一种获得片段化dna单链池的方法及其应用

文档序号：900180 发布日期：2021-02-26 浏览：9次 >En<

阅读说明：本技术 一种获得片段化dna单链池的方法及其应用 (Method for obtaining fragmented DNA single-strand pool and application thereof ) 是由齐浩郜艳敏于 2020-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,本发明公开了一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用。本发明利用只有一条靠近待检测位点的引物且在ddNTPs存在的情况进行PCR扩增片段化DNA,产生长度较短的末端带有一个ddNTP的DNA单链池,使得扩增的片段长度集中在80-120nt,对比不加ddNTPs的方法,本发明使得片段化DNA更充分更全面地扩增出带有待检测位点的短的单链DNA片段,产生的片段长度更短,长度分布更窄。同时在后续的应用Blocker介导的锁式探针技术以及其他杂交探针进行片段化DNA的检测时,检测更准确和更灵敏,能够应用于片段化DNA的相关检测中。(The invention relates to the technical field of biology, and discloses a method for obtaining a fragmented DNA single-strand pool and application thereof. The invention utilizes only one primer close to the site to be detected and carries out PCR amplification fragmentation DNA under the condition that ddNTPs exist, a DNA single-chain pool with a short length and a ddNTP at the tail end is generated, so that the length of the amplified fragments is concentrated in 80-120nt, compared with a method without ddNTPs, the invention ensures that the fragmentation DNA more fully and comprehensively amplifies short single-chain DNA fragments with the site to be detected, the length of the generated fragments is shorter, and the length distribution is narrower. Meanwhile, when the Blocker-mediated padlock probe technology and other hybridization probes are subsequently applied to the detection of fragmented DNA, the detection is more accurate and sensitive, and the method can be applied to the related detection of fragmented DNA.)

一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用。

背景技术

癌症是临床上常见的恶性肿瘤，这个疾病进展快死亡率高，对患者身体心理经济上造成了巨大的危害，也是大家比较关注的公共卫生问题。近几十年，癌症的诊断是一直研究的热点话题，2013年，《Nature》刊登了一篇证实绝大部分人类所患的癌症，都由21个主要的基因突变引成的论文，至此，基因检测成为了癌症治疗及预防的重要手段。通过基因检测，我们可以把人体这些变异的基因找出来，根据基因检测的结果再“因人而异”选择化疗药物或分子靶向治疗药物，从而实现癌症的个性化治疗。

在基因检测中，cfDNA的检测、监测和分子研究为早期疾病的检测提供了一种有意义的、无创的方法。目前，人体体液中循环的片段化的DNA(Circulating cell-free DNA,cfDNA)作为非侵入性筛查和诊断的遗传物质得到众多科学家及临床医生的关注。FernandoM R和其同事发现在血浆中包含76bp,135bp,490bp和905bp的DNA分别占比100％、39％、18％、5.6％，说明这些游离的DNA是高度片段化的。但高度片段的DNA对于目前已有的核酸检测技术具有很大的挑战性。

目前大多数的检测方法都是检测单链DNA(ssDNA)的基因突变，而外周血中的cfDNA是片段化的双链DNA(dsDNA)，所以尽可能更完全的扩增出带有检测位点的cfDNA片段的单链形式是较为关键的工作。

当前，获取ssDNA的方法可以用Lambda外切酶降解法，即首先用一条磷酸化的引物和一条普通的引物进行典型PCR扩增得到双链产物，随后加入Lambda外切酶(识别磷酸基团并将带有磷酸基团的那条链逐一降解成单个核苷酸)进行降解，最后得到单链DNA。但该方法获取cfDNA的单链时会丢失部分样本，这是因为cfDNA是高度片段化，目前科学家们对其了解甚少，仅仅知道其长度的分布范围，但基因组在片段化的位置不确定。传统PCR无法设计出一组引物可以获取所有种类的cfDNA片段单链。故当某一条cfDNA片段，如果不能同时包含两条引物的结合序列时，则无法完成PCR过程，进而无法得到这条cfDNA的单链形式，在后续的检测中，这条cfDNA所携带的遗传信息丢失。

