用于捕集-洗脱混合模式色谱法的色谱系统和方法
阅读说明：本技术 用于捕集-洗脱混合模式色谱法的色谱系统和方法 (Chromatography system and method for trap-elute mixed mode chromatography ) 是由 M·A·劳伯 B·O·奥肯德吉 于 2019-07-09 设计创作，主要内容包括：在各个方面,本公开涉及用于执行液相色谱的材料(例如,套件、柱组件、液相色谱系统等)方法,其采用第一柱(例如,捕集柱)和第二柱(例如,分析柱)。第一柱包括具有第一色谱表面的第一色谱材料,该第一色谱表面包含第一疏水表面基团和具有第一pKa值的第一可离子化表面基团。第二柱包括具有第二色谱表面的第二色谱材料,该第二色谱表面包含第二疏水表面基团和(a)永久性离子化的表面基团或(b)具有第二pKa值的第二可离子化表面基团。第一疏水表面基团的疏水性小于第二疏水表面基团的疏水性。此外,在第二色谱表面包含第二可离子化P表面基团的情况下,第一pKa值可以与第二pKa值相差1个单位至12个单位。(In various aspects, the present disclosure relates to methods of materials (e.g., kits, column assemblies, liquid chromatography systems, etc.) for performing liquid chromatography that employ a first column (e.g., a trapping column) and a second column (e.g., an analytical column). The first column includes a first chromatographic material having a first chromatographic surface comprising a first hydrophobic surface group and a first ionizable surface group having a first pKa value. The second column includes a second chromatographic material having a second chromatographic surface comprising a second hydrophobic surface group and either (a) a permanently ionized surface group or (b) a second ionizable surface group having a second pKa value. The hydrophobicity of the first hydrophobic surface group is less than the hydrophobicity of the second hydrophobic surface group. Further, where the second chromatographic surface comprises a second ionizable P surface group, the first pKa value may differ from the second pKa value by from 1 unit to 12 units.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年7月11日提交的名称为“MATERIALS AND METHODS FOR TRAP-ELUTE MIXED MODE CHROMATOGRAPHY”的美国临时申请序列号62/696,694的权益，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及液相色谱领域。
背景技术
混合模式色谱法是指在固定相和被分析物之间利用不止一种形式的相互作用来实现被分析物的分离的色谱方法。混合模式色谱法是用于获得新型分离选择性的有前途的技术。然而，由于混合模式色谱法固有地依赖于不止一种保留机制，因此可能难以实施。
授予Lauber等人并且名称为“Charged Surface Reversed PhaseChromatographic Materials Method for Analysis of Glycans Modified withAmphipathic,Strongly Basic Moieties”的WO 2017/189357(其据此全文以引用方式并入)描述了所谓的带电表面反相色谱材料用于混合模式样分离用两亲强碱性残基改性的聚糖的用途，其中分离通过利用聚糖之间存在的疏水性和电荷特性的差异来实现。已详细描述了适用于这些分离的带电表面反相吸附剂。简言之，带电表面反相材料可以由具有由疏水表面基团和一种或多种可离子化改性剂构成的色谱表面的高纯度色谱材料(HPCM)形成。在某些方面，已描述了这样的带电表面反相材料：HPCM中的疏水表面基团：可离子化改性剂的比率在从约5:1至约22:1的范围内，可离子化改性剂的浓度小于约0.5μmol/m2，并且具有C4至C30疏水表面基团。其中色谱表面由二乙基氨基丙基(DEAP)可离子化改性剂、C18疏水基团和桥联乙烯杂化颗粒上的封端产生的此类材料的用途已被证明是用于分离用两亲强碱性部分标记的聚糖(诸如用购自Waters Corporation(Milford,MA,USA)的RapiFluor-MS试剂标记的那些)的一个示例性实施方案。这种所谓的二乙基氨丙基带电表面杂化固定相材料(DEAP HPCM)可高效分离RapiFluor-MS试剂标记的聚糖，因为这种聚糖已用相对高pKa(约10)的可离子化改性剂改性，该改性剂产生了独特的明显阴离子保留。
相对于较高流速的色谱分离，诸如用窄孔(例如，2.1mm ID)柱实现的那些，纳米级液相色谱(nanoLC)使得能够分析具有相对较高质谱灵敏度的最小样品量。然而，在使用nanoLC的情况下，仅使用单根柱来分析大体积样品通常是不合理的。相反，优选的是以微米级流速进行被分析物的在线捕集，并且随后在分析柱上洗脱和分离那些被分析物，在分析柱中采用明显较低的纳米级流速。通常，必须分析数十微升的样品，并且在这些样品中，被分析物可能以相差超过几个数量级的浓度存在。在服从高流速的捕集柱上进行捕集允许更高的通量效率以及在将不需要的溶质转移离开下游质谱仪的步骤中脱盐，而无需在分析柱之后添加额外的连接和管材。捕集柱也可以用作保护柱，以保持分析柱的性能。除了其作为保护柱的作用之外，有效的捕集柱还可以填充较大直径的颗粒(典型地约5μm)，以使得能够实现较高速度的装载和保留大的、可能稀释的样品体积。
发明内容
在各个方面，本公开涉及用于执行液相色谱的材料(例如，套件、柱组件、液相色谱系统等)方法，其采用第一柱(例如，捕集柱)和第二柱(例如，分析柱)。第一柱包括具有第一色谱表面的第一色谱材料，该第一色谱表面包含第一疏水表面基团和具有第一pKa值的第一可离子化表面基团。第二柱包括具有第二色谱表面的第二色谱材料，该第二色谱表面包含第二疏水表面基团和(a)永久性离子化的表面基团或(b)具有第二pKa值的第二可离子化表面基团。第一疏水表面基团的疏水性小于第二疏水表面基团的疏水性。此外，在第二色谱表面包含第二可离子化表面基团的情况下，第一pKa值可以与第二pKa值相差1个单位至12个单位，更典型地2个单位至6个单位。
在可以结合前述方面中的任一者使用的各种实施方案中，第一色谱材料可以是第一颗粒的形式，并且第二色谱材料可以是第二颗粒的形式。在这些实施方案中，第一颗粒的第一直径可以大于等于第二颗粒的第二直径。例如，第一颗粒直径与第二颗粒直径的比率可以在从1至10(典型地从1.5至3)的范围内，以及其他值。在这些实施方案中，第一直径可以在从2微米至10微米(通常从2.5微米至5微米)的范围内，并且第二直径可以在从1微米至5微米(通常从1.5微米至3微米)的范围内，以及其他值。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一色谱材料可以是具有第一材料的芯的第一颗粒的形式，并且第二色谱材料可以是具有第二材料的芯的第二颗粒的形式。
第一材料和第二材料可以是有机材料、无机材料或有机-无机杂化材料。第一材料和第二材料可以选自例如基于二氧化硅的材料、基于氧化铝的材料、基于二氧化钛的材料、基于氧化锆的材料、基于碳的材料和聚合物材料。
