阅读说明：本技术 瑞马唑仑治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏中的应用 (Application of remazolam in treatment of postoperative hyperalgesia induced by opioid ) 是由 李依泽 张麟临 于泳浩 王国林 李晶 丁冉 董贝贝 陈怡� 于 2020-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及瑞马唑仑治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏中的应用。本发明证明了瑞马唑仑通过促进GABAa受体表达从而实现抑制瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏的作用。本发明的研究成果提供了一种阿片类药物引起的痛觉过敏的新型治疗途径,在临床上具备良好的应用前景。(The invention relates to application of remazolam in treating postoperative hyperalgesia induced by opioid. The invention proves that remimazolam can inhibit remifentanil-induced postoperative hyperalgesia by promoting GABAa receptor expression. The research result of the invention provides a novel treatment way for hyperalgesia caused by opioid, and the invention has good application prospect clinically.)

瑞马唑仑治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及瑞马唑仑治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏中的应用。

背景技术

阿片类药物是临床治疗急、慢性疼痛及癌痛的最重要的镇痛药物，临床用药量极大，但它们在镇痛的同时还能够激活体内的促伤害感受机制，表现为机体对伤害性刺激的反应性增强，镇痛药物需求量增加，即阿片类药物诱发的痛觉过敏(opioid-inducedhyperalgesia，OIH)。瑞芬太尼是一种超短效的μ-阿片受体激动剂，由于它具有起效快、清除快、无蓄积、代谢不依赖于肝肾功能等优点广泛应用于临床术中镇痛。但是，瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏(remifentanil-induced postoperative hyperalgesia，RIH)的发生率远高于其他阿片类镇痛药物，高达85％。另有一项研究发现，手术时间超过2小时的患者，RIH的发生率为32.7％，累计输注量超过30μg/kg时，RIH的发生率甚至高达41.8％。RIH的主要特征为瑞芬太尼以0.05～0.3μg/kg/min的速度输注60～90min后出现术后切口疼痛的程度和范围增加，以及阿片类镇痛药需求增加。RIH不仅降低了药物的镇痛效果，还促进了痛觉感知，产生异常疼痛，甚至引发术后慢性疼痛的发生，患者对阿片类药物剂量需求越来越大，不仅增加住院时间、医疗费用、占用医疗资源，最关键的是增加了患者的身心创伤，加重了患者的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，临床无有效的治疗措施，主要是因为其发生机制目前尚不清楚，因此，深入阐明瑞芬太尼诱发痛觉过敏的发病机制和寻找有效治疗策略是当务之急。

发明内容

本发明的一个目的是提供瑞马唑仑的新的制药用途，具体来说本发明要解决的技术问题是提供瑞马唑仑在制备预防和治疗瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了抑制脊髓背角神经元兴奋性的试剂在制备预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。优选地，所述阿片类药物是瑞芬太尼。

进一步，所述试剂包括抑制NMDAR的GluN2B亚基膜转位的试剂、抑制AMPAR的Ser845-GluA1亚基磷酸化试剂、或促进GABAa受体表达的试剂。

更进一步，所述促进GABAa受体表达的试剂是瑞马唑仑。

进一步，所述阿片类药物诱发的术后痛觉过敏包括阿片类药物输注后切口痛觉过敏、单纯阿片类药物输注后诱发的痛觉过敏。

进一步，阿片类药物输注后切口痛觉过敏包括术后机械痛觉过敏和热痛觉过敏。

进一步，单纯阿片类药物输注后诱发的痛觉过敏是热痛觉过敏。

进一步，所述药物包括作为有效成分的抑制脊髓背角神经元兴奋性的试剂以及药学上可接受的成分。

进一步，本发明的所述药物中作为有效成分的抑制脊髓背角神经元兴奋性的试剂占比为0.1-99％w/w，药学上可接受的成分的占比为0.1-99％w/w。

进一步，本发明的所述药物的剂型是药剂学上可以接受的任何药物剂型。包括但不限于片剂(包括分散片、肠溶片、咀嚼片、口腔崩解片、泡腾片等)、硬胶囊剂(包括肠溶胶囊)、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、滴丸剂、干混悬剂、口服溶液剂、干糖浆剂、散剂、口服混悬液、以及口服的速释或缓释或控释等剂型，注射剂(包括注射用粉针剂(包括注射用无菌灌装粉末、冻干粉针剂)、水溶液注射剂)、软膏剂、凝胶剂、乳液剂、乳胶剂、贴剂、栓剂、凝胶剂等等。

