壳寡糖双胍衍生物在制备抑制肝损伤药物中的应用
阅读说明：本技术 壳寡糖双胍衍生物在制备抑制肝损伤药物中的应用 (Application of chitosan oligosaccharide biguanide derivative in preparation of liver injury inhibiting medicine ) 是由 刘晓非 赵励彦 郑淇方 邹雅露 王园园 刘宇星 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开壳寡糖双胍衍生物在制备抑制肝损伤药物中的应用,将壳寡糖与盐酸在微波装置中搅拌反应,之后加入双氰胺水溶液,使用盐酸调节溶液pH,在微波装置中搅拌反应,得到壳寡糖双胍衍生物。本发明在体外实验中验证了衍生物对DPPH自由基的清除作用,证明了它具有抗氧化性；同时,建立2型糖尿病大鼠模型,壳寡糖双胍衍生物以灌胃的方式给药,经过衍生物治疗后,有效抑制了糖尿病大鼠肝脏的氧化应激损伤。(The invention discloses application of a chitosan oligosaccharide biguanide derivative in preparation of a medicament for inhibiting liver injury. The invention verifies the scavenging effect of the derivative on DPPH free radicals in vitro experiments, and proves that the derivative has oxidation resistance; meanwhile, a type 2 diabetes rat model is established, the chitosan oligosaccharide biguanide derivative is administrated in a gastric perfusion mode, and after treatment of the derivative, oxidative stress damage of the liver of a diabetes rat is effectively inhibited.)
技术领域
本发明属于药学领域，具体涉及一种壳寡糖双胍衍生物的微波合成制备方法及其在制备抑制肝损伤药物方面的应用。
背景技术
氧化应激为2型糖尿病形成及发展的重要因素。其是指机体产生活性氮(RNS)以及活性氧(ROS)的速率与其自身抗氧化防御系统的清除之间失衡，导致机体中RNS和ROS过量，造成机体的器官，组织，细胞中的蛋白以及核酸等生物大分子发生损伤(Reddy VP,Zhu X,Perry G,et al.Oxidative stress in diabetes and Alzheimer’sdisease[J].Alzheimers Diseases,2009,16(4):763-774)。高血糖症是氧化应激发生的主要原因，高血糖通过线粒体电子传递链、葡萄糖自氧化还有多元醇通路等方式增加机体内的ROS与RNS的含量。在这些产生ROS的途径中，线粒体电子传递链主要的。线粒体电子传递链主要由以下几种物质参与：酶复合物I～IV、细胞色素c和辅酶Q，在酶复合物I和III中会长期不间断地产生少许超氧产物，其中包括羟基自由基(·OH)，超氧阴离子(O2-)以及过氧化氢(H2O2)，而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)会将催化超氧产物，使之转化为氧气和水。
