阅读说明：本技术 低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置 (Low-cost widely-adaptive centrifugal digital liquid drop generation method and device ) 是由 何赛灵 程潇羽 张文耀 贺泽玮 纪佳丽 纪长 于 2020-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置,将上层水相离心单元内嵌套在下层油相离心单元,上层水相离心单元的下部设有微米管,在离心力的作用下,上层水相克服表面张力作用通过微米管通道生成的液滴进入到下层油相中,形成尺寸均一的油包水液滴,通过调节微米管的直径和/或离心力的大小调节油包水液滴的尺寸。所述的油相中可添加有互溶激光诱导固化剂,诱导源的作用下使油相快速交联固化；应用于核酸等温扩增,实现数字化核酸扩增。本发明可生成大小均一、高质量油包水液滴。微升级的水相溶液在几分钟内即可快速产生高通量的油包水液滴,与核酸的等温扩增结合,同时可借助固化平台实现液滴的超快固化。(The invention discloses a low-cost widely-adaptive centrifugal digital liquid drop generation method and a device, wherein an upper-layer water phase centrifugal unit is nested in a lower-layer oil phase centrifugal unit, a micron tube is arranged at the lower part of the upper-layer water phase centrifugal unit, liquid drops generated by an upper-layer water phase overcoming the surface tension effect through a micron tube channel enter a lower-layer oil phase under the action of centrifugal force to form water-in-oil liquid drops with uniform size, and the size of the water-in-oil liquid drops is adjusted by adjusting the diameter of the micron tube and/or the size of the centrifugal force. The oil phase can be added with a mutual-soluble laser induction curing agent, and the oil phase is rapidly crosslinked and cured under the action of an induction source; the method is applied to nucleic acid isothermal amplification to realize digital nucleic acid amplification. The invention can generate high-quality water-in-oil droplets with uniform size. The micro-upgraded aqueous phase solution can quickly generate high-flux water-in-oil droplets within a few minutes, is combined with isothermal amplification of nucleic acid, and can realize ultra-fast solidification of the droplets by virtue of a solidification platform.)

低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置

技术领域

本发明属于分析传感领域，主要涉及低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置，可用于单分子核酸检测等。

背景技术

近年来，数字化核酸检测技术在生物检测、化学传感、医疗诊断等领域发挥具有巨大的作用。作为第三代核酸扩增方法，通过利用微液滴的技术理念将样品分配到上千万个单位中，以此将样品稀释至单分子水平。每个液滴中含有核酸或者不含核酸，经过扩增后，含有核酸的液滴有荧光信号，荧光液滴在数量上符合泊松分布。通过计数统计，可实现目标核酸等的样品的绝对定量检测。

如何有效的产生高通量、大小均一、稳定的液滴将影响最终检测的精度和灵敏性。常规的微流体技术可以产生单分散的液滴，但需要专门的仪器例如注射泵以及定制的微纳加工芯片。近年来研究的液滴发生装置中，CN109536590A提出一种基于微孔芯片的单细胞基因检测方法，但是这种多层芯片的制作繁琐，加工工序复杂。CN110841734A提出一种单泵液滴生成系统，然而注射泵引入会混合污染的风险。

此外液滴在连续油相中，在热力学上存在聚集的趋势，在PCR热循环更易出现膨胀和收缩的情况不利于实现实验的高精度，现有的解决办法有通过在油组分里添加表面活性剂如ABIL EM90，在液滴增添乳化剂以抵制液滴间的聚集碰撞局部缓解了液滴膨胀的问题。2018年和2020年牟颖课题组分别提出一种热固化和紫外光固化的方案，并有效缓解液滴膨胀的问题，但是亦存在固化时间过长的问题。

综上所述，目前公开的可用于核酸检测的液滴型数字化PCR存在以下几点问题：

1）液滴生成装置结构一般比较复杂，不易大规模推广；

2）微流芯片中泵引入了外部污染的风险；

3）液滴在加热或紫外光照过程中可能存在流动，团聚，或固化时间过长的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提出低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置。