在第一材料和第二材料为基于二氧化硅的材料的情况下，此类材料通过水解缩合一种或多种有机硅烷化合物而形成。有机硅烷化合物的示例包括烷氧基硅烷化合物，例如四烷氧基硅烷(例如，四甲氧基硅烷(TMOS)、四乙氧基硅烷(TEOS)等)，烷基烷氧基硅烷诸如烷基三烷氧基硅烷(例如，甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷(MTOS)、乙基三乙氧基硅烷等)和双(三烷氧基甲硅烷基)烷烃(例如，双(三甲氧基甲硅烷基)甲烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)甲烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷(BTEE)等)，以及前述物质的组合。在特定实施方案中，基于二氧化硅的材料可以通过水解缩合四烷氧基硅烷(例如，TMOS或TEOS)和烷基烷氧基硅烷(例如，MTOS或BTEE)来形成。在第一材料和第二材料为聚合物材料的情况下，第一材料和第二材料可以包括共聚物，该共聚物包括亲水单体(例如，N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺等)和疏水单体(例如，二乙烯基苯、苯乙烯等)。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一柱的内径可以大于或等于第二柱的内径。例如，第一柱的内径可以为第二柱的内径的1倍至5倍(典型地1.5倍至3倍，更典型地约2倍)，以及其他值。此外，第一柱的长度可以短于第二柱的长度。此外，第一柱的体积可以在第二柱的体积的从0.05倍至0.5倍(典型地0.1倍至0.3倍)的范围内，以及其他值。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一疏水表面基团为由碳原子和氢原子组成的第一烃基团，并且第二疏水表面基团为由碳原子和氢原子组成的第二烃基团。第一烃基团和第二烃基团的示例包括(a)烷基基团、(b)烯基基团、(c)炔基基团、(d)芳族基团，或者由基团(a)、(b)、(c)和(d)的任何组合形成的基团。一般来讲，第二烃基团含有比第一烃表面基团更多的碳原子。例如，第二烃基团可以比第一烃基团多含2个至22个(更典型地4个至14个)碳原子。在某些实施方案中，第二烃基团含有从10个碳原子至24个碳原子(在特定实施方案中，16个碳原子至20个碳原子)，并且第一烃基团含有从3个碳原子至8个碳原子(在特定实施方案中，4个碳原子)。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一可离子化基团以小于或等于永久性离子化基团或第二可离子化基团的表面浓度的表面浓度存在(例如，第一可离子化基团可以以等于第二可离子化基团的表面浓度的1％至100％、更典型地15％至50％、甚至更典型地20％至30％的表面浓度存在)。第一可离子化基团可以以从0.03微摩尔/平方米至0.3微摩尔/平方米(典型地从0.05微摩尔/平方米至0.1微摩尔/平方米，更典型地0.06微摩尔/平方米至0.08微摩尔/平方米，以及其他值)范围内的表面浓度存在。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一可离子化基团以及永久性离子化基团或第二可离子化基团在离子化时带正电，在这种情况下，可离子化基团或永久性离子化基团可以包含例如带正电的氮原子。在这些实施方案中，第一可离子化基团和永久性离子化基团或第二可离子化基团可以包括胺基团(包括例如烷基胺基团、芳基胺基团、咪唑基团、胍基基团、脒基基团、喹啉基基团、亚胺基团和吲哚基团等等)。在这些实施方案中，第一可离子化基团可以包括选自伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团的胺基团，并且永久性离子化基团或第二可离子化基团可以包括选自伯胺基团、仲胺基团、叔胺基团和季铵基团的胺基团。在其中第二色谱表面包含第二可离子化表面基团的实施方案中，第一pKa值和第二pKa值可以大于3，并且第二pKa值可以比第一pKa值大1个单位至11个单位(并且典型地大2个单位至10个单位)。在某些实施方案中，第一可离子化基团可以是4-吡啶基乙基(4-PE)、2-吡啶基乙基、2-咪唑啉基丙基、3-丙基苯胺或咪唑基团。在某些实施方案中，第二可离子化基团是二乙基氨基丙基(DEAP)、乙基氨基丙基、二甲基氨基丙基、甲基氨基丙基、氨基丙基、二乙基氨基甲基、3-[双(2-羟基乙基)氨基]丙基、正丁基-氮杂-硅杂环戊烷、N-甲基-氮杂-硅杂环戊烷或双-3-甲基氨基丙基甲硅烷基基团。
另选地，在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一可离子化基团和第二可离子化基团在离子化时带负电。例如，第一可离子化基团可以是羧酸基团，并且第二可离子化基团可以选自磺酸基团和羧酸基团，以及其他可能基团。在实施方案中，第二pKa值可以比第一pKa值小1个单位至4个单位。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一疏水表面基团与第一可离子化基团的摩尔比可以在从5:1至200:1的范围内。
在各个方面，本公开涉及套件，该套件包括根据上述方面和实施方案中的任一者的第一柱(例如，捕集柱)和根据上述方面和实施方案中的任一者的第二柱(例如，分析柱)。
在一些实施方案中，该套件还可以包括聚糖标记试剂。在这些实施方案的某些中，聚糖标记试剂可以选自MS活性快速荧光标记化合物、普鲁卡因胺试剂和普鲁卡因试剂。在这些实施方案的某些中，可以使用聚糖标记试剂来标记聚糖，该聚糖标记试剂提供了两亲碱性部分，该两亲碱性部分：(a)具有大于7、大于8或甚至大于9的pKa值，并且/或者(b)具有介于0和5之间的Log P值，典型地Log P值介于1和5之间，更典型地Log P值介于1和3之间。在本公开中使用的聚糖标记试剂的具体示例包括RapiFluor-MS试剂，其中聚糖标记试剂是
购自Waters Corporation(Milford,MA,USA)，或InstantPC试剂，购自ProZyme Inc.(Hayward,CA USA)。额外的聚糖标记试剂在授予Brousmiche等人的WO 2013/049622中有所描述，该专利据此全文以引用方式并入。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，套件可以包括与第一柱和/或第二柱一起使用的一种或多种流动相。一种或多种流动相可以包括有机酸和/或有机酸盐的水性溶液。有机酸的示例包括甲酸、二氟乙酸、三氟乙酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸和马来酸等等，并且包括有机羟基酸，诸如乙醇酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸和葡糖酸等等。有机酸盐的示例包括具有有机酸阴离子(例如，选自甲酸根、二氟乙酸根、三氟乙酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、碳酸根、碳酸氢根、草酸根、丙二酸根、琥珀酸根、马来酸根、戊二酸根、乙醇酸根、乳酸根、苹果酸根、柠檬酸根和葡糖酸根等等)的盐，以及具有选自I族金属阳离子、II族金属阳离子、铵阳离子和胺阳离子的阳离子的盐)。在特定实施方案中，一种或多种流动相包括甲酸和甲酸铵的水性溶液。
在各个方面，本公开涉及柱组件，该柱组件包括根据上述方面和实施方案中的任一者的第一柱(例如，捕集柱)和根据上述方面和实施方案中的任一者的第二柱(例如，分析柱)。此外，该柱组件还可以包括具有第一端口、第二端口和第三端口的多通阀，其中第一柱经由第一端口连接到多通阀，其中第二柱经由第二端口连接到多通阀。在第一多通阀位置中，第一端口与第二端口流体连通(即，第一柱与第二柱流体连通)，但不与第三端口流体连通。在第二多通阀位置中，第一端口与第三端口流体连通，但不与第二端口流体连通(即，第一柱不与第二柱流体连通)。在某些实施方案中，废物管线经由第三端口连接到多通阀。排气柱设置在本领域中也是已知的，其中开关阀放置在样品料流的外部，且开关阀确定流动路径。
在各个方面，本公开涉及液相色谱系统，该液相色谱系统包括：(a)根据上述方面和实施方案中的任一者的第一柱(例如，捕集柱)，和(b)根据上述方面和实施方案中的任一者的第二柱(例如，分析柱)。此外，该液相色谱系统还可以包括：(c)进样器，该进样器被配置为将样品液体引入到该系统中，(d)检测器，该检测器被配置为检测样品液体的组分(例如，被分析物)，(e)第一流动路径，该第一流动路径包括样品环或流通针和第一柱，但不包括第二柱，(f)第二流动路径，该第二流动路径包括第一柱和第二柱，(g)第一泵，该第一泵被配置为沿第一流动路径泵送第一流动相，和(h)第二泵，该第二泵可以与第一泵相同或不同，其被配置为沿第二流动路径泵送第二流动相。在一些实施方案中，进样器可以包括样品环。在一些实施方案中，进样器可以包括流通针。
