一种用于测定fmr1基因cgg重复序列中agg插入数量和位置的试剂盒及其使用方法
阅读说明：本技术 一种用于测定fmr1基因cgg重复序列中agg插入数量和位置的试剂盒及其使用方法 (Kit for determining AGG insertion quantity and position in CGG repetitive sequence of FMR1 gene and using method thereof ) 是由 赵立明 姜莹玉 于 2020-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法,该试剂盒包括引物群、PCR反应液、针对CGG序列的高效DNA聚合酶、FMR1基因前突变对照品、FMR1基因灰区对照品、FMR1基因正常型对照品、ROX标记和去离子水。本发明所述的试剂盒可用于高效地扩增FMR1基因5’端的CGG重复序列,并利用毛细管电泳仪对CGG重复序列中AGG数目的数量和位置进行准确判读；可以用于快速准确地查出FMR1前突变携带者CGG序列中的AGG插入的位置,更加客观而且准确地对FMR1基因前突变携带者的生育风险进行评估。(The invention discloses a kit for determining AGG insertion quantity and position in CGG repetitive sequence of FMR1 gene and a using method thereof, wherein the kit comprises a primer group, PCR reaction liquid, efficient DNA polymerase aiming at the CGG sequence, an FMR1 gene pre-mutation reference substance, an FMR1 gene gray area reference substance, an FMR1 gene normal type reference substance, ROX marker and deionized water. The kit can be used for efficiently amplifying the CGG repetitive sequence at the 5' end of the FMR1 gene, and accurately interpreting the quantity and the position of the AGG number in the CGG repetitive sequence by using a capillary electrophoresis apparatus; can be used for quickly and accurately finding out the AGG insertion position in the CGG sequence of the FMR1 pre-mutation carrier, and more objectively and accurately evaluating the fertility risk of the FMR1 pre-mutation carrier.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体来说，涉及一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法。
背景技术
脆性X综合征(OMIM#30955)是发病率仅次于唐氏综合征的第二大导致智力障碍的疾病，同时也是最常见的导致男性智力障碍的遗传病。位于X染色体长臂的脆性X智力低下1号基因(Fragile X Mental Retardation 1，FMR1)5’端非编码区存在着一段以CGG为单位的三联核苷酸重复序列。随着CGG重复次数的增加，患者可能表现出一系列的临床症状。按照临床症状和发病风险，美国医学与遗传学会(American College of Medical Geneticsand Genomics，ACMG)将CGG重复序列分为四个等级：1，6-44之间被称为非受累型；2，45-54之间称为中间型或灰区；3，55-200之间称为前突变型；4，大于200时被称为全突变型。当CGG重复数扩增至200以上时，FMR1基因5’端的CGG序列和基因上游的CpG岛被超甲基化修饰，从而导致基因转录被沉默。FMR1编码的蛋白FMRP是一类RNA绑定蛋白，在神经元细胞中作为一种通用型的调节因子，对神经突触的形成有重要作用。因此全突变者在临床上表现出重度的智力障碍和发育迟缓，常常伴随有自闭症的倾向，也被称为脆性X综合征(Fragile XSyndrome，FXS)。