一种低成本广适应离心式数字液滴发生方法，将上层水相离心单元内嵌套在下层油相离心单元，上层水相离心单元的下部设有微米管，在离心力的作用下，上层水相克服表面张力作用通过微米管通道生成的液滴进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴，通过调节微米管的直径和/或离心力的大小调节油包水液滴的尺寸。

所述的油相中添加有互溶激光诱导固化剂，诱导源的作用下使油相快速交联固化；应用于核酸等温扩增，实现数字化核酸扩增。

所述的油包水液滴平铺在玻片上，玻片放置在三维步进位移平台上，飞秒激光器出射的超快激光经过透镜组进行准直， 并通过SLM 投影模块出射衍射光斑或者图案，SLM投影模块位于位移平台下面，由控制器控制，光束再通过倒置显微和聚焦系统汇聚使其达到油相固化的阈值能量并缩小光斑，最终入射到油相内特定的位置，油相由于固化剂组分的多光子吸收聚合作用可瞬间固化，三维步进位移平台依次从平行方向和垂直方向扫描控制聚焦点的位置，逐层扫描平面上液滴的外部油相，最终实现液滴的快速固定。

一种采用所述的方法的装置，包括上层水相离心单元和下层油相离心单元，上层水相离心单元内嵌套在下层油相离心单元，上层水相离心单元的下部设有微米管，在离心力的作用下，上层水相克服表面张力作用通过微米管通道生成的液滴，进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴，通过调节微米管的直径和/或离心力的大小调节油包水液滴的尺寸。

所述的上层水相离心单元包括内移液枪吸头和外移液枪吸头，内移液枪吸头通过O型橡胶圈内组装在外移液枪吸头上；内移液枪吸头通过改装200μL规格的移液枪吸头得到：将200μL规格的移液枪吸头的下部1/3部分平切后用高分子聚合物封住，高分子聚合物的中心用微米管贯穿并固定在吸头内部后作为上层水相的唯一向下通道，微米管的直径为100-200μm；外移液枪吸头通过改装1000μL规格的移液枪吸头得到：将1000μL规格的移液枪吸头的下部部分平切后，与组装的移液枪吸头的微米管齐平；下层油相离心单元采用1.5ml规格离心管。

所述的微米管采用点样毛细管。

所述的高分子聚合物包括PDMS胶、环氧树脂中的一种或多种。

所述的油相包括长链油脂、乳化剂中的一种或多种。

所述的油相中添加有互溶激光诱导固化剂，诱导源的作用下使油相快速交联固化。

所述的水相样品包括核酸、蛋白、细胞、纳米颗粒中的一种或多种。

本发明的有益效果：

本发明利用了化学实验室常见的耗材如移液枪吸管、点样毛细管、高分子聚合物完成低成本的离心式液滴发生器制备，可有效产生液滴，与当前使用诸如微流体通道等特殊装置的液滴生成方法或者装置相比，本发明相对容易且所有制造过程都可以在普通实验室工作台上进行。

此外，可实现平面上液滴超快速固化：例如基于超快激光的液滴固化平台，在强脉冲激光的作用下，一些物质可同时吸收两个或者多个光子使得一个电子能级产生跃迁产生双光子效应。在油成分里添加特定可溶的具有多光子吸收特性的含有光引发剂的光刻胶，配合超快激光的诱导固化油相的作用，可实现平面上液滴快速固化的效果。

故本发明提供一种液滴发生装置的简易制备方法并在检验其应用的同时也提供了一种辅助液滴超快固化的思路和方法，通过在油相添加互溶的诱导固化剂成分，实现液滴的快速固化以便利于后续的应用和检测。

（1）本发明可生成大小均一、高质量油包水液滴。微升级的水相溶液在几分钟内即可快速产生高通量的油包水液滴，与核酸的等温扩增结合，同时可借助固化平台实现液滴的超快固化。