在各个方面，本公开涉及使用液相色谱系统(诸如先前段落中所述的那些液相色谱系统)对包含多种组分的液体样品执行液相色谱分析的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)经由进样器将液体样品引入到系统中；(b)使用第一泵使第一流动相流过第一流动路径，使得液体样品被引导通过第一柱，并且使得第一柱捕集液体样品的组分的至少一部分作为捕集的组分；(c)使用第二泵使第二流动相流过第二流动路径，其中流过第二流动路径包括使第二流动相(i)流过第一柱，使得捕集的组分的至少一些从第一柱洗脱作为洗脱的组分，并且(ii)流过第二柱，使得洗脱的组分的至少一些被分离作为分离的组分；以及使分离的组分流至检测器。
在各个方面，本公开涉及用于对包含多种组分(例如，被分析物)的液体样品执行液相色谱分析的方法，这些方法包括(a)将液体样品装载到液相色谱系统的进样器(例如，包括样品环或流通针的进样器)中；(b)使第一流动相流过液相色谱系统中的第一流动路径，其中流过第一流动路径包括使第一流动相流过进样器(从而拾取样品)和根据上述方面和实施方案中的任一者的第一柱(例如，捕集柱)，其中第一柱捕集液体样品的组分的至少一些作为捕集的组分；(c)使第二流动相流过液相色谱系统中的第二流动路径，其中流过第二流动路径包括使第二流动相流过第一柱以从第一柱洗脱捕集的组分的至少一些作为洗脱的组分，之后使第二流动相和洗脱的组分流过根据上述方面和实施方案中的任一者的第二柱(例如，分析柱)，其中第二柱将洗脱的组分的至少一些分离作为分离的组分。在各种实施方案中，该方法还包括使分离的组分流至检测器，该检测器被配置为检测分离的组分的特性。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，样品液体中的多种组分包括聚糖(其电荷可以变化，包括中性聚糖和带正电的聚糖)。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，样品液体中的多种组分包括标记的聚糖。在这些方法的某些中，可以使用聚糖标记试剂来标记聚糖，该聚糖标记试剂可以选自质谱(MS)活性快速荧光标记化合物、普鲁卡因胺试剂和普鲁卡因试剂。在这些方法的某些中，可以使用聚糖标记试剂来标记聚糖，该聚糖标记试剂提供了两亲碱性部分，该两亲碱性部分：(a)具有大于7、大于8或甚至大于9的pKa值，并且/或者(b)具有介于0和5之间的Log P值，典型地Log P值介于1和5之间，更典型地Log P值介于1和3之间。在本公开中使用的聚糖标记试剂的具体示例包括购自Waters Corporation(Milford,MA,USA)的RapiFluor-MS试剂或购自ProZyme Inc.(Hayward,CA USA)的InstantPC试剂。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第一流动相可以包括水或者有机酸和/或有机酸盐的水性溶液，其示例提供于上文中。
在可以结合上述方面和实施方案中的任一者使用的各种实施方案中，第二流动相可以包括有机酸和/或有机酸盐的溶液，其示例提供于上文中。在这些实施方案的一些中，第二流动相包括有机酸和/或有机酸盐在包括水和有机溶剂(甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲基乙基酮、四氢呋喃以及它们的共混物)的溶剂中的溶液。在这些实施方案的一些中，第二流动相包括有机酸和有机酸盐。在这些实施方案的一些中，提供了第二流动相的洗脱过程，在此期间有机酸的浓度增加并且有机酸盐的浓度增加。
附图说明
图1A是根据本公开的液相色谱系统的示意图。
图1B至图1C展示了根据本公开的包括捕集柱和分析柱的捕集-洗脱色谱系统的两条流动路径。图1B是用于装载捕集柱的流体路径的示意图。图1C是用于从捕集柱洗脱并且跨分析柱产生梯度的流体路径的示意图。
图2A是根据本公开的一个实施方案的包括捕集柱和分析柱的捕集-洗脱色谱系统的示意图。
图2B是根据本公开的另一个实施方案的包括捕集柱和分析柱的捕集-洗脱色谱系统的示意图。
图3是示出固定相(DEAP HPCM 1.7μm)的混合模式保留性的色谱图。记录了每种物质在流动相条件下存在时的近似净电荷。
图4展示了表面电荷和烷基链长不同的四个相的混合模式保留性。示出了中性、单唾液酸化和二唾液酸化的RapiFluor-MS试剂标记的聚糖的保留时间(DEAP＝二乙基氨基丙基，tC18＝三官能C18，4-PE＝4-吡啶基乙基，tC8＝三官能C8)。
图5A至图5D展示了结合利用相2的捕集和相1的分析色谱的捕集-洗脱色谱。示出了在初始流动相条件下用不同浓度的甲酸铵获得的RapiFluor-MS试剂标记的人IgG聚糖的荧光色谱图。
图6展示了在烷基链长、可离子化改性剂和可离子化改性剂的覆盖率方面不同的四个相的混合模式保留性。示出了中性、单唾液酸化和二唾液酸化的RapiFluor-MS试剂标记的聚糖的保留时间(DEAP＝二乙基氨基丙基，tC18＝三官能C18，4-PE＝4-吡啶基乙基)。
图7A至图7C展示了结合利用三个不同相的捕集和相1的分析色谱的捕集-洗脱色谱。示出了在初始流动相条件下用不同浓度的甲酸铵获得的RapiFluor-MS试剂标记的人IgG聚糖的荧光色谱图。
图8A至图8C展示了来自捕集-洗脱色谱的回收率随用于初始流动相/捕集条件的甲酸铵浓度的变化。图8A至图8C示出了以观察到的荧光峰面积的形式提供的三种不同类别的RapiFluor-MS试剂标记的中性N-聚糖的回收率。在图8A至图8C中，荧光峰面积的最大值用水平虚线标记，如由如图8D所示的直接进样(无捕集)分析观察到的荧光峰面积所估计的。
图9A至图9C展示了针对初始和最终的甲酸铵流动相浓度优化的捕集-洗脱色谱。示出了RapiFluor-MS试剂标记的聚糖与合并的人IgG和牛胎球蛋白的分离情况。图9A是分别用0mM甲酸铵/22mM甲酸和22mM甲酸铵/22mM甲酸的初始缓冲剂浓度和最终缓冲剂浓度直接进样(无捕集)获得的荧光色谱图。图9B是分别用14mM甲酸铵/14mM甲酸和22mM甲酸铵/22mM甲酸的初始缓冲剂浓度和最终缓冲剂浓度直接进样(无捕集)获得的荧光色谱图。图9C是分别使用14mM甲酸铵/14mM甲酸和22mM甲酸铵/22mM甲酸的初始缓冲剂浓度和最终缓冲剂浓度从捕集-洗脱色谱获得的荧光色谱图。
具体实施方式
用于对液体样品进行捕集-洗脱液相色谱分析的系统和方法示意性地示于图1A至图1C中。转到图1A，示出了液相色谱系统100，该液相色谱系统包括：(a)捕集柱106，该捕集柱包括固定相材料(下文进一步详细描述)，在本文中也称为“捕集相材料”、“捕集相”或“第一色谱材料”，(b)分析柱107，该分析柱包括固定相材料(下文进一步详细描述)，在本文中也称为“分析相材料”、“分析相”或“第二色谱材料”，(c)进样器，该进样器包括样品环112和用于将液体样品接收到样品环112中(例如，经由采样附件诸如样品针108)的六端口进样阀102，(d)第一流动路径F1，该第一流动路径包括捕集柱106但不包括分析柱107，(e)第二流动路径F2，该第二流动路径包括捕集柱106和分析柱107，(f)第一流动相递送源(例如，示出了第一泵104a)，该第一流动相递送源被配置为沿第一流动路径泵送第一流动相，以及(g)第二流动相递送源(例如，示出了第二泵104b)，该第二流动相递送源被配置为沿第二流动路径泵送第二流动相。多端口捕集-洗脱阀(示出了三端口阀103)用于建立第一流动路径和第二流动路径。(在其他实施方案中，可以采用通气柱设置。)虽然未展示，但液相色谱系统100还可以包括一个或多个检测器，该一个或多个检测器被配置为分析从分析柱出现的分离的样品组分，包括用于执行质谱(MS)的检测器。这些包括电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)和飞行时间质谱(TOFMS)、核磁共振、红外分析、紫外分析或它们的组合，等等。