FMR1基因的前突变携带者一般没有重度智力障碍的表现，但由于该基因在RNA转录和蛋白质翻译过程中起到关键的调控作用，前突变FMR1基因被认为与一系列脆性X相关的临床症状有关，包括脆性X综合征、脆性X相关的原发性卵巢功能不全(Fragile Xassociated primary ovarian insufficiency，FXPOI)、脆性X相关的共济失调(Fragile Xassociated tremor and ataxia syndrome，FXTAS)。
Tan H 2009年在《神经科学快报》中提出FMR1基因的5’端非编码区存在一段CGG重复序列，其长度与特定临床症状相关。如图1所示，当CGG重复数在55以下时(图1左侧)基因可以正常表达；当CGG重复数位于前突变区间内时(图1中部)，蛋白表达量减少促使转录量的激增，高水平的mRNA导致FXTAS/FXPOI；当CGG重复数大于200时，超甲基化引发基因沉默，患者表现出重度的智力障碍，也就是脆性X综合征。
另外，前突变型的FMR1基因在传代过程中表现出高度的不稳定。在母系遗传(maternal inheritance)中，前突变型FMR1基因的CGG序列有明显的扩增倾向，导致后代体内的CGG重复数有可能扩增至200以上，发展为全突变型(即脆性X综合征患者)。因此，针对女性前突变携带者，亟需一种能够客观、准确评估其生育风险的方法。
现有研究表明，CGG序列的扩增模式主要由三个因素决定：携带者性别、CGG长度和AGG的数量。男性携带者的CGG序列一般不出现大幅度的扩增；在女性携带者中，CGG序列的长度和扩增至全突变的风险成正比，目前观测到的在一代之内扩增至全突变的最短序列为56；除性别和长度之外，CGG序列中AGG的数量对稳定CGG序列起到了重要作用。在一般人群的CGG序列中，从5‘端开始每隔9-11个CGG会出现一个AGG，将CGG序列隔断。在野生型的FMR1基因中AGG的数量一般为2-3个，而在前突变的CGG序列中AGG的数量一般为0-2个。AGG的缺失被认为是CGG序列发生动态扩增的重要原因。
如图2所示，在CGG重复数位于50-80区段，扩增概率大幅上涨。当AGG数量被纳入到函数中时，扩增曲线随着AGG数量的增长出现明显的右移，且概率评估相较于右图更加准确。有研究证实，重复次数在50-59区段的CGG总体表现出42％的不稳定性，在没有AGG的分类中，96％表现出不稳定性；在有一个AGG的分类中，51％表现出不稳定性；而在两个AGG的分类中，仅有5％表现出不稳定性。其稳定性总体提高了19倍。
然而准确定位AGG是困难的。现在的三引物PCR(TP-PCR)可以用毛细峰中的“鸿沟”表示AGG的存在，却无法定位AGG和任一FMR1等位基因的关系。由于女性中存在两条X染色体，无法将AGG定位于具体的染色体上。如图3所示，三引物扩增法(TP-PCR)可以识别出AGG的数目，但无法确定位于哪一条染色体上。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒，包括引物群、PCR反应液、针对CGG序列的高效DNA聚合酶、FMR1基因前突变对照品(质控品)、FMR1基因正常型对照品(质控品)、ROX标记(适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段)和去离子水；
所述引物群包括在AGG处特异性退火并扩增部分FMR1基因CGG重复区的上游引物F和下游引物R，所述上游引物F序列为CGGCGGCGGCGGCGAA，如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物R序列为ACCAGCTCCTCCATCTTCTCTTCAG，如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物R的5’端标有荧光探针。
所述上游引物和FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列配对，在3’端最后一个或两个碱基的位置上和AGG引物互补配对，所述下游引物和FMR1基因非编码区3’端的序列互补配对。
进一步地，所述ROX标记(适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段)携带特定荧光基团并且能够准确分析CGG片段大小，由20条大小不同的DNA片段组成：小于100bp，1条；100bp-200bp，4条；201bp-300bp，2条；301bp-400bp，3条；401bp-500bp，2条；501bp-600bp，3条；601bp-700bp，1条；701bp-800bp，2条；901bp-1100bp，2条。