并且当以cfDNA为模板时，目前常规的获得单链池的方法比如不对称PCR可能会扩增出一条很长的单链，是多种cfDNA片段的结合(扩增出长链是因为每一轮产生的产物都可以作为随后每轮的引物，所以就会和片段化的cfDNA中的多种片段结合，生成长链)。而较长的ssDNA很容易形成二级结构，将降低后期检测方法的灵敏度和精准度。

综上，使用Lambda外切酶降解法这种普通PCR方法得到的cfDNA单链，无法展现多种片段化cfDNA待检测位点的所有遗传信息，且容易生成具有复杂二级结构的副产物，最终降低后续检测方法的灵敏度和精准度。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种获得片段化DNA单链池的方法，使得所述方法能够展现出多种片段化单链DNA形式，避免片段化单链DNA待测位点的丢失；同时，获得的片段化单链DNA长度较短，不容易形成二级结构；

本发明的另外一个目的在于提供上述方法在检测片段化DNA单位点变异中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供一种检测片段化DNA单位点变异的方法，在使用上述方法基础上进行片段化DNA单位点变异的准确检测。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种获得片段化DNA单链池的方法，包括：

步骤1、将片段化DNA进行5’磷酸化；针对靶基因待测位点设计单条互补引物，所述单条互补引物5’端与靶基因结合位点位于所述待测位点的3’端一侧10-30bp；

步骤3、以步骤1的5’磷酸化的片段化DNA为模板，利用所述单条互补引物进行PCR扩增；其中，PCR扩增体系中需加入ddNTPs；

步骤4、PCR扩增结束后加入核酸外切酶降解掉模板，获得片段化DNA单链池。

血液中DNA是高度片段化的，特别是cfDNA这种，因断裂位置不同，导致DNA片段的种类的多样性且机理不明确。相比传统的PCR，本发明类似于当前的不对称PCR技术，但只使用一条引物，本发明设计靠近靶基因待测位点的单条引物使单链DNA分子富集，并可以通过ddNTPs更充分更完全地扩增富集带有该待测位点的短单链DNA片段，避免了传统PCR中导致片段化DNA在扩增过程中的丢失，为后续各种杂交探针检测片段化DNA提供单链DNA模板。

同时参照图1所示的原理示意图，本发明中只添加单条引物，该引物距离待测位点较近，并且在PCR体系中的核苷酸是脱氧核糖核苷酸(dNTPs)与双脱氧核糖核苷酸(ddNTPs)的混合物，当聚合反应添加上ddNTPs时即停止后续聚合，生成一条待检测的DNA单链，使扩增产物不会很长，单链长度集中在100nt左右。

作为优选，所述单条互补引物在PCR扩增体系中的浓度至少为0.2μM，进一步优选地，其浓度为0.2-10μM；更优选地，其浓度为0.2-4μM、0.2-2μM、或2-4μM；在本发明

具体实施方式

中，其浓度为0.2μM、2μM或4μM；

作为优选，所述PCR扩增体系中ddNTPs与dNTPs的比例为(0.02-50):1。在具体实施方式中，ddNTPs与dNTPs的比例为24:1或1:50；

以相同cfDNA模板为前提，本发明以加入ddNTPs和不加入ddNTPs作为两个试验组来检测ddNTPs对本发明获得单链池方法的影响，结果显示，不加ddNTPs产生的cfDNA单链池中大部分的片段长度集中在100nt-200nt之间，本发明产生的cfDNA单链池中大部分的片段长度集中在80-120nt左右，片段有明显的缩短，这会大大避免所产生单链的形成二级结构的概率，从而提升了检测的灵敏度。而且，在本发明后续提供的检测片段化DNA单位点变异的方法中，不加入ddNTPs的试验组所获得的单链池中会缺失很多的突变样本，致使后续检测无法呈现出真实突变比率；而本发明所检测的突变比率则明显高于仅加入dNTPs的试验组，能够呈现出更丰富的突变情形，避免丢失。