本发明的药物可以经口服途径应用，也可以经静脉、肌肉、皮内或皮下注射途径给药。

本发明的药物可以单独使用，也可以与其他用于治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物一起联合使用。

本发明的药学上可接受的成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、缓冲剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂、稳定剂、悬浮剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、着色剂和致等渗(isotonicizing)溶质(即其使制剂与目标患者的血液或其它相关的体液等渗)。适当的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药学书籍中找到。参见，例如药物添加剂手册(Handbookof Pharmaceutical Additives)，第二版(编者M.Ash和I.Ash)，2001(SynapseInformation Resources，Inc.，Endicott，New York，USA)；Remington′sPharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990；以及药物赋形剂手册(Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第二版，1994。

文中使用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，它们在医学判断的合理范围内，适于与患者的组织接触，并未带来过度的不希望的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并有合理的益处/风险比。

本发明的“患者”可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪类(例如猪)、羊类(例如羊)、牛类(例如奶牛)、灵长类动物、猿猴(例如猴子或者猿)、猴类(例如绒猴、狒狒)、猿类(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或者人类。

本发明提供了一种体外抑制脊髓背角神经元兴奋性的方法，所述方法包括施用抑制NMDAR的GluN2B亚基膜转位的试剂、抑制AMPAR的Ser845-GluA1亚基磷酸化试剂、或促进GABAa受体表达的试剂。

进一步，所述促进GABAa受体表达的试剂是瑞马唑仑。

本发明提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物，所述药物包括抑制脊髓背角神经元兴奋性的试剂。

优选地，所述试剂包括抑制NMDAR的GluN2B亚基膜转位的试剂、抑制AMPAR的Ser845-GluA1亚基磷酸化试剂、或促进GABAa受体表达的试剂。

更优选地，所述促进GABAa受体表达的试剂是瑞马唑仑。

本发明对于上述药物的限定同前。

本发明的“瑞马唑仑”可以是瑞马唑仑，也可以是瑞马唑仑的药用衍生物，所述药用衍生物包括药学上可接受的盐或酯等形式。

本发明所述的“预防”，是指在可能的诱导术后痛觉过敏因素的存在下，使用后防止或降低术后痛觉过敏的产生。

本发明所述的“治疗”，是指减轻术后痛觉过敏的程度，或者治愈术后痛觉过敏使之正常化，或者减缓肝术后痛觉过敏的进程。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次公开了瑞马唑仑可治疗瑞芬太尼诱发的术后痛觉过敏，发现了一种阿片类药物引起的痛觉过敏的新型治疗途径。

附图说明

图1显示瑞马唑仑抑制瑞芬太尼输注后切口痛觉过敏的结果图，其中A：机械痛觉；B：热痛觉，图中n＝6；***P<0.001；$P<0.05；$$P<0.01；$$$P<0.001；

图2显示瑞马唑仑抑制单纯瑞芬太尼输注后诱发的痛觉过敏的结果图，其中A：机械痛觉；B：热痛觉，图中n＝6；***P<0.001；$$P<0.01；$$$P<0.001；

图3显示瑞马唑仑对GABAa受体、GluN2B膜蛋白、Ser845GluA1磷酸化的表达水平影响的结果图，其中A：免疫印迹图；B：统计柱状图，图中n＝6；***P<0.001；$$P<0.01；$$$P<0.001；

