶的解组装和包埋物的可控释放。
图7为蜘蛛网状DNA水凝胶的MB装载和洗涤步骤。（A）蜘蛛网状DNA水凝胶的原始状态；（B）蜘蛛网状DNA水凝胶分别与MB孵育0min和90min；（C）将装载了MB的蜘蛛网状DNA水凝胶浸入ddH2O中进行洗涤；（D）装载了MB的蜘蛛网状DNA水凝胶的洗涤后状态。
图8为ATP触发MB从蜘蛛网状DNA水凝胶中释放。（A）蜘蛛网状DNA水凝胶装载MB并用ddH2O洗涤。（B）蜘蛛网状DNA水凝胶中装载的MB分别在0 mM（左）或80 mM ATP（右）以及不同反应时间（包括6s、1min和3min）内的释放过程。（C）蜘蛛网状DNA水凝胶与ATP孵育20分钟。（D）从（C）中的样品中分离上清液和DNA水凝胶。
图9为时间（A-C）和ATP浓度（D-F）对MB从蜘蛛网状DNA水凝胶中释放的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下所述实施例进一步说明本发明的内容和实施方式，其描述较为具体和详细，但不应理解为对本发明专利范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围之内。
实施例1、蜘蛛网状DNA水凝胶的制备与表征
（一）实验材料
本实施例所采用的实验试剂信息见表1，所设计的引物的核苷酸序列见表2和序列表。
除表1中实验试剂外，实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。
表2中，锁式探针的5’端经磷酸化修饰，其化学结构为：
表2中，下划线标注的序列表示RCA产物与L型探针杂交后剩下的游离序列。游离序列的核苷酸数标注在括号中。
表2所列的序列均为人工合成。
（二）RCA反应
1）连接反应
RCA反应的第一步是将锁式探针在连接引物的辅助下经T4连接酶作用连接形成环型扩增模板。滚环扩增连接体系组成如下（表3）所示。首先，将表3中的组分混合后置于PCR仪中90℃加热5 min，以1˚C/min的速度缓慢冷却到室温。随后，加入2μL T4 DNA 连接酶（40U/μL）于以上体系中，用枪头轻轻吹吸混匀，于室温孵育1 h。
2）扩增反应
RCA反应的第二步是将连接产物在phi29 DNA聚合酶以及dNTPs的作用下进行滚环扩增反应从而获得大量长单链DNA（single-strand DNAs，ssDNAs）扩增产物。滚环扩增反应的扩增体系组成如下（表4）所示。首先，将表4中的组分混合后于30℃下孵育24 h。随后，于65℃孵育10 min使phi29 DNA聚合酶失活以终止扩增反应。
（三）蜘蛛网状DNA水凝胶的交联
首先用枪头搅拌RCA产物以破坏其预凝胶状态，直至粘弹性消失。如图1A、B所示，通过与6 μL 100 μM的L型探针A、B进行1分钟搅拌以形成软刷DNA水凝胶并用ddH2O洗涤。然后，加入6 μL 100 μM的探针1、2继续搅拌1min以获得蜘蛛网状DNA水凝胶。
（四）蜘蛛网状DNA水凝胶的表征
通过光学照片、琼脂糖凝胶电泳、CLSM、以及SEM四种方式对制备的蜘蛛网状DNA水凝胶进行表征。
1）光学照片记录蜘蛛网状DNA水凝胶的宏观形态
如图2A所示，蜘蛛网状DNA水凝胶呈现出均匀胶束的状态。从移液器的枪头中释放时，呈粗细均匀的胶束状，粘弹性较大。
2）琼脂糖凝胶电泳验证蜘蛛网状DNA水凝胶的形成
将用于制备蜘蛛网状DNA水凝胶的探针2替换成经FAM荧光标记的探针2，按照相同步骤制备出具有FAM荧光标记的蜘蛛网状DNA水凝胶，以指示DNA超级三明治结构的形成以及在蜘蛛网状DNA水凝胶中的作用。
琼脂糖凝胶电泳结果证明了DNA超级三明治结构与RCA产物之间的交联（图3A）。泳道1底部的扩散条带表明DNA超级三明治结构是由探针1和FAM-探针2形成的，若不添加L型探针A、B则无法与RCA产物连接。加入L型探针A、B后，实现了DNA超级三明治结构与RCA产物的结合，由于形成的核酸结构足够大，样品会直接困在第3泳道的孔中，呈现出明亮的条带。
3）CLSM验证蜘蛛网状DNA水凝胶的形成
如图2B所示，不同大小的分离绿色区域证明了纳米花通过L型探针被DNA超级三明治结构覆盖（图3B），这与没有加入L型探针A、B的对照样品所呈现的大量游离绿色圆点图像相比差别十分明显（图3C）。说明蜘蛛网状DNA水凝胶的构建对RCA产物，L型探针A、B，以及探针1、2缺一不可。