在糖尿病状态下，长期高血糖可导致肝脏氧化应激系统异常，导致特异性免疫反应，最终导致肝损伤。肝脏是一种对氧化应激非常敏感的器官，自由基可以对肝脏造成直接损害(Ito K,Ozasa H,Noda Y,et al.Effects of free radical scavenger on acuteliver injury induced by d-galactosamine and lipopolysaccharide in rats[J].Hepatology Research the Official Journal of the Japan Society of Hepatology,2010,38(2):194-201)。糖尿病病人在高血糖状态下会出现糖代谢紊乱，促进肝损伤。此外，高糖除了诱导氧化应激外，还会破坏组织细胞的正常清除能力(Matough F A,Budin S B,Hamid Z A,et al.The role of oxidative stress and antioxidants in diabeticcomplications[J].Sultan Qaboos University Medical Journal,2012,12(1):5-18)。如抗氧化酶的糖基化或氧化可导致超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，其他抗氧化酶的活性降低，维生素C，维生素E，谷胱甘肽(GSH)等抗氧化剂水平降低，削弱机体清除自由基的能力，进而促进了肝损伤的发展。因此，在肝损伤的发展过程中，一方面自由基的产生会增加，另一方面，抗氧化能力会降低，使得二者共存，共同导致氧化应激的发生(Leclercq IA,Silva MoraisA D,Schroyen B,et al.Insulin resistance in hepatocytes andsinusoidal liver cells:Mechanisms and consequences[J].Journal of Hepatology,2007,47(1):142-156)。因此，氧化应激是导致糖尿病肝损伤的关键因素，抑制氧化应激可导致糖尿病肝损伤的发生发展明显延迟，这对有效治疗2型糖尿病具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供壳寡糖双胍衍生物在制备抑制肝损伤药物中的应用。
需要说明的是本发明中使用的壳寡糖双胍衍生物采用本课题组在先申请的技术方案“壳寡糖双胍衍生物及其微波合成方法”(申请号2017108673840，申请日2017年9月22日)，使用微波合成方法将经典糖尿病治疗药物二甲双胍的双胍结构引入壳寡糖中，该产物既具有胍基的治疗糖尿病肝损伤的功效，又具有壳寡糖的天然性、安全性和独特的生物活性，且能够缓解双胍药物对胃肠道的刺激副作用，该方法生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。
壳寡糖双胍衍生物，以壳寡糖和双氰胺为原料制备，以壳寡糖侧基NH2和双氰胺在盐酸和微波条件下进行反应并形成与壳寡糖键接的双胍基团，如下化学式所示：
壳寡糖是自然界中唯一带有正电荷的碱性氨基寡糖，它的分子量小，溶解性很好，容易被生物体吸收利用，重均分子量为3000以下，优选1500～3000Da，脱乙酰度在97％以上，优选97～99％。
壳寡糖双胍衍生物中，双胍取代度为40～60％，优选45～55％。
上述化学式中m和n分别为壳寡糖中乙酰化单元和脱乙酰化单位的聚合度。
壳寡糖双胍衍生物的制备方法，按照下述步骤进行：将壳寡糖分散在盐酸中并在微波160W～560W条件下搅拌，进行第一步微波反应；之后加入双氰胺水溶液并使用盐酸调整反应体系pH值为1～2，继续在微波160W～560W条件下搅拌，进行第二步微波反应，以使壳寡糖和双氰胺反应制备壳寡糖双胍衍生物，具体如下式所示：
其中在第一步微波反应中，微波功率为300～400w，反应时间为3～7min，优选5～7min，搅拌速度为每分钟100～200rpm。
在第二步微波反应中，微波功率为300～400w，反应时间为10～20min，优选15～20min，搅拌速度为每分钟100～200rpm。
反应结束后，将反应液冷却至室温，对混合溶液进行醇沉，烘干，研磨，得到壳寡糖双胍衍生物粉末。
双氰胺与壳寡糖中氨基的摩尔比为(0.5～3):1，优选(1～3):1，更加优选1:1。
盐酸为0.2～0.8mol/L的HCl水溶液，使用盐酸调整反应体系pH值为1。