在第一步骤中，并且具体地也参照图1B，该方法包括经由进样器引入液体样品，使用第一泵104a使第一流动相流过第一流动路径F1(用虚线箭头指示)，使得液体样品被引导通过捕集柱106并且使得捕集柱106捕集液体样品的组分的至少一部分作为捕集的组分。在该第一步骤期间，可以将多端口捕集-洗脱阀103设定到第一位置，使得从捕集柱106出现的第一流动相被引导至废物管线111。在该第一步骤之后，并且具体地也参照图1C，使用第二泵104b使第二流动相流过第二流动路径F2(用虚线箭头指示)，其中流过第二流动路径F2包括使第二流动相(a)流过捕集柱106，使得捕集的组分的至少一些从捕集柱106洗脱作为洗脱的组分，并且(b)流过分析柱107，使得洗脱的组分的至少一些被分离作为分离的组分。然后可以根据需要对分离的洗脱组分进行进一步分析。在该第一步骤期间，可以将多端口捕集-洗脱阀103设定到第二位置，使得从捕集柱106出现的第二流动相被引导至分析柱107。
尽管结合图1A至图1C对第一泵104a和第二泵104b进行了描述，但是在其他实施方案中，可以使用单个泵来泵送流动相。
现在将结合图2A所示的液相色谱系统100描述附加细节。所示的系统100包括连接到流动相递送源104的六端口进样阀102。在所示的实施方案中，流动相递送源104是购自Waters Corporation的微型二元溶剂管理器(μBSM)系统，其能够以两种溶剂的各种组合递送最多四种溶剂。流动相递送源104通过六端口进样阀102的所选择的内部流体通路递送流动相液体。由捕集-洗脱阀103隔开的捕集柱106和分析柱107也连接到六端口进样阀102。如先前所指出的，捕集柱106和分析柱107与流动相协同作用，以实现对引入到系统中的各种样品组分的捕集和分离。
采样附件(在该实施方案中为样品针108)也连接到六端口进样阀102。样品针108可以被插入到样品容器(未示出)中，以用于获取被容纳在样品容器内的样品溶液的等分试样。样品针108是样品溶液进入通向进样阀102的样品环112的样品摄取或抽吸路径中的入口点。注射器110连接到六端口进样阀102。注射器110与进样阀102协作地相互作用，以通常通过引起样品针108内的样品液体的规定体积位移来控制样品通过样品针108的摄取或抽吸。与六端口进样阀102流体连通的样品环112具有上游环端部112u和下游环端部112d。当六端口进样阀102处于样品吸入配置时，注射器110与外部样品环112的上游环端部112u流体连通，而样品针108与下游环端部112d流体连通。在该例示性配置中，可以通过注射器110的动作将样品从样品容器抽吸到样品环112中。
另一方面，当六端口进样阀102转换到捕集/洗脱配置时，阀112内部的流体连通模式发生变化，从而使流体流动改变方向。在进样阀102处于捕集/洗脱配置的情况下，流动相递送源104与样品环112的上游环端部112u流体连通，而捕集柱106与样品环112的下游端部112d流体连通。另外，当进样阀102处于捕集/洗脱配置时，样品环112的下游端部112d经由端口6和管线113与捕集柱106的上游端部106u流体连通。因此，当进样阀102处于捕集/洗脱配置时，源自流动相递送源104的流动相流推动容纳在样品环112内的任何样品溶液通过管线113并且进入捕集柱106。
捕集柱106的下游是捕集-洗脱阀103。尽管所示的阀103是六端口阀，但是在所示的实施方案中，由于其中三个端口用销塞109塞住，该六端口阀实际上是三端口阀。因此，具有三个端口和两种流动模式的简单三通阀(例如，在如图1A所示的T形阀处)也可以用作捕集-洗脱阀103。捕集柱的下游端部在端口1处连接到捕集-洗脱阀103的端口，如图所示。捕集-洗脱阀103的端口2附接到废物管线111，并且端口6连接到捕集柱107。在捕集-洗脱阀103的捕集位置，捕集柱106的下游端部106d与废物管线111流体连通，从而为流动相提供第一流动路径。
另一方面，在捕集-洗脱阀103处于洗脱位置的情况下，捕集柱106的下游端部106d与分析柱107的上游端部107u流体连通，从而为流动相提供第二流动路径。在该位置，源自流动相递送源104的流动相流推动容纳在捕集柱106内的样品从捕集柱106流过分析柱107。
图2B示出了根据本公开所示的液相色谱系统100的一个另选的实施方案。通过比较图2A和图2B可以看出，系统100的不同之处在于，其包括与端口5流体连通的附加的流动相递送源104a，捕集-洗脱阀103是没有端口被塞住的六端口阀，管线113与捕集-洗脱阀103的端口2(而不是捕集柱106的上游端部106u)流体连通，废物管线111与捕集-洗脱阀103的端口3流体连通，并且捕集柱与捕集-洗脱阀103的端口1和端口4流体连接。
如图2A所示，当六端口进样阀102处于样品吸入配置时，注射器110与外部样品环112的上游环端部112u流体连通，而样品针108与外部样品环112的下游环端部112d流体连通，从而允许通过注射器110的动作将样品从样品容器抽吸到样品环112中。同样类似于图2A，当六端口进样阀102转换到捕集配置时，源自流动相递送源104的流动相流推动容纳在样品环112内的任何样品溶液进入管线113。
六端口捕集-洗脱阀103可以以多种配置放置，包括捕集配置和洗脱配置。当六端口捕集-洗脱阀103处于捕集配置时，捕集柱106的上游端部106u与管线113流体连通，从而允许从六端口进样阀102接收样品溶液(当进样阀102处于捕集配置时)，同时捕集柱106的下游端部106d与废物管线111流体连通。因此，在捕集-洗脱阀103的捕集位置，形成了用于流动相的第一流动路径，该第一流动路径从流动相递送源104延伸，穿过样品环112、穿过管线113、穿过捕集柱106，然后进入废物管线111中。
另一方面，当六端口捕集-洗脱阀103处于洗脱配置时，捕集柱106的上游端部106u与附加的流动相递送源104a流体连通，而捕集柱106的下游端部106d与分析柱107的上游端部107u流体连通。因此，在捕集-洗脱阀103的洗脱位置，形成了用于流动相的第二流动路径，该第二流动路径从附加的流动相递送源104a延伸，穿过捕集柱106，然后穿过分析柱107。
已经描述了捕集-洗脱液相色谱系统100及其操作的实施方案，现在将描述此类系统用于混合模式捕集-洗脱色谱的用途。就本发明人所知，用于具有混合模式分离的捕集-洗脱色谱的系统和技术尚未开发。应当理解，对给定捕集-洗脱混合模式色谱系统的开发并非微不足道，因为当寻求将捕集相的特性与所选择的混合模式分析相的特性相匹配时，要考虑多种保留机制。在下面的公开内容中，描述了与混合模式捕集-洗脱色谱一起使用的最佳色谱材料和方法。
一般来讲，将本公开中所采用的捕集柱选择为当与分析柱相比时具有较低的保留性。梯度洗脱期间捕集柱保留性和分析柱保留性之间的这种关系确保被分析物重新聚焦到分析柱上，从而将高峰值容量分离递送到任何下游检测器。
在开发适宜的捕集相材料和分析相材料时，本发明人已分析了捕集相相对于分析相的相对保留性，以建立最优化的捕集-洗脱色谱系统。因此，涉及各种固定相上的一维分离的筛选实验可以用于评估捕集相与给定分析相一起使用的潜在效用。也就是说，捕集相的适宜性可以通过将其保留曲线与预期分析相的保留曲线进行比较来评定。在随后的具体实施方案中，所采用的分析相是如授予Lauber等人的WO 2017/189357中所述的DEAP HPCM材料。
如上所述，授予Lauber等人的WO 2017/189357描述了其中所述的所谓二乙基氨基丙基带电表面杂化固定相材料(DEAP HPCM)用于分离用两亲强碱性部分标记的聚糖的用途，该两亲强碱性部分诸如标记试剂RapiFluor-MS试剂，其购自Waters Corporation(Milford,MA,USA)并且描述于例如授予Brousmiche等人的WO 2013/049622和MatthewA.Lauber等人，“Rapid Preparation of Released N Glycans for HILIC AnalysisUsing a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MSDetection，”Anal.Chem.2015,87,5401-5409中。DEAP HPCM先前已示出可高效分离RapiFluor-MS标记的聚糖，因为这种聚糖已用相对高pKa(约10)的可离子化改性剂改性，该改性剂产生了独特的明显阴离子保留。
与图3至图9C的生成相关联的程序在下面的实施例中详细描述。转到图3，DEAPHPCM固定相的保留曲线的表示以中性(净电荷＝+1)(命名为FA2G2)、单唾液酸化(净电荷＝0)(命名为FA2G2S1)和二唾液酸化(净电荷＝-1)(命名为FA2G2)RapiFluor-MS标记的N-聚糖物质的提取离子色谱图的形式示出。这三种指出的物质的保留时间提供了固定相的保留性和选择性的指示。如图4的曲线图所示，发现DEAP HPCM(相1)由于其长的C18疏水键合而具有相对高的平均保留性，然而也由于其高pKa可离子化改性剂(即，二乙基氨基丙基可离子化改性剂)和比较强的阴离子交换特性而表现出高选择性(即，不同带电物质之间的保留差异)。