因此，本发明提出了所述获得单链池的方法在检测片段化DNA单位点变异中的应用。作为优选，所述片段化DNA为cfDNA或ctDNA。

基于上述应用，本发明还提出了一种检测片段化DNA单位点变异的方法，包括：

步骤1、利用本发明所述获得单链池的方法获得片段化DNA单链池；

步骤2、采用现有检测方法分析所述片段化DNA单链池。

目前，众多文献报道是利用锁式探针技术结合RCA扩增技术进行核酸序列、miRNA、SNP、单碱基变异等检测。因此作为优选，所述现有检测方法为锁式探针技术结合RCA扩增技术。

锁式探针-RCA技术对核酸序列尤其是单位点变异的检测，主要是依赖于探针和靶标的碱基互补配对，而基于锁式探针-RCA技术对核酸序列检测由于连接酶忠实度的问题，造成一定的假阳性或者假阴性。以单碱基变异检测为例说明，利用锁式探针对单位点变异的检测，探针的设计基本上是将变异位点设计在探针的3’末端，探针的3’末端与突变型碱基完全互补配对、与野生型的只有该位点不匹配。理想情况下，仅突变型靶标存在的情况会形成环状单链DNA(cssDNA)。但在常温下，有些碱基对之间会出现一定的错配,此时连接酶并不能识别出错配，仍然可以将5’端磷酸基团与3’端羟基基团连接起来形成磷酸二酯键，从而形成cssDNA(即会导致在野生型靶标的存在下形成cssDNA)，进而进行RCA反应将信号放大。该结果就会导致假阴性的出现，而假阳性的产生与假阴性的产生正好相反。

针对上述问题，本发明提出了一种改进的锁式探针技术结合RCA扩增技术，具体如下：

步骤1、针对野生型单链靶基因设计锁式探针以及野生型blocker探针；针对突变型单链靶基因设计突变型blocker探针；

步骤2、用步骤1中的三种探针对片段化DNA单链池进行RCA扩增，获得Ct值，计为A3；

用步骤1中锁式探针以及野生型blocker探针对片段化DNA单链池进行RCA扩增，获得Ct值，计为A2；

用步骤1中锁式探针对片段化DNA单链池进行RCA扩增，获得Ct值，计为A1；

其中，所述野生型/突变型blocker探针为单链DNA寡核苷酸，由3’→5’方向分为a和b两个区域序列，所述锁式探针分为I-III三个区域序列，并可按I→II→III→I顺序经DNA聚合酶连接3’和5’成环；其中，I、III区域序列与靶基因互补，b区域序列与I区域序列相同，a区域序列与野生型/突变型靶基因互补；所述a区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能等于III区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能；片段化DNA单位点变异位置位于与a区域序列互补的靶基因序列上；在本发明具体实施方式中，片段化DNA单位点变异位置位于与a区域序列互补的靶基因序列上的3’端。

步骤3、按照公式D＝(A3-A2)/(A3-A1)计算D值，D值表示片段化DNA单位点变异的比率，D值越高，说明观察到的突变率越高。

对于锁式探针的I和III两个区域序列，当其与靶序列互补结合且尚未被DNA聚合酶聚合成环时(即3’端和5’端未连接)，3’端和5’端之间的空缺称之为断点，该断点可出现在I区域序列上，也可出现在III区域序列上，或正好是I区域序列和III区域序列的分割点；断点的位置与blocker探针序列有关，一般位于I+III区域序列的中部。

对于锁式探针的II区域序列，其可以根据实际需要设计成不同的序列；目前，cssDNA已展现出潜在的临床应用，如2018年，J.Meng,et.al.设计了一个人工环状单链DNA(CSSD)分子，该分子包含连续的多个与miR-9互补的序列位点。从而使得miR-9通过碱基互补杂交在CSSD上，进而在体内上调抑癌基因(KLF17,CD17和LASS2)的表达，抑制了肿瘤的恶化和肺转移。该CSSD分子相比与miR的抑制剂更稳定且抗降解。同时，cssDNA也应用于适配体的筛选，M.Liu.et.al.从环状单链DNA文库中发现了两个高亲和力环状DNA适体，这两个适体可识别来自Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶(GDH)(这是一种应用于诊断Clostridium difficile感染的抗原)。该环状DNA适配体具有较高的稳定性，且其与滚环扩增结合更容易放大信号。因此，锁式探针I、III区域序列负责锁式探针成环，II区域序列根据目标设计成不同的序列，但需要避免与单链靶基因互补，且避免与I，III区域形成二级结构。

