阅读说明：本技术 4-辛基衣康酸在制备治疗脓毒症急性肺损伤药物中的应用 (Application of 4-octyl itaconic acid in preparing medicine for treating acute lung injury caused by sepsis ) 是由 庞庆丰 刘钢 王志强 吴亚先 陈丹 于 2020-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于脓毒症医药应用领域,涉及4-辛基衣康酸在制备治疗脓毒症急性肺损伤药物中的应用。本发明为制备治疗MRSA引起的急性肺损的药物提供了一个新的靶点,将4-OI应用到脓毒症急性肺损伤相关的药物开发过程中,以制备更好的治疗药物。本发明为目前治疗MRSA引起的急性肺损的药物提供了全新的思路,拓宽了治疗MRSA引起的急性肺损的选择领域,也为该技术领域的发展做出了贡献。(The invention belongs to the field of sepsis medicine application, and relates to application of 4-octyl itaconic acid in preparation of a medicine for treating sepsis acute lung injury. The invention provides a new target point for preparing the medicine for treating acute lung injury caused by MRSA, and the 4-OI is applied to the development process of the medicine related to acute lung injury of sepsis to prepare a better treatment medicine. The invention provides a brand new thought for the existing medicine for treating the acute lung injury caused by the MRSA, widens the selection field for treating the acute lung injury caused by the MRSA, and also makes a contribution to the development of the technical field.)

4-辛基衣康酸在制备治疗脓毒症急性肺损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于脓毒症医药应用领域，涉及4-辛基衣康酸在制备治疗脓毒症急性肺损伤药物中的应用。

背景技术

革兰氏阳性细菌病原体引起的肺炎是全世界急性肺损伤(ALI，Acute lunginjury)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS，Acute respiratory distress)的主要原因。金黄色葡萄球菌(SA，S.aureus)是临床上最常见的革兰氏阳性细菌病原体。金黄色葡萄球菌是许多毒素的生产者，这些毒素共同导致了其潜在毒性。耐药性金黄色葡萄球菌是医院或社区获得的导致严重感染的生物，目前是全球主要的医疗保健问题。MRSA可引起传染病，包括菌血症，骨髓炎，皮肤和软组织，胸膜肺炎和其他传染病。MRSA菌血症是由MRSA引起的临床上重要的疾病，可导致几乎任何身体部位的播种和随之而来的并发症。在MRSA败血症中，肺是最常见的感染部位。由于对一线抗生素的耐药性和不敏感性以及缺乏同等有效的替代品，与MRSA败血症相关的肺损伤合并症仍缺乏相关的有效药物来治疗。但是，到目前为止，尚无有效的MRSA治疗药物或策略。

显然寻找新的药物治疗靶点和新的治疗手段是一项非常急迫的工作。

衣康酸是一种内源性代谢产物，已被证明具有抗炎和抗氧化作用。但是，衣康酸的应用受到限制，因为它的亲水性结构不能很好地穿透细胞膜。衣康酸的衍生物4-辛基衣康酸(4-OI，4-Octyl Itaconate)比衣康酸具有更高的脂肪溶解度，并且可以更轻松地穿透细胞膜，发挥重要的作用。目前尚未有研究报道4-OI在制备抗MRSA的急性肺损伤中的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为现有的制备治疗MRSA药物的技术领域提供一种新的途径，提供4-OI在制备治疗MRSA导致的急性肺损伤中的作用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是将4-OI应用于制备治疗MRSA的急性肺损伤的药物。

研究表明，在小鼠腹腔注射MRSA诱导脓毒症后，小鼠给予腹腔注射4-OI减轻了脓毒症产生的损伤。本研究发现4-OI可以降低MRSA诱导的脓毒症的死亡率；减少肺泡和肺泡腔中中性粒细胞的数量；使肺组织中髓过氧化物酶(MPO)，丙二醛(MDA)的表达减少；使肺组织炎性因子(IL-1β，IL-6及TNFα)表达降低；使抗氧化基因(Nrf2，HO-1，NQO1)表达升高；减轻肺组织中的MRSA细菌负荷。以上结果表明4-OI可通过抑制炎症及氧化应激显著改善MRSA引起的脓毒症急性肺损伤，可作为新的抗MRSA药物进行开发，为治疗MRSA引起的脓毒症肺损伤提供一种新的手段和途径。

本发明的有益效果是：4-OI可减轻MRSA引起的脓毒症急性肺损伤中炎症和氧化应激损伤。本发明为制备治疗MRSA引起的急性肺损的药物提供了一个新的靶点，将4-OI应用到脓毒症急性肺损伤相关的药物开发过程中，以制备更好的治疗药物。本发明为目前治疗MRSA引起的急性肺损的药物提供了全新的思路，拓宽了治疗MRSA引起的急性肺损的选择领域，也为该技术领域的发展做出了贡献。

附图说明

图1：4-OI减少小鼠MRSA脓毒症肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出，分别以肺泡灌洗液细胞计数，肺泡灌洗液蛋白浓度和免疫组化染色(MPO)为指标。

图2：4-OI改善小鼠MRSA脓毒症肺损伤情况，以HE染色中肺泡空间中炎性细胞浸润数量及肺损伤评分为指标。

图3：4-OI缓解小鼠MRSA脓毒症肺组织炎症，以促炎因子(IL-1β，IL-6及TNFα)mRNA的表达为指标。

图4：4-OI减轻小鼠MRSA脓毒症氧化应激，分别以小鼠血清丙二醛(MDA)的活性、肺组织抗氧化基因(Nrf2，HO-1，NQO1)mRNA的表达为指标。

图5：4-OI减轻小鼠免受MRSA的侵袭损伤，以小鼠的生存率和肺组织的细菌负荷量为指标。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定，除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1MRSA脓毒症模型的建立

将野生雄性C57小鼠随机分开三组：

(1)生理盐水组(盐水)：为正常静脉，小鼠腹腔单次注射生理盐水。

(2)MRSA小鼠组(MRSA)：腹腔单次注射MRSA(3x108)。

(3)MRSA+4-OI组(MRSA+4-OI)：腹腔单次注射4-OI，1小时后再腹腔注射MRSA。

MRSA脓毒症模型的制作方法：利用野生雄性C57小鼠腹腔注射MRSA模拟脓毒症模型。具体方法为野生雄性C57小鼠腹腔单次注射MRSA(3x10⁸/只)，正常注射生理盐水(盐水)作为对照。

实施例2RNA提取及Real-time PCR

采用Trizol(Life Technologies)法提取肺组织RNA，具体操作按说明书进行。利用紫外分光光度计检测RNA的含量，根据在260nm和280nm处的吸光比值，检测RNA纯度。纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(可靠范围在1.9-2.1之间)。取1μg总RNA，加2μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Takara)，用去离子水补至20μl进行逆转录，合成cDNA；Real-time PCR按如下所列引物，采用设定程序进行。

Mouse-HO-1:

Forward CAAGCCGAGAATGCTGAGTTCATG

Reverse GCAAGGGATGATTTCCTGCCAG

Mouse-Nrf2:

Forward TTCAGCCAGCCCAGCACATC

Reverse CGTAGCCGAAGAAACCTCATTGTC

Mouse-NQO-1:

Forward TTCTGTGGCTTCCAGGTCTT

Reverse AGGCTGCTTGGAGCAAAATA

Mouse-TNF-α:

Forward CATGAGCACAGAAAGCATGATCCG

Reverse AGCAGGAATGAGAAGAGGCTGAG

Mouse-IL-1β:

Forward GCAACTGTTCCTGAACTCAACT

Reverse ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT

Mouse-IL-6:

Forward ACAACCACGGCCTTCCCTACTT

Reverse CACGATTTCCCAGAGAACATGTG

Mouse-GADPH:

Forward AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

Reverse TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

实施例3肺泡灌洗液的蛋白和细胞的获取

用0.5mL无菌PBS溶液灌洗肺组织3次，并将溶液在4℃以1,000g离心10分钟。使用BCA试剂盒(Beyotime)收集无细胞的上清液进行总蛋白分析，然后将细胞沉淀重悬于PBS(100μl)中。我们使用流式细胞仪(BD C6)检测重悬细胞的数量。

实施例4肺血清髓过氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)活性

MDA含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数，可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也能间接反映组织过氧化损伤程度。利用髓过氧化物酶和丙二醛测定试剂盒(南京建成公司)测定血清中MPO和MDA活性。