图4显示瑞马唑仑对GABAa受体表达水平影响的结果图，其中A：免疫组化图；B：统计柱状图，图中n＝6；***P<0.001；$$$P<0.001。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1瑞马唑仑对阿片类药物诱发的切口痛觉过敏的影响

1、实验分组：雄性SD大鼠42只，1月龄，体重100～120g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。采用随机数字表法分为7组(n＝6)：

生理盐水组(NS组)，经尾静脉输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；

瑞芬太尼+切口痛组(RI组)，经尾静脉输注瑞芬太尼(批号：A010919，宜昌人福药业有限责任公司)1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型；

瑞马唑仑1(批号：，江苏恒瑞医药股份有限公司)+瑞芬太尼+切口痛组(R1RI组)经尾静脉输注瑞马唑仑1mg·kg^-1·h^-1，瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型；

瑞马唑仑2+瑞芬太尼+切口痛组(R2RI组或RRI组)经尾静脉输注瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1，瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型；

瑞马唑仑4+瑞芬太尼+切口痛组(R4RI组)经尾静脉输注瑞马唑仑4mg·kg^-1·h^-1，瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型；

瑞芬太尼(R组)，经尾静脉输注瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min；

瑞马唑仑2+瑞芬太尼(RR组)经尾静脉输注瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1，瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min。

2、切口痛模型制作：大鼠吸入2％七氟醚麻醉，消毒左后足，从足底近端0.5cm处向趾部做长约1cm的纵行切口，切开皮肤后，用眼科镊挑起足底肌肉并纵行分离至骨膜，保持肌肉起止和附着完整。按压止血后，以4-0丝线缝合皮肤。切口皮肤不能重叠、内翻、裂开。术后伤口用碘伏消毒，并涂抹少量红霉素软膏预防感染。

3、行为学实验：于输注瑞芬太尼前24h(T0)、输注停止后2、6、24和48h(T1-4)时测定热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足阈(PWT)，实验室温度18～22℃，安静。采用YLS-6B智能热板仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)测定PWL，记录从右后足接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间为PWL，连续测定3次，间隔5min，取平均值作为PWL(sec)。为防止烫伤鼠爪，PWL上限定设置为20s。将大鼠置于20cm×20cm×20cm的金属笼内，30min后，以BSEVF3 von Frey纤维丝(Harvard Apparatus公司，美国)刺激右后足2、3趾骨间，垂直施加压力，记录出现快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫时压力，连续测定3次，间隔5min，取平均值为PWT(g)。为防止损伤鼠爪，最大压力设置为50g，超过此压力的大鼠剔除本实验。

4、Western blot：于最后1次行为学测定结束后，处死大鼠，取脊髓背角L4-5节段，采用Western blot法测定脊髓背角GABAa受体、Ser845-GluA1、GluN2B和GAPDH蛋白的表达。脊髓背角组织加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为脊髓组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒(Thermo公司，美国)，按照说明书进行具体操作提取膜蛋白。将抽提的蛋白95℃下变性5min。应用10％SDS-PAGEd电泳分离，上样量为15μl，将蛋白转至PVDF膜上，加入5％脱脂奶粉室温封闭2h，洗膜后分别加入一抗，抗兔GABAa受体抗体、抗兔Ser845-GluA1抗体、抗兔GluN2B抗体和抗兔GAPDH抗体(均为1：1000，Abcam公司，美国)，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次5min，加入羊抗兔二抗或羊抗鼠二抗(稀释度1：2000，北京中杉金桥生物有限公司)室温孵育2h，TBST清洗3次，每次5min，暗室内加发光试剂曝光，扫描成像。采用Gene Tools图像分析软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值反映目的蛋白表达水平。

5、免疫组化：大鼠七氟烷麻醉，取出L4-5脊髓节段，浸入新鲜配置的4％多聚甲醛溶液中固定6h，常规制备石蜡切片(片厚4μm)，采用免疫组化染色法检测GABAa受体在脊髓背角中的分布表达情况。具体步骤如下：