DEAP HPCM的理想捕集相将是对每类(电荷状态)被分析物都具有降低极低程度的保留性的捕集相。为了做到这一点，本发明人检查了三种潜在捕集相的保留曲线，其中每种捕集相都具有烷基键合与可离子化改性剂的独特组合，具体地讲，C4烷基键合与4-吡啶基乙基(4-PE)可离子化基团的组合(图3中的相2)、C8烷基键合与4-PE可离子化基团的组合(图3中的相3)，以及C4烷基键合与没有可离子化基团的组合(图3中的相4)。已假设较短的烷基键合将是找到适宜捕集的可行途径。然而，由相4的结果可以看出，没有任何可离子化改性剂的烷基C4键合产生了次最佳的保留曲线，特别是对于具有正的溶液中净电荷的物质(FA2G2)来说过强的保留性。因此，发明人还研究了改变捕集相的表面电势。为了不产生任何将大于DEAP HPCM分析相的混合模式选择性，然后研究了较低pKa的可离子化改性剂(4-吡啶基乙基，4-PE)。有趣的是，将C8烷基键合与4-PE可离子化改性剂组合的相(相3)的保留曲线证明与DEAP HPCM非常相似，然而相3仍表现出比具有正的溶液中净电荷的某些物质(诸如FA2G2)所期望的更高的保留性。相比之下，基于C4烷基键合与较弱pKa 4-PE改性剂配对的相(相2)给出了针对每种被分析物类别的接近理想的保留曲线。这些数据证明，对于给定的混合模式分析固定相，可以通过减弱保留性和混合模式选择性来产生用于捕集的最佳材料。
基于上述筛选实验，选择相2捕集柱连同DEAP HPCM(相1)分析柱一起用于捕集-洗脱配置(图5A至图5D)。探索了用于优化RapiFluor-MS标记的人IgG N-聚糖的分离的方法，首先从使用先前发现的条件开始，用DEAP HPCM柱进行示例性的直接进样分离。这种特定的方法需要使用100％水的初始流动相组成，这也是捕集-洗脱配置的捕集流动相组成的定义。图5D显示了使用这种方法捕集到相2上所获得的色谱图。值得注意的是，发现该色谱图缺少带正净电荷的聚糖结构(RapiFluor-MS试剂标记的中性N-聚糖)。本发明人先前已发现，对这些物质的保留性的显著影响与电荷排斥相关。因此，初始流动相组成的离子强度增加，继而具有正净电荷状态的物质的回收率显著提高(图5A至图5C)。然而，发现使用≥15mM甲酸铵/15mM甲酸初始流动相组成不足以有效保留疏水性最差的聚糖物质(例如，甘露糖5)。此外，在梯度的初始条件下使用较高的缓冲剂浓度导致阴离子交换选择性不期望地降低。
为了进一步调节保留性，4-PE的覆盖率从大约0.3μmol/m2(相2)变化为0.2μmol/m2(相5)和0.1μmol/m2(相6)。每种相的保留性以及相1的保留性在图6中示出。相5和相6各自示出探针对RapiFluor-MS试剂标记的中性聚糖物质(FA2G2)的保留性的有利增加。此外，发现它们在捕集-洗脱配置中的性能相当有前景，如图7所示。具体地讲，相6似乎显著提高了疏水性最小的中性N-聚糖的回收率，并且较少依赖于初始流动相组成。为了定量地观察这一点，我们分析了保留最弱的聚糖物质的峰面积随捕集相和初始流动相组成的变化。图8A至图8C显示了这些数据连同如用直接进样实验观察到的针对所指出的聚糖物质的峰面积所标记的值。实际上，考虑到即使采用针对初始流动相组成使用低缓冲剂浓度的方法，相6也在谱图中示出保留最弱物质的回收率，所以相6被证明是最适宜的捕集相。
对相6捕集柱和DEAP HPCM分析柱的组合进行进一步的方法优化。通过调节离子强度梯度，发现该捕集-洗脱方法能够产生与直接进样分离相当的分辨率。图9A至图9C显示了该捕集-洗脱混合模式色谱连同如用直接进样LC配置获得的分离的比较例的示例性结果。
本领域一直需要可以有利于混合模式分离的捕集-洗脱色谱的方法。本公开解决了在产生具有的特性最佳匹配所选择的混合模式分析相的那些特性的捕集相中存在的挑战，即对于不同类别的相关被分析物类型，保留性降低，然而混合模式选择性却相似。这些被分析物中所选择的一些包括克雷伯氏循环(Kreb’s cycle)的酸性代谢物(包括但不限于柠檬酸盐、异柠檬酸盐、酮戊二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐和草酰乙酸盐)、寡核苷酸、草甘膦及其相关的衍生类似物，以及肽和聚糖。
还已发现，通过使用相比预期的分析相较弱的(即，较低pKa的碱/高pKa的酸)可离子化改性剂和较短的疏水烷基基团，可以制备具有适当减弱的保留性和混合模式选择性的捕集材料。在一个实施方案中，选择用于捕集相的可离子化改性剂，其pKa与分析相的可离子化改性剂的pKa相差至少1个单位，更理想地pKa相差至少2个单位。在该相同的实施方案中，选择疏水表面基团用于捕集相，其与分析相相比包含更少的碳原子，通常少至少2个碳，更理想地少至少4个碳，并且优先地少至少6个碳。
此外，已经发现，通过调节其可离子化改性剂的覆盖率，可以使材料更有效地捕集。在一个实施方案中，可离子化改性剂的覆盖率小于0.3μmol/m2，还更理想地小于0.2μmol/m2，并且进一步还小于或等于0.1μmol/m2。
此外，本公开规定了使用具有离子强度的溶液作为在遇到电荷排斥的情况下提高被分析物的捕集回收率的手段。因此，在本公开的又一个实施方案中，所指出的捕集材料可以与大于0mM、更理想地大于1mM、但典型地小于40mM的初始流动相总缓冲剂浓度一起使用，以便不会过度显著地限制可用的混合模式选择性。
本公开的附加方面现在将在以下枚举的方面中描述：
方面A1。一种液相色谱系统，包括：捕集柱，该捕集柱包括具有第一色谱表面的第一色谱材料，该第一色谱表面包含第一疏水表面基团和具有第一pKa值的第一可离子化表面基团；分析柱，该分析柱包括具有第二色谱表面的第二色谱材料，该第二色谱表面包含疏水性大于第一疏水表面基团的疏水性的第二疏水表面基团和(i)永久性离子化的表面基团或(ii)具有与第一pKa值相差1个单位至12个单位的第二pKa值的第二可离子化表面基团；进样器，该进样器用于将液体样品引入到系统中；检测器，该检测器能够检测组分的特性；第一流动路径，该第一流动路径包括进样器和捕集柱，但不包括分析柱；第二流动路径，该第二流动路径包括捕集柱和分析柱；以及一个或多个流动相递送源，该一个或多个流动相递送源被配置为沿第一流动路径泵送第一流动相并且沿第二流动路径泵送第二流动相。
方面A2。方面A1的液相色谱系统，其中一个或多个流动相递送源包括第一泵和第二泵，第一泵被配置为沿第一流动路径泵送第一流动相，第二泵可以与第一泵相同或不同，第二泵被配置为沿第二流动路径泵送第二流动相。
方面A3。方面A1至方面A2中任一项的液相色谱系统，其中第一色谱材料为第一颗粒的形式，并且其中第二色谱材料为第二颗粒的形式。
方面A4。方面A3的液相色谱系统，其中第一颗粒的第一直径大于等于第二颗粒的第二直径。
方面A5。方面A4的液相色谱系统，其中第一颗粒直径与第二颗粒直径的比率在从1至10的范围内。
方面A6。方面A4至方面A5中任一项的液相色谱系统，其中第一直径在从2微米至10微米的范围内。
方面A7。方面A1至A6中任一项的液相色谱系统，其中捕集柱的内径大于或等于分析柱的内径，并且其中捕集柱的长度短于分析柱的长度。
方面A8。方面A1至方面A7中任一项的液相色谱系统，其中捕集柱的内径为分析柱的内径的1.5倍至5倍。
方面A9。方面A1至方面A8中任一项的液相色谱系统，其中捕集柱的体积在分析柱的体积的从0.05倍至0.5倍的范围内。
方面A10。方面A1至方面A9中任一项的液相色谱系统，其中第一疏水表面基团和第二疏水表面基团为烃基团，并且其中第二疏水表面基团含有比第一疏水表面基团更多的碳原子。
方面A11。方面A10的液相色谱系统，其中第二烃基团比第一烃基团多含2个至20个碳原子。
方面A12。方面A10至方面A11中任一项的液相色谱系统，其中第一烃基团为含有从3个至8个碳原子的第一烷基基团，并且其中第二烃基团为含有从10个至24个碳原子的第二烷基基团。
方面A13。方面A12的液相色谱系统，其中第一烷基基团含有4个碳原子，并且其中第二基团含有18个碳原子。
方面A14。方面A1至方面A13中任一项的液相色谱系统，其中第一可离子化基团以小于或等于永久性离子化基团或第二可离子化基团的表面浓度的表面浓度存在。
方面A15。方面A1至方面A14中任一项的液相色谱系统，其中第一可离子化基团以从0.03微摩尔/平方米至0.3微摩尔/平方米范围内的表面浓度存在。
方面A16。方面A1至方面A15中任一项的液相色谱系统，其中第一可离子化基团和永久性离子化基团或第二可离子化基团在离子化时带正电。
方面A17。方面A16的液相色谱系统，其中第二色谱表面包含第二可离子化表面基团，其中第一pKa值和第二pKa值大于3，并且其中第二pKa值比第一pKa值大1个单位至7个单位。
方面A18。方面A1至方面A17中任一项的液相色谱系统，其中(a)第一可离子化基团和(b)永久性离子化基团或第二可离子化基团包括胺基团。
