具体实施方式

定义

以下定义辅助理解本公开。

术语“样品”是指任何含有或假定含有靶核酸的组合物。这包括从个体分离的组织或液体的样品，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血液细胞、器官和肿瘤，也指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)和自其分离的核酸。样品也可包括不含细胞的材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA)的不含细胞的血液级分(fraction)。

术语“核酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，天然的和非天然的两者)的聚合物，包括DNA、RNA和它们的子分类诸如cDNA、mRNA等。核酸可以是单链的或双链的，并且通常将会含有5′-3′磷酸二酯键，但在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他连接。核酸可包括天然出现的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)以及非天然碱基。非天然碱基的一些示例包括在例如Seela et al.，(1999)Helv.Chim.Acta 82：1640。非天然碱基可具有特定功能，例如，增加核酸双链体的稳定性、抑制核酸酶消化或阻断引物延伸或链聚合。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸是单链或双链的核酸。寡核苷酸是有时用来描述较短的多核苷酸的术语。寡核苷酸通过本领域已知的任何合适方法制备，例如，通过牵涉如以下文献中所述的直接化学合成的方法制备：Narang et al.(1979)Meth.Enzymol.68：90-99；Brown et al.(1979)Meth.Enzymol.68：109-151；Beaucage etal.(1981)Tetrahedron Lett.22：1859-1862；Matteuccietal.(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191。

术语“杂交”是指配对互补核酸以形成双链体(一种双链核酸)。杂交和杂交的强度(如双联体的稳定性)受多种因素的影响，包括核酸之间的互补程度、核酸的GC含量以及涉及的杂交和洗涤条件的严格程度。

术语“严格条件”或“高严格条件”是指只形成高稳定性双链体的杂交条件。通常，高严格条件包括低盐和高温中的一种或多种。例如，在42℃下的传统高严格度杂交缓冲液可能含有50％甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5xDenhardt溶液、超声鲑鱼精子DNA(50mg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯。

术语“严格洗涤”是指用含有递减浓度的盐或递增浓度的洗涤剂的洗涤缓冲液且在上升的温度下的杂交后洗涤。严格洗涤条件可包括高于约42℃的温度。严格洗涤缓冲液成分通常含有少于约0.1M的盐。例如，传统的高严格度杂交后洗涤在42℃下可含有0.2xSSC(0.03M NaCl、0.003M柠檬酸钠)和50％甲酰胺，随后在55℃的温度下用0.1xSSC洗涤。

术语“引物”是指单链寡核苷酸，它与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交并且能够用作在适用于合成的条件下沿着核酸的互补链启动该合成的点。

术语“衔接子”意为核苷酸序列，可将其加入另一序列中以赋予该另一序列以另外的性质。衔接子典型是寡核苷酸，它可以是单链的或双链的，或者可具有单链部分和双链部分两者。

术语“连接”是指将两条核酸链接合的缩合反应，其中一个分子的5′-磷酸酯基团与另一个分子的3′-羟基基团反应。连接典型是由连接酶或拓扑异构酶催化的酶促反应。连接可将两条单链接合以创建一个单链分子。连接也可将各自属于一个双链分子的两条链接合，从而将两个双链分子接合。连接也可将一个双链分子的两条链与另一个双链分子的两条链接合，从而将两个双链分子接合。连接也可将一个双链分子内的一条链的两端接合，从而修复该双链分子内的缺口。

术语“条形码”是指可被检测和鉴定的核酸序列。可将条形码并入各种核酸中。条形码足够长，例如，2、5、20个核苷酸，使得在样品中，可根据条形码对并入条形码内的核酸进行区分或分组。

术语“多重标识符”或“MID”是指一种条形码，它鉴定靶核酸的来源(例如，该核酸所衍生自的样品)。来自相同样品的全部或基本上全部靶核酸将共享相同的MID。来自不同来源或样品的靶核酸可混合并同时测序。使用MID，可将序列读取分配给靶核酸自其起源的个体样品。