进一步地，所述ROX标记中的全部序列(DNA分子片段)的GC含量均在80％以上。
进一步地，所述PCR反应液包括：Tris盐酸、DMSO、甜菜碱或其类似物、GC-melt、氯化镁、UNG酶及特定比例的dNTPs。
进一步地，所述FMR1基因前突变对照品包括一段长度等于100个CGG重复的高GC含量DNA序列；所述FMR1基因正常型对照品包括一段长度等于30个CGG重复的高GC含量DNA序列。
进一步地，所述去离子水为经过高温灭菌的去离子水。
根据本发明的另一方面，提供了所述用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取人细胞基因组DNA，进行紫外分光定量，OD260nm/OD280nm的比值应在于1.8-2.0之间；OD260nm/OD230nm的比值应大于2.0，使用去离子水将基因组DNA浓度稀释为15-50ng/μL，然后在每个PCR管中放2μL；
(2)将FMR1基因正常型对照品和FMR1基因前突变对照品各取2μL，加入到并列的PCR管中，
(3)PCR扩增：将受检DNA样本、FMR1基因全突变质控品和FMR1基因正常型质控品和所述引物群、DNA聚合酶、PCR反应液混合形成PCR反应体系，PCR反应中引物终浓度为750nM，总反应体系为15μL，反应体系组成如下：
PCR缓冲液11.45μL，
引物3.0μL，
DNA聚合酶0.05μL，
样本DNA、FMR1基因前突变对照品或FMR1基因正常型对照品，1.0μL；
PCR反应在常规PCR仪上即可进行，扩增程序为：
98℃，5分钟，循环1次；
97℃，35秒，60℃，35秒，68℃，4分钟，循环30次；
72℃，10分钟，循环1次；
4℃，恒定，循环1次；
(4)片段分析：将PCR产物和ROX标记、HiDi甲酰胺按如下比例混合，并使用毛细管电泳仪进行分析：Hi-Di甲酰胺10μL，ROX标记1μL，PCR产物，3μL；
(5)根据基因分析仪的片段分析结果，选取信号值最高的峰作为分析对象，系统会自动记录分析对象的分子大小，标记为Peaki，将Peaki代入以下公式进行计算，得出CGGi的值，理论上，c0取值83.2，m0取值2.92，
式中，CGGi为AGG之后的CGG序列重复数，由于AGG一般出现于CGG序列5‘端第9-10位，当(CGGi+10)大于较短的CGG总长度时，该AGG位于较长的前突变序列中，反之则位于较短的野生型CGG序列上。
本发明的有益效果：
(1)本发明的用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒通过特定的引物群设计和PCR程序，可有效扩增较大片段的CGG重复序列，并清晰准确地将AGG精准定位于较长或较短的CGG序列上，实现对FMR1基因启动子的序列结构更准确分析；
(2)本发明的用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒可以帮助临床医生更好的评估女性FMR1基因前突变携带者的生育风险，避免不必要的产前诊断风险，防止不必要的高危妊娠，可用于FMR1基因筛查，产前诊断，降低脆性X综合征的发病率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是FMR1基因的CGG重复序列长度与特定临床症状相关性示意图；
图2是FMR1基因CGG重复数和扩增至全突变的概率示意图，左图(a)中：●代表0个AGG，▼代表1个AGG，■代表2个AGG；右图(b)为不考虑AGG数量，仅用用CGG长度和扩增至全突变概率做函数得到的曲线；
图3是三引物扩增法(TP-PCR)识别AGG数目的示意图；
图4是实施例2所述样本的检测结果分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒，包括引物群、PCR反应液、针对CGG序列的高效DNA聚合酶、FMR1基因前突变对照品(质控品)、FMR1基因正常型对照品(质控品)、ROX标记(适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段)和去离子水。
所述引物群包括在AGG处特异性退火并扩增部分FMR1基因CGG重复区的上游引物F和下游引物R，所述上游引物F序列为CGGCGGCGGCGGCGAA，如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物R序列为ACCAGCTCCTCCATCTTCTCTTCAG，如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物R的5’端标有荧光探针。
所述上游引物和FMR1基因5’端非编码区CGG重复序列配对，在3’端最后一个或两个碱基的位置上和AGG引物互补配对，所述下游引物和FMR1基因非编码区3’端的序列互补配对。