方面A19。方面A18中任一项的液相色谱系统，其中第一可离子化基团选自伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团，并且永久性离子化基团或第二可离子化基团选自仲胺基团、叔胺基团和季铵基团。
方面A20。方面A1至方面A17中任一项的液相色谱系统，其中第一可离子化基团选自4-吡啶基乙基、2-吡啶基乙基、2-咪唑啉基丙基、3-丙基苯胺或咪唑基团。
方面A21。方面A1至方面A18中任一项的液相色谱系统，其中第二可离子化基团选自二乙基氨基丙基、乙基氨基丙基、二甲基氨基丙基、甲基氨基丙基、氨基丙基、二乙基氨基甲基、3-[双(2-羟基乙基)氨基]丙基、正丁基-氮杂-硅杂环戊烷、N-甲基-氮杂-硅杂环戊烷或双-3-甲基氨基丙基甲硅烷基基团。
方面A22。方面A1至方面A21中任一项的液相色谱系统，其中第一疏水表面基团与第一可离子化基团的摩尔比在从5:1至200:1的范围内。
方面A23。方面A1至方面A15中任一项的液相色谱系统，其中第一可离子化基团和第二可离子化基团在离子化时带负电。
方面A24。方面A23的液相色谱系统，其中第一可离子化基团为羧酸基团，并且第二可离子化基团选自磺酸基团和羧酸基团。
方面A25。方面A23至A24中任一项的液相色谱系统，其中第二pKa值比第一pKa值小1个单位至4个单位。
方面A26。方面A1至方面A25中任一项的液相色谱系统，其中第一色谱材料是具有第一材料的芯的第一颗粒的形式，并且其中第二色谱材料是具有第二材料的芯的第二颗粒的形式。
方面A27。方面A26的液相色谱系统，其中第一材料和第二材料是有机材料、无机材料或有机-无机杂化材料。
方面A28。方面A26的液相色谱系统，其中第一材料和第二材料选自基于二氧化硅的材料、基于氧化铝的材料、基于二氧化钛的材料、基于氧化锆的材料和基于碳的材料。
方面A29。方面A26的液相色谱系统，其中第一材料和第二材料是通过水解缩合一种或多种有机硅烷化合物而形成的基于二氧化硅的材料。
方面A30。方面A29的液相色谱系统，其中有机硅烷化合物包括一种或多种烷氧基硅烷化合物。
方面A31。方面A29的液相色谱系统，其中有机硅烷化合物由四烷氧基硅烷和烷基烷氧基硅烷制备。
方面A32。方面A26的液相色谱系统，其中第一材料和第二材料包括有机聚合物。
方面A33。方面A1至方面A32中任一项的液相色谱系统，其中进样器包括样品环或流通针。
方面A34。一种使用方面A1至方面A33中任一项的液相色谱系统对包含多种组分的液体样品执行液相色谱分析的方法，该方法包括：经由进样器将液体样品引入到系统中；使用一个或多个流动相递送源使第一流动相流过第一流动路径，使得液体样品被引导通过捕集柱，并且使得捕集柱捕集液体样品的组分的至少一部分作为捕集的组分；使用一个或多个流动相递送源一个或多个流动相递送源使第二流动相流过第二流动路径，其中流过第二流动路径包括使第二流动相(a)流过捕集柱，使得捕集的组分的至少一些从捕集柱洗脱作为洗脱的组分，并且(b)流过分析柱，使得洗脱的组分的至少一些被分离作为分离的组分；以及使分离的洗脱组分流至检测器。
方面A35。方面A34的方法，其中组分包括聚糖。
方面A36。方面A34的方法，其中组分包括标记的聚糖。
方面A37。方面A36的方法，其中标记的聚糖是用标记试剂标记的，该标记试剂选自MS活性快速荧光标记化合物、普鲁卡因胺试剂、或普鲁卡因试剂。
方面A38。方面A36至方面A37中任一项的方法，其中标记的聚糖是用提供pKa值大于6的两亲强碱性部分的聚糖标记试剂标记的。
方面A39。方面A34至方面A38中任一项的方法，其中第一流动相包括(i)水或(ii)第一有机酸和/或第一有机酸盐的水性溶液。
方面A40。方面A39的方法，其中第二流动相包括第二有机酸和/或第二有机酸盐的溶液，该第二有机酸可以与第一有机酸相同或不同，该第二有机酸盐可以与第一有机酸盐相同或不同。
方面A41。方面A34至方面A38中任一项的方法，其中第一流动相包括有机酸和有机酸盐在包括水和有机溶剂的溶剂中的溶液，并且其中第二流动相包括洗脱过程，在该洗脱过程期间，有机酸的浓度增加并且有机酸盐的浓度增加。
方面B1。一种包括色谱颗粒的色谱柱，这些色谱颗粒包括芯和色谱表面，该色谱表面包含具有从3个至8个碳原子的疏水表面基团和具有在从3至8范围内的pKa值的可离子化表面基团，其中这些可离子化基团以从0.03微摩尔/平方米至0.3微摩尔/平方米范围内的表面浓度存在。
方面B2。方面B1的色谱柱，其中可离子化基团选自4-吡啶基乙基、2-吡啶基乙基、2-咪唑啉基丙基、3-丙基苯胺或咪唑基团。
方面B3。方面B1至方面B2中任一项的色谱柱，其中第一疏水表面基团与可离子化基团的摩尔比在从5:1至200:1的范围内。
方面B4。方面B1至方面B3中任一项的色谱柱，其中芯选自有机材料、无机材料或有机-无机杂化材料。
方面B5。方面B1至方面B3中任一项的色谱柱，其中芯选自基于二氧化硅的材料、基于氧化铝的材料、基于二氧化钛的材料、基于氧化锆的材料和基于碳的材料。
方面B6。方面B1至方面B3中任一项的色谱柱，其中芯是通过水解缩合一种或多种有机硅烷化合物而形成的基于二氧化硅的材料。
方面B7。方面B6的色谱柱，其中有机硅烷化合物包括一种或多种烷氧基硅烷化合物。
方面B8。方面B6的色谱柱，其中有机硅烷化合物由四烷氧基硅烷和烷基烷氧基硅烷制备。
方面C1。一种套件，包括：(a)捕集柱，该捕集柱包括具有第一色谱表面的第一色谱材料，该第一色谱表面包含第一疏水表面基团和具有第一pKa值的第一可离子化表面基团，和(b)分析柱，该分析柱包括具有第二色谱表面的第二色谱材料，该第二色谱表面包含疏水性大于第一疏水表面基团的疏水性的第二疏水表面基团和(i)永久性离子化的表面基团或(ii)具有与第一pKa值相差1个单位至12个单位的第二pKa值的第二可离子化表面基团。
方面C2。方面C1的套件，其中第一色谱材料为第一颗粒的形式，并且其中第二色谱材料为第二颗粒的形式。
方面C3。方面C2的套件，其中第一颗粒的第一直径大于等于第二颗粒的第二直径。
方面C4。方面C3的套件，其中第一颗粒直径与第二颗粒直径的比率在从1至10的范围内。
方面C5。方面C3至方面C4中任一项的套件，其中第一直径在从2微米至10微米的范围内。
方面C6。方面C1至方面C5中任一项的套件，其中捕集柱的内径大于或等于分析柱的内径，并且其中捕集柱的长度短于分析柱的长度。
方面C7。方面C1至方面C6中任一项的套件，其中捕集柱的内径为分析柱的内径的1.5倍至5倍。
方面C8。方面C1至方面C7中任一项的套件，其中捕集柱的体积在分析柱的体积的从0.05倍至0.5倍的范围内。
方面C9。方面C1至方面C8中任一项的套件，其中第一疏水表面基团和第二疏水表面基团为烃基团，并且其中第二疏水表面基团含有比第一疏水表面基团更多的碳原子。
方面C10。方面C9的套件，其中第二烃基团比第一烃基团多含2个至20个碳原子。
方面C11。方面C9至方面C10中任一项的套件，其中第一烃基团为含有从3个至8个碳原子的第一烷基基团，并且其中第二烃基团为含有从10个至24个碳原子的第二烷基基团。
方面C12。方面C11的套件，其中第一烷基基团含有4个碳原子，并且其中第二基团含有18个碳原子。
方面C13。方面C1至方面C12中任一项的套件，其中第一可离子化基团以小于或等于永久性离子化基团或第二可离子化基团的表面浓度的表面浓度存在。
方面C14。方面C1至方面C13中任一项的套件，其中第一可离子化基团以从0.03微摩尔/平方米至0.3微摩尔/平方米范围内的表面浓度存在。
方面C15。方面C1至方面C14中任一项的套件，其中第一可离子化基团和永久性离子化基团或第二可离子化基团在离子化时带正电。
方面C16。方面C15的套件，其中第二色谱表面包含第二可离子化表面基团，其中第一pKa值和第二pKa值大于3，并且其中第二pKa值比第一pKa值大1个单位至7个单位。
方面C17。方面C1至方面C16中任一项的套件，其中(a)第一可离子化基团和(b)永久性离子化基团或第二可离子化基团包括胺基团。
方面C18。方面C17中任一项的套件，其中第一可离子化基团选自伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团，并且永久性离子化基团或第二可离子化基团选自伯胺基团、仲胺基团、叔胺基团和季铵基团。
方面C19。方面C1至方面C16中任一项的套件，其中第一可离子化基团选自4-吡啶基乙基、2-吡啶基乙基、2-咪唑啉基丙基、3-丙基苯胺或咪唑基团。
方面C20。方面C1至方面C17中任一项的套件，其中第二可离子化基团选自二乙基氨基丙基、乙基氨基丙基、二甲基氨基丙基、甲基氨基丙基、氨基丙基、二乙基氨基甲基、3-[双(2-羟基乙基)氨基]丙基、正丁基-氮杂-硅杂环戊烷、N-甲基-氮杂-硅杂环戊烷或双-3-甲基氨基丙基甲硅烷基基团。