术语“独特的分子标识符”或“UID”是一种条形码，其鉴定与其附接的核酸。来自相同样品的全部或基本上全部靶核酸会具有不同的UID。源自相同的初始靶核酸的全部或基本上全部子代(例如，扩增子)将共享相同的UID。

术语“通用引物”和“通用引物结合位点”或“通用引物位点”是指存在于(通常通过体外添加到)不同靶核酸中的引物和引物结合位点。使用衔接子或使用在5′-端中具有通用引物位点的靶标特异性(非通用)引物，将该通用引物位点添加至多个靶核酸。该通用引物可与通用引物位点结合并引导引物自该通用引物位点延伸。

术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶标”是指待检测或分析的样品中的核酸序列的一部分。术语靶标包括靶序列的全部变体，例如，一种或多种突变变体和野生型变体。

术语“扩增”是指制备靶核酸的另外的拷贝的方法。扩增可具有超过一个循环，例如，指数式扩增的多个循环。扩增也可以只有一个循环(制备靶核酸的单个拷贝)。该拷贝可具有另外的序列，例如，用于扩增的引物中存在的那些。

术语“测序”是指任何测定靶核酸中核苷酸序列的方法。“下一代测序”、“大规模平行测序”和“大规模平行单分子测序”可互换使用，是指对整个分离的单独核酸(或核酸扩增子)群体进行并行测序。

本发明包括一种核酸测序工作流程，其中该测序为下一代测序，也称为大规模平行单分子测序。在一些实施例中，该工作流程包括核酸分离、测序文库制备、靶标富集和测序等步骤。靶标富集的步骤新颖，且包括使用新颖的无甲酰胺组合物以及涉及使用与测序过程兼容(不抑制或不干扰)的甲酰胺替代品的方法。甲酰胺替代品选自二甲基亚砜(DMSO)、环丁砜、碳酸亚乙酯、吡咯烷酮或伯酰胺等溶剂。吡咯烷酮或伯酰胺具有选自以下项的结构：

其中R1为H、甲基、丙基或羟乙基；R2和R3彼此独立地为H或甲基；并且R4为H、丙基或异丁基。在一些实施例中，吡咯烷酮或酰胺选自2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、丙酰胺、异丁酰胺。

本发明包括检测样品中的靶核酸。在一些实施例中，该样品获自受试者或患者。在一些实施例中，该样品可包括例如通过生物活检而获自该受试者或患者的固体组织或实体肿瘤的片段。该样品还可包括体液(如尿液、痰、血清、血浆或淋巴、唾液、痰、汗液、泪液、脑脊液、羊水、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、囊液、胆汁、胃液、肠液和/或粪便样品)。该样品可包括全血或可能存在肿瘤细胞的血液级分。在一些实施例中，该样品，特别是液体样品可包括无细胞材料，诸如无细胞DNA或RNA，包括无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。在一些实施例中，该样品为无细胞样品，例如，存在无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA的无细胞血源性样品。在其他实施例中，该样品为培养样品，例如，含有或疑似含有感染源或源自该感染源的核酸的培养物或培养物上清液。在一些实施例中，该感染源为细菌、原生动物、病毒或支原体。

靶核酸是指样品中可能存在的目标核酸。在一些实施例中，该靶核酸为基因或基因片段。在其他实施例中，该靶核酸包括遗传性变型，例如多态性，包括单核苷酸多态性或变型(SNV的SNP)，或导致例如基因融合的基因重排。在一些实施例中，该靶核酸为生物标志物。在其他实施例中，该靶核酸具有特定生物体的特征，例如，有助于识别病原生物或病原生物的特征，例如药物敏感性或耐药性。在其他实施例中，该靶核酸具有人受试者的特征，例如，界定该受试者的独特HLA或KIR基因型的HLA或KIR序列。在其他实施例中，样品中的所有序列均为例如鸟枪法基因组测序中的靶核酸。

在一些实施例中，该测序工作流程包括扩增靶核酸的步骤。该扩增可通过聚合酶链反应(PCR)或任何其他利用寡核苷酸引物的方法进行。各种PCR条件在PCR Strategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand，and J.J.Sninsky eds.，1995，Academic Press，San Diego，CA)第14章；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编撰，学院出版社，纽约，1990)中描述。