所述ROX标记(适用于毛细管电泳的特定DNA分子片段)携带特定荧光基团并且能够准确分析CGG片段大小，由20条大小不同的DNA片段组成：小于100bp，1条；100bp-200bp，4条；201bp-300bp，2条；301bp-400bp，3条；401bp-500bp，2条；501bp-600bp，3条；601bp-700bp，1条；701bp-800bp，2条；901bp-1100bp，2条。
所述ROX标记中的全部序列(DNA分子片段)的GC含量均在80％以上。
所述PCR反应液包括：Tris盐酸、DMSO、甜菜碱或其类似物、GC-melt、氯化镁、UNG酶及dNTPs。
所述FMR1基因前突变对照品包括一段长度等于100个CGG重复的高GC含量DNA序列；所述FMR1基因正常型对照品包括一段长度等于30个CGG重复的高GC含量DNA序列。
所述去离子水为经过高温灭菌的去离子水。
所述用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取人细胞基因组DNA，进行紫外分光定量，OD260nm/OD280nm的比值应在于1.8-2.0之间；OD260nm/OD230nm的比值应大于2.0，使用去离子水将基因组DNA浓度稀释为15-50ng/μL，然后在每个PCR管中放2μL；
(2)将FMR1基因正常型对照品和FMR1基因前突变对照品各取2μL，加入到并列的PCR管中，
(3)PCR扩增：将受检DNA样本、FMR1基因全突变质控品和FMR1基因正常型质控品和所述引物群、DNA聚合酶、PCR反应液混合形成PCR反应体系，PCR反应中引物终浓度为750nM。总反应体系为15μL，反应体系组成如表1所示：
表1.PCR反应体系
PCR反应体系
总体积15μL
PCR缓冲液
11.45μL
引物
3.0μL
DNA聚合酶
0.05μL
样本DNA(15～50ng/μL)或质控品
1.0μL
PCR反应在常规PCR仪上即可进行，扩增程序如表2所示：
表2.PCR反应程序
(4)片段分析：将PCR产物和ROX标记、HiDi甲酰胺按如下比例混合，并使用毛细管电泳仪进行分析。其体系如表3所示：
表3.片段分析体系
组份名称
加入量(μL)
Hi-Di甲酰胺
10
ROX标记
1
PCR产物
3
共计
14
(5)根据基因分析仪的片段分析结果，选取信号值最高的峰作为分析对象，系统会自动记录分析对象的分子大小，标记为Peaki。将Peaki代入以下公式进行计算，得出CGGi的值。理论上，c0取值83.2，m0取值2.92。
式中，CGGi即AGG之后的CGG序列重复数，由于AGG一般出现于CGG序列5‘端第9-10位，当(CGGi+10)大于较短的CGG总长度时，该AGG位于较长的前突变序列中，反之则位于较短的野生型CGG序列上。
实施例2
如图4所示，采用实施例1所述的试剂盒对样本进行检测，该样本来自于一名FMR1基因前突变型携带者，在该名携带者中，CGG重复数为56/30。将153.41代入公式中，等于24.04。该数值等于较长CGG序列上，AGG后的CGG重复数。已知第一个AGG出现在至少9个CGG后，因此可以得知，153.41处的扩增产物，来自于前突变等位基因(56个CGG)。而前端较高的峰，来自56个CGG和30个CGG两个等位基因中共有的AGG插入，因此信号强度大约是后者的两倍。由此可知，该名女性携带者的两个FMR1基因上共有三个AGG插入，其中两个位于前突变等位基因，一个位于野生型等位基因上。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过特定的引物群设计和PCR程序，可有效扩增较大片段的CGG重复序列，并清晰准确地将AGG精准定位于较长或较短的CGG序列上，实现对FMR1基因启动子的序列结构更准确分析；可以帮助临床医生更好的评估女性FMR1基因前突变携带者的生育风险，避免不必要的产前诊断风险，防止不必要的高危妊娠，可用于FMR1基因筛查，产前诊断，降低脆性X综合征的发病率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华瑞康源生物科技发展有限公司
<120> 一种用于测定FMR1基因CGG重复序列中AGG插入数量和位置的试剂盒及其使用方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcggcggc ggcgaa 16
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accagctcct ccatcttctc ttcag 25
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种检测DNM2基因拷贝数变异的试剂盒