方面C21。方面C1至方面C20中任一项的套件，其中第一疏水表面基团与第一可离子化基团的摩尔比在从5:1至200:1的范围内。
方面C22。方面C15至方面C21中任一项的套件，其中该套件包括聚糖标记试剂
方面C23。方面C22的套件，其中聚糖标记试剂选自MS活性快速荧光标记化合物、普鲁卡因胺试剂或普鲁卡因试剂。
方面C24。方面C22至C23中任一项的套件，其中聚糖标记试剂提供pKa值大于6的两亲强碱性部分。
方面C25。方面C1至方面C14中任一项的套件，其中第一可离子化基团和第二可离子化基团在离子化时带负电。
方面C26。方面C25的套件，其中第一可离子化基团为羧酸基团，并且第二可离子化基团选自磺酸基团和羧酸基团。
方面C27。方面C25至方面C26中任一项的套件，其中第二pKa值比第一pKa值小1个单位至4个单位。
方面C28。方面C1至方面C27中任一项的套件，其中该套件还包括洗脱剂。
方面C29。方面C1至方面C28中任一项的套件，其中第一色谱材料是具有第一材料的芯的第一颗粒的形式，并且其中第二色谱材料是具有第二材料的芯的第二颗粒的形式。
方面C30。方面C29的套件，其中第一材料和第二材料是有机材料、无机材料或有机-无机杂化材料。
方面C31。方面C29的套件，其中第一材料和第二材料选自基于二氧化硅的材料、基于氧化铝的材料、基于二氧化钛的材料、基于氧化锆的材料和基于碳的材料。
方面C32。方面C29的套件，其中第一材料和第二材料是通过水解缩合一种或多种有机硅烷化合物而形成的基于二氧化硅的材料。
方面C33。方面C32的套件，其中有机硅烷化合物包括一种或多种烷氧基硅烷化合物。
方面C34。方面C32的套件，其中有机硅烷化合物由四烷氧基硅烷和烷基烷氧基硅烷制备。
方面C35。方面C29的套件，其中第一材料和第二材料包括有机聚合物。
方面D1。一种用于对液体样品执行液相色谱分析的方法，该方法包括：将包含多种组分的液体样品装载到液相色谱系统中的第一流动路径中；使第一流动相流过第一流动路径，使得液体样品被引导通过捕集柱，其中捕集柱包括具有第一色谱表面的第一色谱材料，该第一色谱表面包含第一疏水表面基团和具有第一pKa值的第一可离子化表面基团，并且其中捕集柱捕集液体样品的组分的至少一些作为捕集的组分；并且使第二流动相流过液相色谱系统中的第二流动路径，其中流过第二流动路径包括使第二流动相流过捕集柱，以从捕集柱洗脱捕集的组分的至少一些作为洗脱的组分，以及使第二流动相和洗脱的组分流过分析柱，该分析柱能够分离洗脱的组分的至少一些作为分离的组分，其中分析柱包括具有第二色谱表面的第二色谱材料，该第二色谱表面包含疏水性大于第一疏水表面基团的疏水性的第二疏水表面基团和(i)永久性离子化的表面基团或(ii)具有与第一pKa值相差1个单位至12个单位的第二pKa值的第二可离子化表面基团。
方面D2。方面D1的方法，还包括使分离的组分流至能够检测分离的组分的特性的检测器。
方面D3。方面D1至方面D2中任一项的方法，其中第一色谱材料为第一颗粒的形式，并且其中第二色谱材料为第二颗粒的形式。
方面D4。方面D3的方法，其中第一颗粒的第一直径大于等于第二颗粒的第二直径。
方面D5。方面D4的方法，其中第一颗粒直径与第二颗粒直径的比率在从1至10的范围内。
方面D6。方面D4至方面D5中任一项的方法，其中第一直径在从2微米至10微米的范围内。
方面D7。方面D1至方面D6中任一项的方法，其中捕集柱的内径大于或等于分析柱的内径，并且其中捕集柱的长度短于分析柱的长度。
方面D8。方面D1至方面D7中任一项的方法，其中捕集柱的内径为分析柱的内径的1.5倍至5倍。
方面D9。方面D1至方面D8中任一项的方法，其中捕集柱的体积在分析柱的体积的从0.05倍至0.5倍的范围内。
方面D10。方面D1至方面D9中任一项的方法，其中第一疏水表面基团和第二疏水表面基团为烃基团，并且其中第二疏水表面基团含有比第一疏水表面基团更多的碳原子。
方面D11。方面D10的方法，其中第二烃基团比第一烃基团多含2个至20个碳原子。
方面D12。方面D10至方面D11中任一项的方法，其中第一烃基团为含有从3个至8个碳原子的第一烷基基团，并且其中第二烃基团为含有从10个至24个碳原子的第二烷基基团。
方面D13。方面D12的方法，其中第一烷基基团含有4个碳原子，并且其中第二基团含有18个碳原子。
方面D14。方面D1至方面D13中任一项的方法，其中第一可离子化基团以小于或等于永久性离子化基团或第二可离子化基团的表面浓度的表面浓度存在。
方面D15。方面D1至方面D14中任一项的方法，其中第一可离子化基团以从0.03微摩尔/平方米至0.3微摩尔/平方米范围内的表面浓度存在。
方面D16。方面D1至方面D15中任一项的方法，其中第一可离子化基团和永久性离子化基团或第二可离子化基团在离子化时带正电。
方面D17。方面D16的方法，其中第二色谱表面包含第二可离子化表面基团，其中第一pKa值和第二pKa值大于3，并且其中第二pKa值比第一pKa值大1个单位至7个单位。
方面D18。方面D1至方面D17中任一项的方法，其中(a)第一可离子化基团和(b)永久性离子化基团或第二可离子化基团包括胺基团。
方面D19。方面D18中任一项的方法，其中第一可离子化基团选自伯胺基团、仲胺基团和叔胺基团，并且永久性离子化基团或第二可离子化基团选自仲胺基团、叔胺基团和季铵基团。
方面D20。方面D1至方面D17中任一项的方法，其中第一可离子化基团选自4-吡啶基乙基、2-吡啶基乙基、2-咪唑啉基丙基、3-丙基苯胺或咪唑基团。
方面D21。方面D1至方面D18中任一项的方法，其中第二可离子化基团选自二乙基氨基丙基、乙基氨基丙基、二甲基氨基丙基、甲基氨基丙基、氨基丙基、二乙基氨基甲基、3-[双(2-羟基乙基)氨基]丙基、正丁基-氮杂-硅杂环戊烷、N-甲基-氮杂-硅杂环戊烷或双-3-甲基氨基丙基甲硅烷基基团。
方面D22。方面D1至方面D21中任一项的方法，其中第一疏水表面基团与第一可离子化基团的摩尔比在从5:1至200:1的范围内。
方面D23。方面D1至方面D15中任一项的方法，其中第一可离子化基团和第二可离子化基团在离子化时带负电。
方面D24。方面D23的方法，其中第一可离子化基团为羧酸基团，并且第二可离子化基团选自磺酸基团和羧酸基团。
方面D25。方面D23至方面D24中任一项的方法，其中第二pKa值比第一pKa值小1个单位至4个单位。
方面D26。方面D1至方面D25中任一项的方法，其中第一色谱材料是具有第一材料的芯的第一颗粒的形式，并且其中第二色谱材料是具有第二材料的芯的第二颗粒的形式。
方面D27。方面D26的方法，其中第一材料和第二材料是有机材料、无机材料或有机-无机杂化材料。
方面D28。方面D26的方法，其中第一材料和第二材料选自基于二氧化硅的材料、基于氧化铝的材料、基于二氧化钛的材料、基于氧化锆的材料和基于碳的材料。
方面D29。方面D26的方法，其中第一材料和第二材料是通过水解缩合一种或多种有机硅烷化合物而形成的基于二氧化硅的材料。
方面D30。方面D29的方法，其中有机硅烷化合物包括一种或多种烷氧基硅烷化合物。
方面D31。方面D29的方法，其中有机硅烷化合物由四烷氧基硅烷和烷基烷氧基硅烷制备。
方面D32。方面D26的方法，其中第一材料和第二材料包括有机聚合物。
方面D33。方面D1至方面D32中任一项的方法，其中组分包括聚糖。
方面D34。方面D1至方面D32中任一项的方法，其中组分包括标记的聚糖。
方面D35。方面D34的方法，其中用标记试剂标记聚糖，该标记试剂选自MS活性快速荧光标记化合物、普鲁卡因胺试剂、或普鲁卡因试剂。
方面D36。方面D34至方面D35中任一项的方法，其中聚糖是用提供pKa值大于6的两亲强碱性部分的聚糖标记试剂标记的。
方面D37。方面D1至方面D36中任一项的方法，其中第一流动相包括(i)水或(ii)第一有机酸和/或第一有机酸盐的水性溶液。
方面D38。方面D37的方法，其中第二流动相包括第二有机酸和/或第二有机酸盐的溶液，该第二有机酸可以与第一有机酸相同或不同，该第二有机酸盐可以与第一有机酸盐相同或不同。
方面D39。方面D1至方面D36中任一项的方法，其中第一流动相包括有机酸和有机酸盐在包括水和有机溶剂的溶剂中的溶液，并且其中第二流动相包括洗脱过程，在该洗脱过程期间，有机酸的浓度增加并且有机酸盐的浓度增加。
实施例
材料
除非另有说明，否则下文程序中所述的所有试剂均按原样使用。本领域技术人员将认识到，存在等同形式，因此，尽管列出了供应品和供应商，但列出的供应品/供应商绝不应被解释为限制性的。
表征