该扩增可利用包括靶标特异性序列以及后续步骤所需的人工序列(衔接子序列)的二分扩增引物。在一些实施例中，已确定的靶标或靶核酸组正在被识别。在此类实施例中，可使用靶标特异性扩增引物。引物可具有由3′-端的靶标特异性序列和5′-端的衔接子序列组成的二分结构。通常，该靶标特异性引物用作一对不同的寡核苷酸，例如，一个正向引物和一个反向引物。该5′-端还可包括通用引物结合位点，使得能够用通用引物进行扩增。该5′-端还可包括测序引物结合位点，使得能够用测序引物(例如平台特异性测序引物)测序。

在一些实施例中，该测序工作流程包括文库制备的步骤。该文库制备从衔接子连接开始。衔接子通过引物延伸、通过PCR扩增或通过连接引入靶核酸。在一些实施例中，引物延伸为单轮。在其他实施例中，引物延伸经过多个循环，例如PCR扩增(如前文部分所述)。所得的靶核酸包括侧接衔接子序列的靶序列。在一些实施例中，衔接子含有用于下游步骤的引物结合位点，例如扩增引物结合位点和测序引物结合位点。

衔接子连接可以是平末端连接，也可以是更有效的粘性末端连接。在一些实施例中，靶核酸或衔接子可通过链填充来进行平末端化，即，通过DNA聚合酶延伸3′-末端以消除5′-突出端或通过3′-5′-核酸外切酶活性消化3′-突出端。在一些实施例中，平末端化的衔接子和靶核酸可以通过向衔接子的3′-端添加单个核苷酸和向靶核酸的3′-端添加单个互补核苷酸(例如，通过DNA聚合酶或末端转移酶)具有粘性。在其他实施例中，该衔接子和该靶核酸可以通过使用限制性内切酶消化来获得粘性端(突出端)。就已知含有限制性内切酶识别位点的已知靶序列而言，后一种选择更为有利。在上述每个实施例中，衔接分子可通过设计下面进一步描述的合成衔接子寡核苷酸获得所需的末端(平端、单碱基延伸端或多碱基突出端)。在一些实施例中，衔接子分子为在体外合成的人工序列。在其他实施例中，衔接分子为在体外合成的天然存在的序列，该序列已知具有所需的二级结构。在其他实施例中，衔接分子为分离的天然存在的分子或分离的非天然存在的分子。

在该测序工作流程的一些实施例中，所述衔接子包括一个或多个条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于鉴定样品来源的多重样品ID(MID)。条形码也可以作为唯一的分子ID(UID)，用于鉴定每个原始分子及其子代。条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施例中，将单个条形码用作UID和MID。在一些实施例中，每个条形码包括预定义序列。在其他实施例中，条形码包括随机序列。条形码可以是1-20个核苷酸长。

本发明的方法包括一种新型靶标富集步骤。该富集可通过与一个或多个靶标特异性探针杂交而捕获靶序列来实现。在一些实施例中，杂交探针包括一个或多个靶向来自多个遗传位点的多个外显子、内含子或调控序列的序列，或至少一个单一遗传位点的全序列，该位点的大小介于约100kb和约1Mb之间。

在一些实施例中，该测序工作流程的新型杂交溶液包括Matthiesen，S.等人，(2012)Fast and Non-Toxic In Situ Hybridization without Blocking of RepetitiveSequences PLoS ONE，7：e40675或美国专利9,303,287中所述的溶剂。在一些实施例中，甲酰胺替代物为基于如Hansen，Charles(2007).Hansen Solubility Parameters.A user′shandbook，Second Edition.Boca Raton，Fla：CRC Press所述的Hansen溶度参数选择的极性非质子溶剂。这些参数测定所述溶剂的某些能量特征，其以MPa^0.5表示。具体来说，如果溶剂的参数D介于17.7与22.0MPa^0.5之间，参数P介于13与23MPa^0.5之间，参数H介于3与13MPa^0.5之间，则选择所述溶剂。