4）SEM表征蜘蛛网状DNA水凝胶的微观结构
先将样品用液氮进行快速冷冻，然后放入冷冻干燥仪完全干燥。在20 mA的条件下喷铂6 min，并以5 kV电压进行电镜扫描。
如图3D所示，在RCA反应24h后，观察到许多直径为1-2μm的纳米花结构。另一方面，在探针1、2组装形成DNA超级三明治结构中获得了许多弯曲的纤维状结构（图3G）。通过将24h RCA产物与形成的DNA超级三明治结构混合，纳米花随机散布在弯曲的纤维上（图3E）。进一步将L型探针A、B添加到RCA产品和超三明治的混合物中，实现相互交联并充当混合物之间的桥梁。因此，微观形貌上弯曲的纤维被拉直并与纳米花交联形成规则的网状结构，如蜘蛛网（图3F和图4A）。
实施例2、蜘蛛网状DNA水凝胶的微观形貌控制
主要通过两种方式对蜘蛛网状DNA水凝胶的微观形貌进行控制：一是高速离心；二是调整L型探针和DNA超级三明治结构的浓度。
（一）高速离心对蜘蛛网状DNA水凝胶的影响
1）高速离心处理蜘蛛网状DNA水凝胶
将制备的蜘蛛网DNA水凝胶浸入500μL ddH2O中5min，然后以16000 g离心10min并除去上清液部分。
2）光学照片记录高速离心对蜘蛛网状DNA水凝胶宏观形态的影响
高速离心后，直接观察蜘蛛网DNA水凝胶呈不均匀的凝胶质地，另外从移液器枪头中释放出来时，能够更清楚观察到DNA水凝胶的凝胶滴为不均匀的胶束（图2B），说明高速离心会破坏蜘蛛网状DNA水凝胶的网络结构（图1C）。
3）琼脂糖凝胶电泳表征高速离心对蜘蛛网状DNA水凝胶结构的影响
对泳道1和泳道3中的样品进行高速离心后，形成DNA超级三明治结构所对应的扩散条带几乎消失（图3A，泳道2和泳道4），说明高速离心会破坏蜘蛛网状DNA水凝胶的交联网络。
4）SEM表征高速离心对蜘蛛网状DNA水凝胶微观结构的影响
将24h RCA产物与DNA超级三明治结构形成的混合物进行高速离心处理后，微观上弯曲纤维减少（图3H）。同样，对获得的蜘蛛网状DNA水凝胶进行高速离心处理后，发现水凝胶网络结构被分解成短纤维（图3I）。同时，纳米花从网络结构上脱落，不同纳米花之间的断裂纤维如图4B所示。由此表明，RCA产物与DNA超级三明治结构之间的交联是通过L型探针A、B实现的，并且在高速离心等外力下易被破坏。
（二）L型探针和DNA超级三明治结构浓度对蜘蛛网状DNA水凝胶的影响
1）SEM表征DNA超级三明治结构浓度对蜘蛛网状DNA水凝胶微观结构的影响
DNA超级三明治结构的浓度为50μM时，形成的蜘蛛网状DNA水凝胶的微观结构中粗糙和不规则表面的纤维往往会变短并粘在一起（图5A）。当浓度达到100μM时，纤维变得光滑，分离并拉长（图5B）。进一步将DNA超级三明治结构的浓度提高到150μM（图5C）和300μM（图5D）后，纤维的交联度和平均直径显着增加。纤维变粗且更加肿胀，导致不同纤维之间的狭窄空间增加（图5D）。
2）SEM表征L型探针浓度对蜘蛛网状DNA水凝胶微观结构的影响
随着L型探针和DNA超级三明治结构的浓度从50μM增加到300μM，交联网络的密度和纤维直径明显增加（图5E-H），如不同纤维之间的间隙从16.3μm减小到3.2μm。此外，当L型探针和DNA超级三明治结构的浓度达到300μM时，纤维会非常弯曲，如图3H所示。因此，L型探针和DNA超级三明治结构的浓度显着影响蜘蛛网状DNA水凝胶的内部结构。
3）流变学测试表征L型探针和DNA超级三明治结构的浓度对蜘蛛网状DNA水凝胶机械强度的影响
按照表5设置流变学测试的参数。
比较了不同浓度的DNA超级三明治结构对蜘蛛网状DNA水凝胶的流变学性质的影响，发现其储能模量（G'）在25°C时随浓度的增加而增加，证明了弹性会因DNA超级三明治结构的浓度而改变（图5I-L）。在所有样品中，G'随频率的增加而逐渐增加（图5J），而随着应变的降低而逐渐降低（图5K）。如图5L所示，当温度超过45℃时，G'迅速降低，表明该温度是凝胶到溶胶的转变点。同时，随着温度从25°C升高到75°C，G'分别降低了33.2％（300μM），30.9％（100μM）和19.4％（0μM）。这表明高温会破坏网络结构，导致水凝胶的机械性能下降。由此表明，DNA超级三明治结构在蜘蛛网状DNA水凝胶的网络结构中起重要作用，并通过L型探针与RCA产物交联来增强水凝胶的弹性。
实施例3、ATP响应型蜘蛛网状DNA水凝胶中包埋物的可控释放