通过上述程序产生的固定相按以下方式表征。通过库仑碳分析仪(型号CM5300、CM5014，UIC Inc.,Joliet,IL)测量％C值。这些材料的比表面积(SSA)、比孔容(SPV)以及平均孔径(APD)使用多点N2吸附法(Micromeritics ASAP 2400；佐治亚州诺克罗斯的麦克仪器公司(Micromeritics Instruments Inc.,Norcross,GA))测量。使用BET方法计算SSA，SPV是针对P/P0>0.98确定的单点值，并且使用BJH方法从等温线的解吸段计算APD。粒度使用Beckman Coulter Multisizer 3分析仪(30μm孔，70000计数；Miami,FL)测量。将粒径(dp)测量为基于体积的粒度分布的50％累积直径。通过如元素分析测得的表面改性前后的颗粒％C的差值来确定烷基疏水基团的总表面覆盖率。本领域的技术人员将认识到存在上面列出的仪器的等同物，因此，下面列出的仪器不应被解释为限制性的。
实施例1
DEAP HPCM固定相的合成
根据以下程序合成DEAP HPCM固定相(相1)：
步骤1：使用Dean-Stark分离器，将式(O1.5SiCH2CH2SiO1.5)(SiO2)4的BEH多孔颗粒(Waters Corporation,Milford,MA；6.5％C；SSA＝75-200m2/g；SPV＝0.60-0.75cc/g；)(根据美国专利号6,686,035中所述的方法制备)在甲苯(5mL/g，Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)中回流1小时。在冷却后，将重蒸馏的(N,N-二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷(DEAP，Silar Laboratories,Wilmington,NC)以0.3μmol/m2加入，并且将反应物加热回流2小时。随后使反应物冷却，将产物过滤，并且依次用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)。然后将产物在80℃处减压干燥16小时。
步骤2：使用Dean-Stark分离器将来自步骤1的材料在甲苯(5mL/g，新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))中回流1小时。在冷却后，将咪唑(Aldrich,Milwaukee,WI)和十八烷基三氯硅烷(Gelest Inc.,Morrisville,PA)以2.3μmol/m2加入，并且将反应物加热回流16小时。随后使反应物冷却，将产物过滤，并且依次用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)。然后在50℃下将材料在丙酮/含水0.1M碳酸氢铵(pH 10)溶液中回流20小时(水解)。水解后，将材料依次用1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))。然后将产物在80℃处减压干燥16小时。
步骤3：使用Dean-Stark分离器将来自步骤2的材料在甲苯(5mL/g，新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))中回流1小时。在冷却后，将咪唑(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI))和三乙基氯硅烷(TECS，宾夕法尼亚州莫里斯维尔的Gelest公司(Gelest Inc.,Morrisville,PA))加入，并且将反应加热至回流4小时。随后使反应冷却，将咪唑和三甲基氯硅烷(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI))加入到反应中，并且再将反应加热至回流16小时。随后使反应冷却，将产物过滤，并且依次用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))。然后将产物在80℃处减压干燥16小时。
与DEAP HPCM相(相1)相关的信息可以在下面找到：
1如在US7919177、US 7223473、US 6686035中所述
实施例2
具有可离子化改性剂和烷基疏水基团的HPCM的合成
步骤1：使用Dean-Stark分离器，将式(O1.5SiCH2CH2SiO1.5)(SiO2)4的BEH多孔颗粒(Waters Corporation,Milford,MA；6.5％C；SSA＝75m2/g-200m2/g；SPV＝0.60cc/g-0.75cc/g；)(根据美国专利号6,686,035中所述的方法制备)在甲苯(5mL/g，Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)中回流1小时。在冷却时，以0.1μmol/m2至0.3μmol/m2添加2-(4-吡啶基乙基)三乙氧基硅烷(4PE，Gelest Incorporated,Morrisville,PA)，并且将反应加热至回流维持1小时。然后使反应冷却，添加咪唑和组分A硅烷添加剂，该添加剂包括叔丁基二甲基氯硅烷或辛基三氯硅烷(C8，Aldrich,St.Louis,MO)。然后将反应加热至回流维持20小时。使反应冷却，过滤产物并相继用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮(所有溶剂均得自Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)洗涤。然后在50℃下将材料在丙酮/含水0.1M碳酸氢铵(pH 10)溶液中回流20小时(水解)。水解后，将材料依次用1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))。然后将产物在80℃处减压干燥16小时。
步骤2：对于相3，使用Dean-Stark分离器将来自步骤1的材料在甲苯(5mL/g，Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)中回流1小时。在冷却时，添加咪唑(Aldrich,Milwaukee,WI)和三乙基氯硅烷(TECS，Gelest Inc.,Morrisville,PA)，并且将反应加热至回流维持4小时。然后使反应冷却，并且将咪唑和三甲基氯硅烷(TMCS，Aldrich,Milwaukee,WI)添加到反应中。然后将反应加热至回流再维持16小时，之后使反应冷却，过滤产物并相继用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮(所有溶剂均得自Fisher Scientific,Fairlawn,NJ)洗涤。然后将产物在80℃处减压干燥16小时。
与具有可离子化改性剂和烷基疏水基团的HPCM相有关的信息可以在下面找到：
1如在US7919177、US 7223473、US 6686035中所述
实施例3
筛选固定相的混合模式保留性
使用RapiFluor-MS试剂标记的来自人IgG(hIgG)的聚糖和简单的线性梯度一维分离来筛选各种高纯度色谱材料(HCPM)。
根据先前公布的条件，用RapiFluor-MS试剂标记来自人IgG的N-聚糖(SigmaI4506)和来自牛胎球蛋白的N-聚糖(Sigma F3004)。(Lauber,M.A.；Yu,Y.Q.；Brousmiche,D.W.；Hua,Z.；Koza,S.M.；Magnelli,P.；Guthrie,E.；Taron,C.H.；Fountain,K.J.,RapidPreparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagentthat Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection.Anal Chem 2015,87(10),5401-9)。使用下面指出的条件进行LC-MS分析，以产生图3、图4和图6所示的数据。
与Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio一起使用的LC条件：
梯度表：
与Waters Xevo G2-XS QTof系统一起使用的MS条件：
实施例4
捕集-洗脱混合模式色谱
根据下面列出的LC-MS条件，以图3所描绘的配置进行捕集-洗脱色谱分析。与这些实验条件相对应的数据在图5、图7、图8和图9中表示。
与Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio一起使用的LC条件：
捕集梯度表：
分析梯度表：
与Waters Xevo G2-XS QTof系统一起使用的MS条件：