本发明是在Padlock(锁式探针)技术的基础上设计出另外一条DNA oligo即本发明称之为blocker探针(针对野生型靶基因的为野生型blocker探针，针对突变型靶基因的为突变型blocker探针)。该blocker探针分为a、b两个区域，其与靶标DNA序列(黑色)互补配对，其中a区域(灰色)是blocker的toehold区域(相对于padlock探针与靶标DNA序列结合的位置而言，该区域与靶标DNA序列结合是突出来的)，可参考附图2。另外，padlock探针是一条5’端带有磷酸基团的单链DNA，其可分为I、II、III三个区域；其中I、III区域与靶标DNA序列互补配对，并且I区域(绿色)的序列与blocker探针的b区域(绿色)是相同的序列，III区域(紫色)的是padlock探针的toehold区域(相对于blocker与靶标DNA序列结合的位置而言，该区域与靶标DNA序列结合是突出来的)。其作用原理是：首先Blocker探针结合到靶标DNA序列上，接着padlock探针会通过其III区域即通过toehold区域优先结合于靶标DNA序列上，然后padlock探针通过链置换将blocker从靶标DNA序列上置换下来，最后T4 DNAligase会将padlock探针连接成环状单链DNA(即cssDNA)。

通过热动力学计算，在设计blocker探针和padlock探针时，可根据软件如NUPACK将blocker探针结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能设计成约等于(所述约等于指两者吉布斯自由能相差不超过1-2Kcal/mol)padlock结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能，如此一来生成cssDNA的过程就是一个动态平衡状态；而一旦用于检测核酸单位点变异时，如果野生型Blocker探针与突变型DNA序列(S)有一个碱基的错配，此时padlock探针结合到靶标序列上的吉布斯自由能会大于野生型blocker探针结合到发生单位点变异的靶标序列上的吉布斯自由能，因此padlock探针结合到靶标序列上更加稳定，从而形成的产物cssDNA更多，表现在电泳上的结果是cssDNA条带相对于没有发生单位点变异的对照条带会更亮，而结合RCA后可进一步将信号放大，参考附图3；相反地，如果突变型Blocker探针与野生型DNA序列(WT)有一个碱基的错配，也会出现上述相同的结果；但是，如果野生型/突变型Blocker探针对应于各自的野生型/突变型DNA序列，则会保持这种动态平衡状态。

此外，锁式探针-RCA技术中，可能会有两条Padlock探针序列同时杂交到一条靶标序列上，这样就导致了多聚物的生成，参考附图4；但在有blocker探针作用的情况下，无论是野生型模板还是突变型模板，blocker探针优先结合到靶标序列上，然后Padlock探针通过III区域即toehold区域置换掉blocker，由于在同一条探针上有与靶标序列互补的序列(即5’端)，同一探针的5’端会优先结合在靶标上，这样就会减少多聚物的产生，促进目标cssDNA的生成，参考附图5。

作为优选，所述a区域序列长度为2-20nt，所述b区域序列长度以及I区域序列长度独立选自4-30nt，所述III区域序列长度为2-20nt。所述II区域序列长度为15-45nt。

在本发明一些具体实验中，本发明通过实验验证了改进的锁式探针+Blocker探针的技术能够避免假阴性或假阳性的问题，且具备较高的特异性和灵敏性，以及减少多聚物的产生，能够结合本发明提供的获得单链池的方法应用于片段化DNA的单位点变异的检测，例如cfDNA的单位点变异检测。

在具体的对比实验中，以基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR作为对照方法(分别设计引物间跨度为80nt和150nt的两对引物)，本发明所述获得单链池的方法与其采用相同的cfDNA样本进行扩增，结果显示，在相同的模板前提下，本发明获得单链池的方法要比普通PCR获得单链池的方法检测到更多的突变型片段，这对于突变型的检测有重要的意义。有文献表明，ctDNA的片段要比正常的cfDNA的片段更短一些，采用双引物体系普通PCR的方法会丢失那些比较短的片段，本发明图14结果印证这一结论，并且双引物之间跨度越长，所丢失的片段就会越多，而本发明这种仅有一个引物的不平衡PCR会看到更全的突变型片段。