预先设计的超级三明治由ATP适配体（探针1）及其互补的单链DNA（探针2）组成，为包埋物装载和ATP响应释放提供了可靠的加载位点（图1和图6）。如图6A所示，蜘蛛网状DNA水凝胶具有可在管中自由流动的类液体性质。然后，选取了阳离子染料MB装载进蜘蛛网状DNA水凝胶中的ATP响应性DNA超级三明治双链体中。随后，蜘蛛网状DNA水凝胶的体积显着收缩并变成小的盘状固体（图6B）。在存在ATP的情况下，探针1和ATP之间的亲和力比探针1/探针2结构的稳定性强，这导致探针1 / ATP的特异性结合并释放探针2，最终导致水凝胶解组装（图6C）。
（一）实验材料
本实施例所采用的实验试剂信息见表6。
表6
实验试剂 厂家 级别 ATP 索莱宝 生物试剂 MB Sigma 生物试剂
除表6中实验试剂外，实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。
（二）ATP响应型蜘蛛网状DNA水凝胶中MB的包埋与释放
1）蜘蛛网状DNA水凝胶包埋MB
将蜘蛛网状DNA水凝胶与8 mg/mLMB水溶液孵育90 min后，水凝胶的颜色由透明变为深蓝色甚至接近黑色，而原本的深蓝色的MB水溶液变为浅蓝色，表明MB从原来的水溶液成功迁移到了蜘蛛网型DNA水凝胶中，同时证明了该水凝胶对MB分子强大的吸附能力（图7A-C）。随后，对水凝胶进行了洗涤以去除多余的MB，即将水凝胶浸入到1 mL ddH2O中孵育5min，去除洗涤液，此时得到了装载有高浓度MB的蜘蛛网状DNA水凝胶（图7D）。
2）蜘蛛网状DNA水凝胶中MB的释放
在包埋了MB的蜘蛛网状DNA水凝胶中加入80 μL 0 mM和80 μL 80 mM的ATP（图8A），MB从水凝胶中释放的过程，如图8B-D所示。加入0 mMATP后，MB释放缓慢，溶液呈淡蓝色；加入80 mM ATP后，MB迅速释放，3 min后溶液颜色变为深蓝色。20 min后，加入0 mM ATP和80 mM ATP的样品溶液颜色均比3 min时更加深（图8C）。分离上清和水凝胶后，发现加入80 mM ATP的水凝胶样品体积大大减小，而加入0 mM ATP的水凝胶对照样品体积变化不大（图8D）。表明蜘蛛网状DNA水凝胶能够对ATP做出强烈的响应，同时实现了MB的可控释放。
3）ATP与蜘蛛网状DNA水凝胶的反应时间以及ATP浓度对MB可控释放的影响
首先探究了ATP与水凝胶的反应时间对MB释放的影响。将反应时间设置为2、4、6、8、10、15、20、25、30 min，反应结束后立即将上清和水凝胶分离。如图9A裸眼观察结果表明，在ATP实验组中，反应时间为2 min时，上清已经呈现出很深的蓝色，并且反应时间越长，MB的释放量越多，上清颜色越深，同时水凝胶的体积也因为DNA超级三明治结构的解体而变小。对照组相比，随着反应时间的增加，上清中的MB释放量也随之增多，但颜色远远浅于ATP实验组，并且水凝胶的体积没有发生明显变化（图9B）。为了进一步对以上现象进行定量，使用紫外分光光度计对上清进行了测量，发现加入80 mM ATP的水凝胶，在0-2 min的时间范围内，MB的释放十分迅速；在2-30 min的时间范围内，与2 min前相比，MB的释放速率减缓，但是释放速率相对平稳，且一直到30 min时依旧保持MB的释放（图9C）。相比之下，对照组的吸光值从0-15 min一直处于缓慢增加的状态，到15 min时到达平台期。以上结果说明，ATP能够刺激蜘蛛网状DNA水凝胶进行MB的释放，并且与反应时间成较强的相关性。
随后，进一步研究了ATP浓度对水凝胶中MB释放的影响。将ATP的浓度设置为0、2.5、5、10、20、40、80和160 mM，与包埋了MB的水凝胶孵育20 min（图9D）。如图9E所示，ATP浓度越高，MB的释放量越多，上清中颜色越深，水凝胶体积也就越小。对上清进行20倍稀释后利用紫外分光光度计对其吸光度进行测量，发现ATP的浓度越大，MB在吸收峰664 nm和二聚体吸收峰610 nm处的峰值也越大（图9F）。由此表明，ATP的浓度对蜘蛛网状DNA水凝胶中MB的释放产生较大影响，即可通过ATP浓度调控水凝胶中MB的释放速率和释放量。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
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