（2）本发明可对样品如核酸、细胞、蛋白、纳米颗粒等进行封装分配，进而结合等温扩增完成检测应用。

（3）本发明提供一种液滴超快固化的思路方法如基于超快激光多光子吸收聚合固化，实现对液滴样品的片上固定，可在减少污染的同时，防止液滴流动，适合荧光成像观测。

附图说明

图1为本发明低成本广适应离心式数字液滴发生装置的一种结构示意图。

图2为本发明在离心力作用下产生液滴的一种实施示意图。

图3为本发明装置产生的微液滴。

图4为本发明装置在6000 RCF离心力下的液滴尺寸分布图。

图5为本发明应用于金黄色葡萄球菌核酸等温扩增的实验图。

图6为本发明的一种超快液滴固化平台。

附图标记说明：O型橡胶圈1、内移液枪吸头2、高分子聚合物3、微米管4、外移液枪吸头5、1.5ml规格离心管6、水相样品7、油相8、油包水液滴9、飞秒激光器10、光学镜头组11、SLM投影模块12、控制器13、聚焦透镜组和倒置显微镜系统14、三维步进位移平台15、玻片16。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的阐述。

实施例1

本发明公开一种离心式液滴发生装置组装的一种实施方式，包括了O型橡胶圈1、200μL

内移液枪吸头2、高分子聚合物（如PDMS ）3、微米管4（点样毛细管）、1000μL外移液枪吸头5，1.5mL离心管6、水相样品7（可以为预扩增核酸混合液、细胞悬浊液等）储存在封装了PDMS和毛细管的改装移液枪吸头的内部，水相样品与毛细管相通，毛细管尺寸在100-200μm，此种尺寸下，由于表面张力的作用，水相样品不会漏出。内移液枪吸头2和外移液枪吸头5通过O型橡胶圈组装在一起，组合装置与离心管尺寸匹配卡在1.5mL离心管6上，离心管内部装有油相8，下层的油相成分可为矿物油、酯类油等，用于产生下一步的油包水液滴9。

如图2所示，在离心作用下，水相样品7有足够的离心力克服来自毛细管壁的表面张力，通过毛细管并且以小液滴的形式进入到下层油相8中形成一种油包水液滴9（微液滴），离心力大小可在2000RCF~10000RCF。最终产生尺寸均一的微液滴如图3所示，尺寸范围在40-100μm可调。10μL的样品可产生2w~3w个微液滴，抽样实验的尺寸分布如图4所示。

实施例2

可将微液滴与核酸等温扩增结合，实现数字化核酸扩增，如图5所示为一类基于微液滴的金黄色葡萄球菌的核酸环介导等温扩增的应用，该应用中，水相组分包括了目标核酸、酶、缓冲液（含MgCl₂和CaCl₂）、引物、dNTPs，钙黄绿素作为一类荧光指示剂，将样品分配至液滴中，随后等温扩增，等温扩增完成后，阴性液滴里，钙黄绿素与Mn²⁺结合并发出暗淡的荧光；阳性液滴里，反应副产物焦磷酸盐夺取与钙黄绿素结合的Mn²⁺结合，使得产生游离的钙黄绿素分子与Mg²⁺结合并发出强荧光如图5所示。通过对阳性液滴和总液滴计数，并根据泊松分布，可完成样品核酸的定量检测。

实施例3

实施例3为液滴超快固化方法实施案例的一种，可使用超快激光辅助液滴固化，下面结合附图6对本实例的一种实施方式进一步详述。

如图6所示，油包水液滴9平铺在玻片16上，玻片放置在三维步进位移平台15上，飞秒激光器10出射的超快激光经过透镜组11进行准直，并通过SLM 12出射衍射光斑或者图案，SLM模块位于位移平台下面，由控制器13控制，光束再通过倒置显微和聚焦系统14汇聚使其达到油相固化的阈值能量并缩小光斑，最终入射到油相内特定的位置，油相由于固化剂组分的多光子吸收聚合作用可瞬间固化，三维步进位移平台15依次从平行方向和垂直方向扫描控制聚焦点的位置，逐层扫描平面上液滴的外部油相，最终实现液滴的快速固定。

上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。