由以上技术方案可知，本发明利用只有一条靠近待检测位点的引物且在ddNTPs存在的情况进行PCR扩增片段化DNA，产生长度较短的末端带有一个ddNTP的DNA单链池，使得扩增的片段长度集中在80-120nt，对比不加ddNTPs的方法，本发明使得片段化DNA更充分更全面地扩增出带有待检测位点的短的单链DNA片段，产生的片段长度更短，长度分布更窄。同时在后续的应用Blocker介导的锁式探针技术以及其他杂交探针进行片段化DNA的检测时，检测更准确和更灵敏，能够应用于cfDNA等片段化DNA的相关检测中。

附图说明

图1所示为本发明获得单链池方法的原理示意图；

图2所示为本发明改进的锁式探针+Blocker探针的技术原理示意图；

图3所示为本发明改进的锁式探针+Blocker探针的技术用于检测核酸单位点变异的原理示意图；其中，S表示发生单位点变异的靶基因，X为野生型的靶基因；

图4所示为在没有Blocker探针下锁式探针形成多聚物的原理示意图；

图5所示为在有Blocker探针下锁式探针形避免多聚物产生的原理示意图；

图6所示为基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR获取单链DNA的原理图；

图7所示为本发明方法和基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR方法获得的单链池样本的毛细管电泳结果；上图为本发明的结果，下图为基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR方法的结果；

图8所示为验证本发明方法减少多聚物的试验结果；左图中，泳道1为仅线性padlock探针；泳道2为没有blocker探针作用的情况下，采用线性padlock探针连接；泳道3为在blocker探针作用的情况下采用线性padlock探针连接；*所在位置条带是生成的环状DNA产物；右图中，泳道1为仅线性padlock探针；泳道2为没有blocker探针作用的情况下，采用线性padlock探针连接；泳道3-6为在blocker3-6探针作用的情况下采用线性padlock探针连接；

图9所示为利用本发明改进的锁式探针+Blocker探针的技术对单位点变异的核酸进行检测的结果；其中，左图为凝胶图，右图为凝胶图的条带灰度值量化结果；泳道1：加入体系中的padlock探针(对照)；泳道2：没有加blocker，靶标为野生型序列的；泳道3：没有加blocker，靶标为突变型序列；泳道4：加入野生型blocker，靶标为野生型序列；泳道5：加入野生型blocker，靶标为突变型序列；Q值为靶标为突变型序列的已成环的条带灰度值/靶标为野生型序列的已成环的条带灰度值；A为没有加入blocker的Q值，B为加入野生型blocker的Q值；

图10所示为验证本发明改进的锁式探针+Blocker探针的技术在检测单位点变异的核酸的特异性和灵敏度的RCA结果；左图曲线从上至下依次表示为含有100％、10％、1％、0.1％和0％的突变型序列的混合序列；

图11所示为检测原理示意图；

图12所示为cfDNA样本的RCA检测结果；

图13所示为纯野生型模板和纯突变型模板按照本发明检测方法检测后的RCA扩增曲线；其中，无代表No Blocker探针，双代表WT+SNV Blocker探针，单代表单一野生型WTBlocker探针；

图14所示为本发明方法与基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR方法分别从同一个样品中制备单链DNA进行突变型检测的比较结果；S1代表本发明所用的方法制备单链DNA进行的突变型检测得到的D值；PCR1代表传统PCR结合Lambda外切酶降解方法制备的80nt的单链DNA进行的突变型检测得到的D值；PCR2代表传统PCR结合Lambda外切酶降解方法制备的150nt的单链DNA进行的突变型检测得到的D值；

图15所示为本发明方法加入与不加入ddNTPs制备ssDNA进行突变型检测得到的D值的比较。

具体实施方式

本发明公开了一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所用核酸片段、引物探针、试剂等均可通过试剂公司合成和购买。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明获得单链池的方法与基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR方法

基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR方法的原理示意图见图6；

本实施例针对cfDNA样本突变位点设计本发明单条互补引物F1，同时设计与F1之间的长度分别为80nt和150nt的成对引物R1和R2，组成两组成对引物F1和R1，以及F1和R2；具体见表1；