在一些实施例中，该测序工作流程的新型杂交溶液包括Chakrabarti，R.等人(2001)The enhancement of PCR amplification by low molecular weightamides.N.A.R.29：2377中所述的溶剂。在一些实施例中，甲酰胺替代物为选自二甲基亚砜(DMSO)、环丁砜、碳酸亚乙酯、吡咯烷酮或伯酰胺的溶剂。在一些实施例中，吡咯烷酮或酰胺具有选自以下项的结构：

其中R1为H、甲基、丙基或羟乙基；R2和R3彼此独立地为H或甲基；并且R4为H、丙基或异丁基。在一些实施例中，溶剂选自2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、丙酰胺、异丁酰胺。

样品中的核酸为单链核酸，或经变性并在含有根据本发明所述的甲酰胺替代物的新型杂交缓冲液中与单链靶标特异性探针接触。探针可包括用于亲和力捕获部分的配体，以便在形成杂交复合物后，通过提供亲和力捕获部分来捕获所述复合物。在一些实施例中，亲和力捕获部分为亲和素或链霉亲和素，且所述配体为生物素。配体捕获部分的其他实例包括地高辛/抗地高辛和6HIS/镍。在一些实施例中，捕获部分与固体支持物结合。固体支持物可包括超顺磁性球形聚合物颗粒等悬浮颗粒，诸如DYNABEADS^TM磁珠或磁性玻璃颗粒。

在本发明的实施例中，将含有变性(例如，单链的)核酸分子的样品暴露于含有一个或多个寡核苷酸探针的无甲酰胺杂交缓冲液中。

通常，探针通过每个位点使用一个或多个捕获探针来靶向一个或多个基因组位点。在一些实施例中，探针靶向疾病相关的基因的组合，诸如包括癌症相关基因和肿瘤相关位点的组合。在一些实施例中，该组合包括选自用于肿瘤分析的靶向组合的AVENIO ctDNA组合、用于扩展肿瘤分析的扩展组合以及用于纵向肿瘤负荷监测的监视组合(RocheSequencing Solutions，Pleasanton，Cal)。探针可存在于溶液中，也可以与固体支持物诸如珠粒或微阵列结合。探针与靶核酸序列杂交(即捕获)。随后的杂交后洗涤分离出非杂交核酸，例如多余的探针和基因组的非杂交区域或来自杂交靶序列的任何其他非靶标样品核酸。在一些实施例中，在严格条件下进行杂交洗涤，该严格条件包括低盐和高温中的一种或两种。在一些实施例中，洗涤在47℃或室温下的标准和严格的洗涤缓冲液中进行。

在一些实施例中，本发明包括通过核酸测序检测样品中的靶核酸。包括根据本发明的方法捕获的所有核酸在内的多个核酸均可以进行测序。

在一些实施例中，通过高通量单分子合成测序法进行测序，例如包括HiSeq、MiSeq和NextSeg在内的Illumina平台(Illumina，San Diego，Cal.)。测序方法和平台的其他实例包括合成测序Helicos Biosciences(Cambridge，Mass.)、连接测序(例如SOLiD^TM)和离子半导体测序(例如Ion Torrent^TM)(两者皆来自Thermo Fisher Scientific)、利用SMRT技术的Pacific BioSciences平台(Pacific Biosciences，Menlo Park，Cal.)或利用纳米孔技术的平台，诸如利用Oxford Nanopore Technologies(Oxford，UK)或Roche SequencingSolutions(Santa Clara，Cal.)以及其他任何涉及或未涉及合成测序的现有或未来的DNA测序技术制造的平台。测序步骤可利用平台特异性测序引物。可如本文所述，将这些引物的结合位点引入本发明方法中，即，将这些引物的结合位点作为衔接子或扩增引物的一部分引入。