脱蜡：将石蜡切片置于烘箱内烘烤(60℃，2h)，退去表层石蜡；脱水：将脱蜡后的切片依次置于二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)和梯度乙醇(100％、95％、90％、80％、70％、50％、30％)溶液缸中脱水，分别浸泡5min，最后使用1XPBS冲洗3遍；抗原修复：将脱水后的切片浸到枸橼酸缓冲液(0.01M)中，高温加热煮沸并持续3min(95℃)，待切片自然冷却至室温后再次加热2min，然后切片自然冷却；在切片上滴加适量的过氧化物酶阻断剂，孵育15min(室温)，以阻断内源性过氧化氢酶造成的非特异性染色，然后1XPBS冲洗3遍；切片上滴加5％牛血清白蛋白(BSA)，孵育20min(室温)，弃BSA，自然晾干；切片上滴加GABAa受体一抗100μl(1:500稀释)，4℃孵育过夜；弃切片上GABAa受体一抗，用1XPBS冲洗3遍后，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗100μl(1:1000稀释)，孵育60min(室温)，用1XPBS冲洗3遍；滴加新鲜配制DAB工作液(A、B母液各500μl)到切片上，立即将切片置于100倍显微镜下观察，当发现切片呈黄褐色时(约5min)，用自来水中清洗切片3次；滴加适量的苏木素染液到切片上，约5min，使细胞核染色；切片上滴加适量的1％盐酸酒精进行分色，停留5秒后，将盐酸酒精用自来水洗净；将切片依次放到梯度乙醇(30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％)溶液缸和二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)中脱水、透明(各5min)，用1XPBS冲洗2遍，滴加适量中性树胶，封片，晾干；显微镜观察：DAB显色呈棕黄色，即阳性细胞。每个标本随机抽取5张切片，每张切片在光镜下(X200)观察，选取大鼠脊髓背角不重叠的5个高倍视野，对阳性神经细胞进行标记，以积分光密度评估GABAa受体的蛋白表达情况。采用Image J图像分析软件分析处理所有染色图象。

6、统计学分析：采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

7、结果

(1)瑞芬太尼输注加剧了术后机械和热痛觉过敏

与生理盐水(NS)组输注相比，瑞芬太尼+切口痛(RI)组以1μg·kg^-1·min^-1的速度输注60分钟导致缩足阈值(PWT)和缩足潜伏期(PWL)从2h到48h显着降低(所有P<0.05)。输注生理盐水60分钟，然后给予切口疼痛模型组(NS+Incision)可使PWT和PWL从2h到48h显着降低(所有P<0.01)，降低程度与在每个时间点的Remi组的水平接近(所有P>0.05)。这些结果表明，以1μg·kg^-1·min^-1的速度输注瑞芬太尼可增加阿片类药物引起的切口痛热和机械性痛觉过敏。瑞芬太尼输注和切口疼痛模型(Remi+Incision)引起的热痛和机械痛的超敏反应可从2小时持续到48小时(图1)。另外单独输注瑞芬太尼(R)也可以增加热痛觉过敏和机械痛觉过敏(图2)。这些结果表明，瑞芬太尼输注后切口于术后2h出现热痛觉过敏和机械痛觉过敏，并在48h达到峰值(所有P<0.01)(图1)。

(2)瑞芬太尼输注和切口降低了脊髓背角GABAa受体受体表达，增加Ser845-GluA1和膜上GluN2B的表达

瑞芬太尼输注后脊髓背角中与疼痛相关的蛋白质变化对术后OIH的发展至关重要。在瑞芬太尼和切口疼痛模型后48h，处死大鼠去脊髓背角，在Western blot结果发现GABAa受体蛋白表达明显降低(P<0.05，图3)。与NS组相比，RI组分别降低了0.51倍(P＝0.005)。但是，与NS组相比，RI组的脊髓背角Ser845-GluA1和膜上GluN2B分别增加了1.95倍和2.03倍(<0.01，图3)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与脊髓背角中GABAa受体表达减低和Ser845-GluA1和膜上GluN2B的增加有关。

(3)瑞马唑仑输注可降低瑞芬太尼引起的术后痛觉过敏

NS组中的大鼠在每个时间点均未显示机械性疼痛或热痛阈值变化(P>0.05，图2A，B)。Von Frey测试表明，与NS大鼠相比，RI可以导致PWT快速下降(<2小时)和连续下降(>48小时)(P<0.05，图2A)，表明持久的机械性异常性疼痛。此外，热痛行为测试表明，RI组在手术后至少48小时也导致PWL降低(P<0.01，图2B)，表明瑞芬太尼输注可引起术后热痛觉过敏。有趣的是，我们观察到经尾静脉注射瑞马唑仑(分为三个浓度1mg·kg^-1·h^-1，2mg·kg^-1·h^-1，4mg·kg^-1·h^-1)和瑞芬太尼1μg·kg^-1·min^-1共60min，同时建立切口痛模型后，瑞芬太尼和切口引起的术后机械和热痛觉过敏在瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1(R2RI组)，4mg·kg^-1·h^-1(R4RI组)明显减少，表现为PWT和PWL的恢复(P<0.01，图1)，但瑞马唑仑1mg·kg^-1·h^-1(R2RI组)无效，提示瑞马唑仑治疗瑞芬太尼引起的大鼠术后痛觉过敏的最低有效剂量为2mg·kg^-1·h^-1，而瑞马唑仑具有明显的减低2小时后出现瑞芬太尼引起的痛觉过敏，持续超过48小时。行为学实验进一步证实了瑞马唑仑在单纯瑞芬太尼(R组)输注诱导的痛觉过敏中的作用，表现为尾静脉输注瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1(RR组)可降低瑞芬太尼输注后引起的PWT和PWL的降低。

(4)瑞马唑仑通过增加GABAa受体表达，降低Ser845-GluA1和GluN2B表达从而减轻RIH引起的中枢敏化

我们以前的研究发现瑞芬太尼诱导的痛觉过敏不仅表现出行为实验中降低的疼痛阈值，而且还影响介导疼痛传递的兴奋性谷氨酸受体的表达，例如增加AMPAR的Ser845-GluA1亚基磷酸化的表达、增加NMDAR的GluN2B亚基膜转位。尚未探索GABAa受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用，为了研究瑞马唑仑是否也影响GABAa受体表达，我们通过尾静脉输注瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1，然后制作了瑞芬太尼切口疼痛模型，并采用L4/5脊髓背角检测GABAa受体膜蛋白表达。

研究发现，与NS相比，RI组的GABAa受体膜蛋白降低了0.51倍(P<0.01，图3)，而瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1(RRI)可以使GABAa受体膜蛋白的表达水平增高至NS的水平(NSvs.RRI，1：0.89，P>0.05，图3)，GABA a受体免疫组化的结果与Western blot的结果非常相似(图4)，提示瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1可以抑制瑞芬太尼切口疼痛模型引起的GABAa受体膜蛋白的下调。

另一方面，瑞马唑仑2mg·kg^-1·h^-1减轻了由RI诱导的AMPAR的Ser845-GluA1亚基磷酸化(NS vs.RRI，P＝0.239；图3)。同样，瑞马唑仑还将RI引起的NMDAR的GluN2B亚基膜转位降低到接近NS组的水平(NS与RRI，P＝0.328；图3)。这些结果表明，瑞马唑仑不仅介导GABAa受体表达，而且还参与脊髓背角AMPAR的Ser845-GluA1亚基磷酸化和NMDAR的GluN2B亚基膜转位。提示RIH相关的背角神经元兴奋性增加可以通过增加GABAa受体表达来逆转。

总之，我们的发现表明，脊髓背角神经元膜上GABAa受体表达减低可能在瑞芬太尼输注和切口后促进机械和热敏化。GABAa受体的药理激活作用明显阻止瑞芬太尼引起的术后痛觉过敏。我们的研究提示GABAa受体激动剂瑞马唑仑是在阿片类药物引起的痛觉过敏的一种新型治疗途径。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。