表1

cfDNA样本：EGFRMultiplex cfDNA Reference Standard(该cfDNA含有1％EGFRL861Q突变，市售)；

野生型序列：

ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC；

突变型序列：

ACAGATTTTGGGCTGGCCAAACAGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACC；

上表1所用的寡核苷酸片段均购自苏州金唯智生物科技有限公司(F1序列如SEQID NO:14所示)

本发明获得单链池的方法：

将cfDNA样本使用T4磷酸激酶进行5’端磷酸化，然后加入单条引物F1以及一定比例的核酸单体dNTPs与ddNTPs混合物进行PCR扩增(PCR扩增体系其他组分参照常规，具体见表2)。扩增结束后使用lambda核酸外切酶降解掉模板，即得到待检测的cfDNA单链池；

基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR方法：

以相同的cfDNA样本使用T4磷酸激酶进行5’端磷酸化，然后加入成对引物F1和R1或者F1和R2进行PCR扩增(不加入ddNTPs，其他PCR扩增体系同本发明，具体见表3)；扩增结束后使用lambda核酸外切酶降解掉模板，即得到待检测的cfDNA单链池；

表2

表3

component	50uL	Final Conc.
			H<sub>2</sub>O	28.5	--
5x Phusion reaction buffer	10	1x
			dNTPs(2.50M)	4	0.2mM
F1(100uM)	2	4uM
			R1/R2(100uM)	2	4uM
1％EGFR(PO<sub>4</sub>-)(10ng/uL)	3
			Phusion	0.5

PCR程序：

1.98℃2min

2.98℃30s

3.54℃30s

4.72℃5s

程序2-4重复150个循环

外切核酸酶酶切反应体系：

表4

component	30uL	Final Conc.
			H<sub>2</sub>O	1
10x lambda buffer	3	1x
			PCR产物	25
Lambda exonuclease	1

外切核酸酶酶切反应条件：

37℃3h,然后75℃10min灭活Lambda外切酶。

实施例2：本发明改进的锁式探针+Blocker探针的技术的可行性验证

本实施例选用表5中的序列进行可行性分析，但这并不应当成为本发明的限制，根据本发明提供的原理和方案可通过软件针对靶标设计出不同探针序列，而本发明不可能穷举；

表5

注：表5所有Blocker探针均为野生型探针；

表5中，Padlock probe(锁式探针)序列中斜体部分为I区域序列，下划线部分为III区域序列(自由能为-17.49Kcal/mol)，其余为II区域序列；野生型模板和突变型模板为第16个碱基发生G-T突变；Blocker 1序列中斜体部分为b区域序列，其他为a区域序列(自由能为-17.04Kcal/mol)；Blocker 2序列中斜体部分为b区域序列，也即没有a区域序列为0，其自由能也相应为0；

Blocker 3-6序列中，斜体部分为b区域序列，其他为a区域序列(自由能依次为-21.99Kcal/mol、-18.7Kcal/mol、-23.43Kcal/mol和-18.7Kcal/mol)；

根据吉布斯自由能可以采用Padlockprobe+Blocker 1检测单位点变异，采用Padlockprobe+Blocker 2用于单链环状DNA的产生(促进产生更多单链环状DNA)，两者都可以抑制多聚物的产生；

上表5所用的寡核苷酸片段均购自苏州金唯智生物科技有限公司(序列依次如SEQID NO:1-9所示)，padlock探针5’端均进行磷酸化修饰。T4 DNA ligase,Exo I,Exo III，Bst DNA polymerase均购自New England Biolabs(NEB)。dNTPs购自北京全式金生物科技有限公司。SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain购自赛默飞。SYBR Green I购自北京索莱宝生物科技有限公司。

本发明中采用的聚丙烯酰胺凝胶电泳均为15％变性聚丙烯酰胺凝胶。凝胶体系见表6：

表6

300V电压先进行预电泳30min，接着上样，120V电压电泳3h。然后SYBRGoldNucleic Acid Stain染色20min,凝胶成像仪(Azure C300)中成像。

1、验证减少多聚物的试验

按下表7的体系进行连接；

表7

将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III。最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图8。