本发明生产效率高，操作工艺简单，反应过程清洁环保，产品性能好。经动物实验证实，本发明中的壳寡糖双胍衍生物在建立2型糖尿病大鼠模型后，灌胃给药，ALT,AST酶活力降低，同时血清中TP，TBIL，FFA的含量降低，防止相关酶从肝细胞渗漏到胞外循环中，自由基对肝脏损伤的程度降低，另一方面，MDA活力值下降，同时SOD，CAT，GSH-Px活力值增加，肝脏组织的氧化应激损伤减弱，最终发挥对肝脏氧化应激损伤的治疗作用，且与单独使用传统糖尿病治疗药物二甲双胍相比，壳寡糖双胍衍生物治疗效果更佳，即本发明的壳寡糖双胍衍生物在制备抑制肝损伤药物中的应用。
附图说明
图1为本发明中原料壳寡糖(COS)与壳寡糖双胍盐酸盐(COSG)的红外光谱的对照谱线图。
图2为本发明中原料壳寡糖(COS)与壳寡糖双胍盐酸盐(COSG)的核磁碳谱的对照谱线图。
图3为本发明中壳寡糖双胍盐酸盐(COSG)的体外抗氧化性测试结果图，其中(a)为COSG和Vc溶液的紫外吸收光谱图，(b)为加入COSG和Vc溶液后DPPH-乙醇溶液和DPPH自由基体系的扫描光谱图，(c)为在室温下冷却放置0，10，20，30min后，不同浓度DPPH溶液(0.05mM，0.10mM，0.15mM，0.20mM)的吸光度值变化曲线图，(d)为COSG和Vc对DPPH自由基清除能力的测试曲线图。
图4为本发明中COSG改善STZ诱导的糖尿病大鼠的体重(a)，空腹血糖(b)和尿糖(c)的变化数据图，其中数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
图5为本发明实施例中肝脏组织形态学观察照片(HE染色×100倍)。
具体实施方式
下面是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。在制备得到壳寡糖双胍衍生物之后，本课题组陆续针对壳寡糖双胍衍生物的药用价值进行测试和评价，如在先中国专利申请“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用”(申请号2017108663660，申请日2017年9月22日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗脂代谢紊乱药物中的应用”(申请号2017108917900，申请日2017年9月27日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗胰岛缺陷药物中的应用”(申请号2018111171793，申请日2018年9月25日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备抑制细胞凋亡药物中的应用”(申请号2018111202043，申请日2018年9月25日)、“壳寡糖双胍衍生物在制备治疗骨骼肌胰岛素抵抗药物中的应用”(申请号2018111927902，申请日2018年10月13日)。在本发明中，本课题组延续这一针对壳寡糖双胍衍生物的药用价值测试，首先制备壳寡糖双胍衍生物并进行表征，在针对肝脏损伤进行研究。
实施例1 1500Da壳寡糖双胍衍生物的制备
按照原料配比为1：1称取1.44g双氰胺置于锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，在50℃恒温震荡培养箱中振荡溶解双氰胺。待壳寡糖(1500Da)和双氰胺均完全溶解后，将双氰胺水溶液倒入盛有壳寡糖盐酸溶液的四口瓶中，使用1mol/L的盐酸调节溶液pH＝1。在微波功率为400W，微波时间为15min条件的下进行反应。反应结束后，对混合溶液醇沉，抽滤，烘干，研磨，得到取代度为55％的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG。
实施例2 3000Da壳寡糖双胍衍生物的制备
按照原料配比为1：1称取2.88g双氰胺置于锥形瓶中，加入15mL蒸馏水，在50℃恒温震荡培养箱中振荡溶解双氰胺。待壳寡糖(3000Da)和双氰胺均完全溶解后，将双氰胺水溶液倒入盛有壳寡糖盐酸溶液的四口瓶中，使用1mol/L的盐酸调节溶液pH＝1。在微波功率为400W，微波时间为15min条件的下进行反应。反应结束后，对混合溶液醇沉，抽滤，烘干，研磨，得到取代度为55％的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG。
本发明实施例1获得的壳寡糖双胍衍生物和原料壳寡糖经红外光谱，核磁共振谱等鉴定，如附图1和2所示。
COS的红外光谱图中，3414cm-1附近处的强吸收峰为缔合氢键的O－H和N－H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰。由于COS分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内。2918cm-1左右为C－H的伸缩振动吸收峰。1626cm-1附近处为仲胺的N-H伸缩振动峰。此外，指纹区的1060cm-1附近处为仲胺的N－H面内弯曲振动吸收峰，因为COS脱乙酰化并不完全，分子中含有少量的－NH－CO－结构，故在该处有吸收峰；602cm-1附近处对应着N－H的面外摇摆振动吸收带。与COS相比，COSG在1626cm-1处、1060cm-1附近处吸收峰明显增强，这两个峰都是仲胺基团的特征峰，说明分子内仲胺类基团增多，表明COS氨基上发生了胍基化反应。此外，3414cm-1附近处吸收峰为缔合氢键的O－H和N－H伸缩振动吸收峰部分重叠而增宽的多重吸收峰，由于COS分子中存在大量的分子间、分子内氢键，且氢键的长短、强弱也不尽相同，因此其伸缩振动峰出现在较宽的频率范围内，而COSG相对于COS，该峰明显增强，同样说明分子内N－H含量增多，表明了COS氨基上发生了胍基化反应。
壳聚糖环上各个C的化学位移为：C1：97.03，C4：76.03，C5：75.01，C3：71.49，C6：60.23，C2：56.23。壳寡糖是壳聚糖降解后得到的，因此，其糖环上各个C化学环境，化学位移也应与壳聚糖一致。用13CNMR分析技术进一步确定壳寡糖改性后的结构变化，壳寡糖胍盐的化学位移分别为：C7：165.21，C8：155.13，C1：98.91，C4：78.17，C5：77.03，C3：69.13，C6：60.17，C2：56.43。其中C7：165.21和C8：155.13处新出现的碳的化学位移确定了胍基团的存在。
在确定壳寡糖和双氰胺反应生成胍基团后，本发明使用NaOH标准溶液滴定产物，测得产物的胍取代度DS并以此为判断标准。NaOH和壳寡糖胍中的＝NH2 +Cl-反应，滴定等当点时，pH发生突变，NaOH摩尔数等于产物中的＝NH2 +Cl-摩尔数。壳寡糖胍的DS可用下列式计算：
式中：
n1——被胍基取代的结构单元摩尔数；
n2——未被胍基取代的结构单元摩尔数；
Δv——到达突越点(pH＝9.1)消耗NaOH的体积/ml；
cNaOH——NaOH标准溶液的浓度/mol·L-1；
G——产品质量/g；
318——被胍基取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol-1；
161——未被胍基取代的结构单元的相对摩尔质量/g·mol-1；
DS——(双)胍取代度/％。
实施例3选取实施例1中制备的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG进行体外抗氧化性能研究。
1)DPPH自由基溶液制备
称取一定量的DPPH，溶解于无水乙醇，并在250mL容量瓶子中定容，制得浓度为0.20mM的DPPH-乙醇溶液，低温避光保存。
2)样品溶液的配制
壳寡糖胍盐酸盐溶液：准确称取0.020g壳寡糖胍盐酸盐产物置于25mL锥形瓶中，并向其中加入10mL蒸馏水将其振荡溶解，得到壳寡糖胍盐酸盐溶液，并将其稀释成一定浓度梯度的溶液，取DPPH溶液1mL，向其中加入2mL壳寡糖胍盐酸盐溶液，加样时从最低浓度开始加，同时观察溶液褪色情况，记录下溶液颜色刚好褪去是样品液的浓度，此即为样品液的最大浓度，在此浓度的基础上，将样品稀释成一定浓度梯度的溶液备用。
抗坏血酸溶液：准确称取0.020g抗坏血酸置于25mL锥形瓶中，并向其中加入10mL蒸馏水将其振荡溶解，得到抗坏血酸溶液。
3)样品溶液的紫外扫描
取3mL壳寡糖胍盐酸盐溶液、抗坏血酸溶液，使用紫外可见分光光度计在250-800nm处分别进行全波长扫描。
4)DPPH自由基体系的紫外扫描
取2mL的壳寡糖胍盐酸盐溶液、2mL抗坏血酸溶液、2mL无水乙醇分别加入1mLDPPH-乙醇溶液中，振荡使其混合均匀，避光静置10min之后，用紫外可见分光光度计在400-800nm波长处对其进行连续扫描，得到其全波长吸收光谱，找出DPPH-乙醇溶液吸光值最大的波长λmax。
5)DPPH溶液的稳定性分析
将0.20mMDPPH-乙醇溶液分别稀释为浓度为0.05mM，0.10mM，0.15mM，0.20mM的乙醇溶液。将稀释后的DPPH-乙醇溶液置于阴凉处保存，用紫外可见分光光度计测定不同浓度的DPPH-乙醇溶液在0min，10min，20min，30min后在4)中确定的λmax处的吸光光度值。
6)壳寡糖胍对DPPH自由基的清除率测定
将壳寡糖胍盐酸盐配制成0.05mg/mL的样品溶液。取2mL样品溶液以及0.05mg/mL的抗坏血酸溶液分别和1mLDPPH-乙醇溶液充分混合，在阴凉处放置30min，用紫外可见分光光度计测定在4)中得到的λmax处的吸光值(Asample)。
取2mL无水乙醇和1mL DPPH-乙醇溶液充分混合，在阴凉处放置30min，在λmax处测其吸光值(ADPPH)。
取2mL样品溶液和1mL无水乙醇充分混合，在最大波长下测其吸光值(Ablank)。以上所配测试溶液各组分含量如表1所示。
DPPH自由基清除率计算公式如下：
表1DPPH自由基清除率方法各试剂加入量
2.研究情况(COSG的体外抗氧化活性)
图3a显示了COSG和Vc溶液的紫外吸收光谱图，样品溶液在400-800nm波长下没有明显的吸收，由此可确定COSG对DPPH清除率的影响几乎没有影响，图3b显示加入COSG和Vc溶液后DPPH-乙醇溶液和DPPH自由基体系的扫描光谱。可以看出，DPPH-乙醇溶液在516nm处具有明显的吸收峰，这是最大吸收波长。此外，与COSG和Vc溶液混合后，DPPH-乙醇的吸收峰大大减弱，表明COSG对DPPH自由基具有一定程度的清除作用。
如图3c所示，在室温下冷却放置0,10,20,30min后，发现DPPH溶液吸光度值没有明显变化，DPPH自由基在室温下具有良好的稳定性。图3d表明DPPH自由基的Vc清除能力非常优异，并且不随浓度变化，而COSG对DPPH自由基清除能力具有显着的剂量依赖性作用。随着浓度增加，它趋于稳定并最终具有与Vc相似的能力。因此，COSG可有效清除自由基，它具有抗氧化活性，可以改善糖尿病大鼠的氧化应激，用于治疗T2DM大鼠。
实施例4选取实施例1，2中制备的壳寡糖双胍衍生物粉末COSG进行动物药效学实验。通过以下动物实验对本发明应用效果作进一步说明。
实验动物选用SD成年雄性大鼠70只，每组10只，总共7组，清洁级，体重在500克左右，由天津市动物实验中心提供。动物分笼饲养，动物每笼4～5只。动物饲养实验室符合国标清洁级，空间30m2，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温23℃，相对湿度50％～60％。
70只大鼠分为以下7组：对照组(标记为C，空白组)，模型组(标记为M，诱发糖尿病并灌水)，二甲双胍组(标记为Met，诱发糖尿病并给药二甲双胍)，壳寡糖1组(标记为COS1，诱发糖尿病并给药壳寡糖，1500Da)，壳寡糖2组(标记为COS2，诱发糖尿病并给药壳寡糖，3000Da)，壳寡糖胍1组(标记为COSG1，诱发糖尿病并给药实施例1中制备的壳寡糖双胍衍生物COSG)，壳寡糖胍2组(标记为COSG2，诱发糖尿病并给药实施例2中制备的壳寡糖双胍衍生物COSG)。对照组喂食正常饮食，其他组饲喂高脂肪和高糖饮食8周，然后禁食12小时，然后以25mg/kg的剂量注射STZ至尾静脉，构建2型糖尿病大鼠模型。随机血糖>16.7mmol/L时，认为造模成功。在接下来的8周，正常对照组继续喂养基础饲料，药物干预组在高脂高糖饲料基础上加入相应药物，按照500mg/kg的剂量灌胃给药(溶剂：蒸馏水，pH＝7)，空白组用相应剂量的蒸馏水灌胃，各组大鼠每日下午同一时间灌胃一次。