实施例5肺组织病理损伤检测

先用4％多聚甲醛浸泡小鼠肺组织进行固定，冲洗，用浓度从70％到100％的梯度酒精脱水，脱水完成后用100％二甲苯进行组织透明，之后放入蜡缸浸蜡，再包埋组织，进行石蜡切片。使用HE染色试剂盒(南京建成公司)染色后，通过显微镜观察拍照。对切片使用柠檬酸钠溶液进行抗原修复(Solarbio，北京，中国)。依次用抗生物素蛋白和生物素封闭切片，然后将其与1/1000稀释的抗MPO抗体(Abcam)在4℃孵育过夜。用PBS洗去第一抗体后，将切片与生物素化的IgG在37℃温育30分钟。使用SABC(链霉激活素-生物素复合物)方法进行染色，并且使用二氨基联苯胺作为染色底物，通过显微镜观察拍照。

实施例6小鼠生存率检测

通过腹膜内注射致死剂量的MRSA[3×10⁸集落形成单位(CFU)/小鼠]攻击所有小鼠，提前1小时腹腔注射4-OI(25mg/kg)处理小鼠。在接下来的7天中记录生存状态。

实施例7肺组织细菌负荷检测

取每组小鼠的肺，在1ml无菌0.9％NaCl中匀浆。在无菌的0.9％NaCl中连续稀释10倍后，将三种浓度的肺组织匀浆液分别以100μl体积接种在Luria-Bertani琼脂平板上。在37℃温育18小时后，计数CFU并将细菌载量表示为每个器官的Log 10(CFU/g)。

实验结果如附图1至5中所示：

(1)4-OI减少小鼠MRSA脓毒症肺泡炎性细胞浸润和蛋白渗出

MRSA感染导致炎性细胞在小鼠肺泡中迁移，从而使MRSA组的BALF中的细胞数量显着高于对照组，而4-OI处理可减少炎性细胞的浸润；MRSA组的BALF蛋白含量(肺血管通透性的指标)明显高于对照组，4-OI干预阻止了BARSA中MRSA诱导的总蛋白增加(见附图一)。

数据均以均值±标准误(mean±SE)表示，每组样本数为5。P＜0.05为有统计学差异。**与Saline相比，P<0.01；***与Saline相比，P<0.001；^#与MRSA相比，P<0.05。

(2)4-OI改善小鼠MRSA肺损伤情况

MRSA刺激后小鼠肺泡体积明显增大、炎症细胞数量增多，肺泡壁增厚，4-OI可改善这些病例改变，表现为肺泡结构损伤得到修复，炎性细胞减少，表明4-OI可改善MRSA小鼠肺组织损伤(见附图二)。

数据均以均值±标准误(mean±SE)表示，每组样本数为5。P＜0.05为有统计学差异。***与Saline相比，P<0.001；^##与MRSA相比，P<0.01。

(3)4-OI缓解小鼠MRSA脓毒症肺组织炎症

qPCR结果表明，MRSA感染显着增加了肺组织中TNF-α，IL-1β和IL-6的mRNA表达，而4-OI处理相应地降低了它们的mRNA表达(见附图三)。

数据均以均值±标准误(mean±SE)表示，每组样本数为5。P＜0.05为有统计学差异。*与Saline相比，P<0.05；**与Saline相比，P<0.01；***与Saline相比，P<0.001；^#与MRSA相比，P<0.05。

(4)4-OI改善MRSA小鼠氧化应激

MDA含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数，可以反映机体脂质过氧化速率和强度，也能间接反映组织过氧化损伤程度。MRSA刺激诱导的小鼠血清中MDA活性明显升高，同时肺组织中抗氧化基因(Nrf2，HO-1，NQO1)的表达明显减少，4-OI显著减少MDA的活性，同时促进抗氧化基因的表达(见附图四)。

数据均以均值±标准误(mean±SE)表示，每组样本数为5。P＜0.05为有统计学差异。*与Saline相比，P<0.05；**与Saline相比，P<0.01；^#与MRSA相比，P<0.05；^###与MRSA相比，P<0.001。

(5)4-OI减轻小鼠免受MRSA的侵袭损伤

生存率是反映MRSA对机体损伤的最重要的指标。MRSA刺激小鼠导致小鼠生存率下降，施用4-OI后明显提高了小鼠的生存时间和生存率。MRSA的定植是导致MRSA对机体损伤的最重要的原因，肺组织中细菌的负荷反映了MRSA对机体的侵袭损伤情况。MRSA刺激小鼠导致肺组织细菌的负荷增加，4-OI可以显著减少肺组织细菌量(见附图五)。

数据均以均值±标准误(mean±SE)表示，每组样本数为5。P＜0.05为有统计学差异。***与Saline相比，P<0.001；^##与MRSA相比，P<0.01。