图8左图中泳道1为仅线性padlock探针；泳道2为没有blocker探针作用的情况下，采用线性padlock探针连接，可以看出有多聚物(polymer)的生成，*所在位置是生成的环状DNA产物；泳道3为在blocker探针作用的情况下采用线性padlock探针连接，可以看出多聚物的生成大量减少甚至没有，而且环状产物的量还有所提高，说明其没有影响连接效率。

右图是使用其他几种blocker探针验证情况，结果和左图一致，能够看出多聚物的生成相比第2泳道不添加blocker探针大量减少，而且环状产物的量还有所提高，说明其没有影响连接效率。

2、单碱基变异的检测

按下表8进行连接；

表8

将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III(在生成cssDNA的过程中，可能会同时存在已经成环的padlock探针和线性padlock探针，为了避免电泳检测时线性padlock探针对cssDNA的影响，一般可利用外切酶特异性水解单链DNA而不水解环状单链DNA的特点，因此使用外切酶I和外切酶III)。最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，条带灰度值量化，结果见图9。

图9中，泳道1为仅加入体系中的padlock探针(对照)；泳道2为没有加blocker，靶标为野生型序列的；泳道3为没有加blocker，靶标为突变型序列；泳道4为加入野生型blocker，靶标为野生型序列；泳道5为加入野生型blocker，靶标为突变型序列。从图中可以看出，在没有blocker存在的情况下，野生型模板与突变型模板对于padlock成环的效率是一致的(Q值约为1)；但在加入野生型Blocker的情况下，突变型模板成环是野生型模板成环的16倍。这也说明了本发明改进技术中的blocker对于完全互补的序列是覆盖作用的；但对于有碱基差异的序列其结合模板作用是减弱的，正好验证了附图3描述的原理；这对于将来在临床上应用是很有意义的。因为临床上的样本中绝大多数为野生型序列，有极少的突变型序列，但对于目前的核酸检测技术来讲，野生型序列的信号会远远大于突变型序列的信号，这就造成了假阴性。如果更换成突变型Blocker进行相关实验，结果也可预期相同。

泳道2-5中*标记的为环状产物所在位置，与泳道1对照位于相同位置的条带是外切酶I/III没有降解完全导致。

3、特异性和灵敏性的检测

为了验证改进的技术对于单碱基变异检测的灵敏度和特异性，本实施例进行了0.1％的实验即在有999个野生型序列中有1个突变型序列的检测。即将突变型序列与野生型序列进行不同比例的混合，分别为0％，0.1％，1％，10％，100％。之后将其作为靶标序列进行检测，经过连接、外切酶降解、实时荧光滚环扩增收集扩增信号，连接体系见表9；

表9

将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III。最后进行实时荧光滚环扩增，RCA扩增体系见表10；

表10

该扩增混合物置于QuantStudio 6Flex Real-Time PCR Systems中55℃温育1h，并且每30s收集一次荧光信号，结果见图10。

从图10结果中可以看出，本发明改进技术实现了0.1％突变型序列的检测，说明本发明改进技术对于单碱基变异的检测具有较高的特异性和灵敏性。

实施例3：检测cfDNA的方法的验证

在实施例1的基础上结合本发明改进的锁式探针+Blocker探针的技术对EGFRMultiplex cfDNA Reference Standard样本进行检测，所设计的相关探针见下表8，加入不同Blocker探针的连接体系见表11-14，RCA反应体系见表15；

表11

表11中，Padlock probe(锁式探针)序列中斜体部分为I区域序列，下划线部分为III区域序列(自由能为-19.38Kcal/mol)，其余为II区域序列；野生型模板和突变型模板为第23个碱基发生G-T突变；Blocker 1序列中斜体部分为b区域序列，其他为a区域序列(自由能为-19.24Kcal/mol)；Blocker 2序列中斜体部分为b区域序列，其他为a区域序列(自由能为-19.63Kcal/mol)；

上表11所用的寡核苷酸片段均购自苏州金唯智生物科技有限公司(序列依次如SEQ ID NO:10-13所示)