2、标本采集
针对动物实验需检测的指标，对实验大鼠血清和组织作如下处理，用于下面各项检测。1)血液样品的采集：在实验期结束时，大鼠禁食12小时，然后在乙醚麻醉下通过股动脉穿刺放血处死，收集血样。静置1h后，对其进行离心处理，转速2500r/min，时间20min，取上清液制备血清。将血清样品储存在-20℃冰箱中用于进一步分析。
2)体重：每周选定同一时间测定大鼠的体重，单位：g。
3)肝脏标本：实验结束后每组大鼠放血处死，立即取肝脏，称重后取部分肝脏组织以10％甲醛溶液固定，做常规石蜡切块，并进行HE染色，在光镜下观察。
3、研究情况
1)对糖尿病大鼠一般状况的影响：
糖尿病大鼠出现典型的体重下降症状。所有的糖尿病大鼠，与正常大鼠相比均有明显的体重减轻(P<0.001)。和糖尿病大鼠相比，其他所有组的小鼠的体重在实验过程中逐渐趋于正常，如图4a所示。
糖尿病大鼠在8周内发生高血糖，实验结束时空腹血糖水平显著升高。从图4b可以看出，与C组相比，M组空腹血糖水平显着升高，二甲双胍，COS和COSG治疗后降低(P<0.01)。其中，具有3000Da的COSG2组在降低空腹血糖方面表现更好。
二甲双胍，COS和COSG对尿糖水平的影响显示在图4c中。M组尿液葡萄糖含量约为C组的1.25倍(P<0.001)，与M组比较，药物组呈现出显著降低的糖尿病大鼠尿糖水平(P<0.01)。此外，COSG1组效果最好。
2)对肝脏病理学分析
图5是用高倍显微镜观察HE染色的糖尿病大鼠的肝脏组织，C组的大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞呈放射状规则排列，细胞核位于细胞中央，细胞形态正常、排列规则，组织结构完整且形态清晰，无明显病理变化。与C组相比，M组中大量肝脏细胞出现水肿，变性，肝脏组织结构紊乱，排列不规则。与M组相比，二甲双胍、COS和COSG的治疗可以不同程度减轻大鼠肝脏病理改变。其中，COSG2对肝脏细胞的修复效果更好，肝细胞形态、排列及组织结构基本接近正常，无明显细胞肿胀、变性。而不同分子量之间的差异不明显。
3)对大鼠肝损伤血清蛋白和酶的影响
为了探索COSG的保肝潜力，进行了血液生化分析。如表2所示，M组ALT，AST，TP，TBIL和FFA活性明显高于C组，但通过二甲双胍，COS,COSG治疗可抑制其活性。其中，COSG的作用最明显(p<0.05)，二甲双胍的作用略差于COSG。另外，COS和COSG显着提高了SOD，CAT和GSH-Px的浓度，降低了MDA的水平。所有数据均显示COSG的治疗效果优于COS。
表2还显示M组的胰岛素含量显着低于C组(p<0.01)。Met组大鼠的平均FSI水平比M组高26.25％(p<0.01)。此外，COSG2组的FSI水平比M组高30.04％(p<0.01)。与C组相比，M组大鼠的HOMA-IR明显增加。然而，药物治疗8周后，HOMA-IR不同程度地降低，3000Da的COSG具有最佳治疗效果。
通过上述实验和分析可知，本专利发明的壳寡糖双胍衍生物有一定的抗氧化活性，能抑制体重降低与血糖和尿糖升高，提高胰岛素水平，使得ALT,AST酶的活力降低，同时降低血清中TP，TBIL，FFA的含量，防止相关酶从肝细胞渗漏到胞外循环中，降低自由基对肝脏损伤的程度，另一方面，可降低MDA，同时增加SOD,CAT，GSH-Px的活力值，减弱肝脏组织的氧化应激损伤。最终发挥对肝脏氧化应激损伤的治疗作用，且与单独使用传统糖尿病治疗药物二甲双胍相比，壳寡糖双胍衍生物治疗效果更佳，即本发明中壳寡糖双胍衍生物在制备抑制肝损伤药物中的应用。
表2
表2为COSG对STZ诱导的糖尿病大鼠的肝损伤相关肝功能指标的影响。数据是均值±标准差，n＝6，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001和空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001和模型组相比。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。