在一些实施例中，利用新型无甲酰胺溶液的方法是以与测序相关的性能特征为特征。该特征选自中靶读长、去重复(deduped)深度、错误率、均匀度和GE回收率。如图1、图2、图3和图4所示，当甲酰胺替代物在杂交溶液中以20％浓度存在时，其特征相似于或优于含甲酰胺杂交溶液的特征。在一个方面，中靶读长特征确定为比对读取的百分比，其中读取的任何部分比对到靶标区域(由组合定义)。如图1所示，含甲酰胺杂交缓冲液和新型无甲酰胺杂交缓冲液两者的中靶读长为约70％或更高。在一个方面，去重复(deduped)深度特征确定为去重复后测量的中靶读长的平均深度。如图2所示，含甲酰胺杂交缓冲液和新型无甲酰胺杂交缓冲液两者的去重复深度为约2500或以上。在一个方面，均匀度特征确定为90^th/10^th比值，或第90百分位碱基覆盖度与第10百分位碱基覆盖度的比值。如图3所示，含甲酰胺杂交缓冲液和新型无甲酰胺杂交缓冲液两者的均匀度为2.5或更大。在一个方面，错误率特征确定为在所有具有非参考等位基因的读取内所有碱基的百分比，其中计算被限制为1)总读取深度至少为200的位置(在条形码去重复后)，以及2)非参考碱基具有最多5％的等位基因分数。如图4所示，含甲酰胺杂交缓冲液和新型无甲酰胺杂交缓冲液两者的错误率为0.005％或以下。在一个方面，GE(基因组当量)回收率特征确定为回收的基因组当量的数量。如图5所示，含甲酰胺杂交缓冲液和新型无甲酰胺杂交缓冲液两者的GE(基因组当量)回收率介于0.2和0.3之间。如图6、图7、图8和图9所示，当在杂交溶液中滴定一定量的甲酰胺替代物时，可以确定一个最佳值，其中性能特征相似于或优于含甲酰胺杂交溶液的性能特征。

在一些实施例中，本发明为一种用于执行本发明的靶标富集和测序方法的试剂盒。试剂盒包括不含甲酰胺杂交溶液，该溶液包括选自环丁砜、碳酸亚乙酯、吡咯烷酮或伯酰胺的溶剂，以及以下项中的一种或多种：衔接子；通用扩增引物；酶，包括DNA连接酶(T4DNA连接酶、Taq DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶)、多核苷酸激酶以及DNA聚合酶，诸如扩增聚合酶或测序聚合酶。在一些实施例中，试剂盒还包括具有5′-3′活性的核酸外切酶，例如T5核酸外切酶。

实例

实例1.使用甲酰胺替代物碳酸丙烯酯、环丁砜和2-吡咯烷酮的测序工作流程

简而言之，在此实例中，除了在靶标捕获方案的杂交步骤中，甲酰胺被替换成选自碳酸丙烯酯、环丁砜和2-吡咯烷酮的非质子溶剂中的一种外，该测序工作流程按照AVENIOctDNA分析法(Roche Sequencing Solutions，Pleasanton，Cal.)进行。捕获的文库在Illumina NextSeq 500(Ilumina，San Diego，Cal.)上进行测序。在甲酰胺替代物存在的条件下捕获的文库的测序结果显示与甲酰胺对照物的结果相当，并且显著优于水对照物。该工作流程包括DNA断裂、文库制备(包括衔接子连接和PCR扩增)、靶标富集、杂交后清理和测序等步骤。

根据制造商的建议，使用KAPA Frag Kit(Kapa Biosystems，Wortham，Mass)进行DNA断裂步骤。简而言之，在37℃下使用(KR1141)酶促断裂100ng的NA12878基因组DNA，并使用亲和色谱法纯化。使用Qubit断裂质量来量化DNA，并用High Sensitivity BioanalyzerKit进行评估。

文库制备步骤利用了30ng断裂的NA12878。将来自AVENIO试剂盒的10μl通用衔接子溶液加到每个样品中，并在16℃下连接16-18小时。连接后的DNA用亲和色谱法纯化，并用于PCR扩增。

PCR步骤用到了条形码特异性通用引物和以下温度曲线：

扩增的连接DNA使用亲和色谱法纯化并用于靶标富集步骤。在该步骤之前，使用Qubit量化所述文库，并使用High Sensitivity Bioanalyzer Kit评估文库片段的大小。

靶标富集步骤利用了30μl的衔接子连接的样品。该反应包括杂交添加剂和来自AVENIO试剂盒的增强寡核苷酸，并且除了杂交溶液包括以下项中的一项外，按照制造商的方案进行所述反应：

样品经历如下温度曲线：

杂交洗涤步骤在47℃和室温下利用了标准和严格的AVENIO杂交洗涤缓冲液。在链霉亲和素珠粒上捕获杂交的核酸，并用于PCR扩增步骤。

PCR扩增步骤利用了20μL与链霉亲和素珠粒结合的DNA。加入PCR反应混合物后，该反应经历如下温度曲线：

使用亲和色谱法纯化PCR产物。使用Qubit和High Sensitivity Bioanalyzer Kit评估DNA的数量与质量。然后，根据制造商的方案在NextSeq 500/550上对PCR产物进行测序。

结果如图1、图2、图3、图4和图5所示。

实例2.使用滴定的甲酰胺替代物碳酸丙烯酯、环丁砜和2-吡咯烷酮的测序工作流程

在此实例中，除了使用以下浓度的甲酰胺替代物外，该测序工作流程如实例1所述进行

结果如图6、图7、图8和图9所示。

实例3.使用甲酰胺替代物DMSO的测序工作流程

简而言之，在此实例中，除了在靶标捕获方案的杂交步骤中，甲酰胺被替换成DMSO外，该测序工作流程按照AVENIO Tumor Tissue DNA分析法(Roche SequencingSolutions，Pleasanton，Cal.)进行。捕获的文库在Illumina NextSeq 500(Ilumina，SanDiego，Cal.)上进行测序。在DMSO存在的条件下捕获的文库的测序结果显示与甲酰胺对照物的结果相当，并且显著优于水对照物。该工作流程包括DNA抛光、DNA断裂、文库制备(包括衔接子连接和PCR扩增)、靶标富集、杂交后清理、杂交扩增和测序等步骤。

DNA抛光步骤根据制造商的说明，利用了AVENIO Tumor Tissue DNA试剂盒中包括的DNA抛光酶。如实例1所述进行DNA断裂步骤。包括A-加尾和衔接子连接在内的文库制备步骤基本上如实例1所述，利用来自细胞系HD789(Horizon Discovery)的20ng的基因组DNA进行。AVENIO试剂盒中的通用衔接子在16℃下连接16-18小时。连接后的DNA用亲和色谱法纯化，并用于PCR扩增。该扩增利用实例1中所列的温度曲线。

扩增的连接DNA使用亲和色谱法纯化并用于靶标富集步骤。在该步骤之前，使用Qubit量化所述文库，并使用High Sensitivity Bioanalyzer Kit评估文库片段的大小。

靶标富集步骤利用了30μl的衔接子连接的样品。该反应包括杂交添加剂、清理珠粒和来自AVENIO试剂盒的增强寡核苷酸，除了杂交溶液包括20％甲酰胺(对照物)或以下浓度的DMSO外，按照制造商的方案进行该反应：15％、18％、20％、23％、25％、28％、30％、32％、38％和40％。

样品经历如下温度曲线：

杂交洗涤步骤在55℃和室温下利用了标准和严格的AVENIO杂交洗涤缓冲液。在链霉亲和素珠粒上捕获杂交的核酸，并用于PCR扩增步骤。如实例1所述进行捕获后PCR扩增。

使用亲和色谱法纯化PCR产物。使用Qubit和High Sensitivity Bioanalyzer Kit评估DNA的数量与质量。然后，根据制造商的方案在NextSeq 500/550上对PCR产物进行测序。

DMSO浓度的结果：15％、18％、20％、23％、25％、28％、30％、32％、35％、38％和40％如图10、图11和图12所示(除了在35％、38％和40％DMSO的条件下无法检索到序列数据外)。