表12双Blocker(野生+突变)连接体系

表13单Blocker(野生)连接体系

表14无Blocker连接体系

连接反应条件：

37℃3h,then 65℃10min to inactive T4 DNA ligase

表15RCA反应体系

如图11所示检测原理以及图12的具体RCA结果，A3是在双blokcer加入的情况下的连接产物进行RCA得到的Ct值(Ct＝96.65)，其代表由背景产生Ct；A2是在野生型Blocker加入的情况下的连接产物进行RCA得到的Ct值(Ct＝65.03)，其代表由(突变+背景)产生的Ct；A1是没有blocker存在的情况下的连接产物进行RCA得到的Ct值，其代表体系中(总的待检测物+背景)的产生的Ct(Ct＝42.97)。(A3-A1)就是总的待检测物所产生的Ct；(A3-A2)就是突变所产生的Ct；(A3-A2)/(A3-A1)就是从实验中计算得到的突变比率，计为D值。图12中，如果A2接近A3表示突变比率低，接近A1表示突变比率较高，D值越高则突变比率越高。

为了验证上述双blocker的反应条件和单blocker的反应条件的得到的Ct值的差异不是由多加一条blocker的原因导致的，而是由突变型模板存在导致的，在此分别以纯野生型模板和纯突变型模板按照本实施例前述试验方法进行RCA扩增，扩增曲线图见图13；

图13显示，突变基因频率为100％时(纯突变型模板)，只加野生型Blocker和不加任何Blocker的扩增曲线基本重叠，说明野生型的blokcer对突变型的模板存在一个碱基的差异没有起封闭的作用，而由于锁式探针不涉及突变位点的互补，故导致其检测结果与无Blocker的基本相同。而当突变基因频率为0％时(纯野生型模板)，加双blocker和只加一个blocker的扩增曲线基本重叠，说明突变型的blocker存在一个碱基的差异没有对野生型的模板起封闭的作用，而这两个扩增体系中由于都存在野生型blocker，能够与纯野生型模板互补进行封闭，故检测结果基本相同。

实施例4：本发明获得单链池方法与基于Lambda外切酶降解法的双引物PCR获得单链池方法的RCA检测对比

参照实施例1记载获得采用两个方法制备的单链池产物，然后按照实施例3的方法进行检测以及统一按照公式(A3-A2)/(A3-A1)计算D值，结果见图14；

由图14可以明显看出，在相同的模板前提下，本发明获得单链池的方法要比普通PCR获得单链池的方法检测到更多的突变型片段，这对于突变型的检测有重要的意义。有文献表明，ctDNA的片段要比正常的cfDNA的片段更短一些，采用双引物体系普通PCR的方法会丢失那些比较短的片段，图14结果印证这一结论，并且双引物之间跨度越长，所丢失的片段就会越多，而本发明这种仅有一个引物的不平衡PCR会看到更全的突变型片段。

实施例5：ddNTPs对本发明获得单链池方法的影响

1、DNA单链池长度影响

参照实施例1记载的本发明获得单链池的方法，以加入ddNTPs和dNTPs(24:1)，以及仅加入dNTPs作为两个试验组进行单链池的制备，将两个试验组获得的单链池送试剂检测公司进行毛细管电泳分析(Qsep 100DNA fragment analyzer)，结果见图7。由图7可以看出，不加ddNTPs的试验组产生的cfDNA单链池中大部分的片段长度集中在100nt-200nt之间，加入ddNTPs产生的cfDNA单链池中大部分的片段长度集中在80-120nt左右，片段有明显的缩短，这会大大避免所产生单链的形成二级结构的概率，从而提升了检测的灵敏度。

2、突变比率检测影响

参照实施例1记载的本发明获得单链池的方法，以加入ddNTPs和dNTPs(1:50)，以及仅加入dNTPs作为两个试验组进行单链池的制备，并参照实施例3的方法进行检测以及统一按照公式(A3-A2)/(A3-A1)计算D值，结果见图15；

由15可以明显看出，如果不加入ddNTPs，则所获得的单链池中会缺失很多的突变样本，致使后续检测无法呈现出真实突变比率；而本发明所检测的突变比率则明显高于仅加入dNTPs的试验组，能够呈现出更丰富的突变情形，避免丢失。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种获得片段化DNA单链池的方法及其应用

<130> MP2023196

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA