阅读说明：本技术 一种尿液中微生物核酸新型保存液 (Novel preservation solution for microbial nucleic acid in urine ) 是由 段志峰 于 2020-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种尿液中微生物核酸新型保存液,其包括如下组份：核酸酶抑制剂、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、防腐剂、甲醛猝灭剂、渗透剂、代谢抑制剂、丙三醇,所述尿液中微生物核酸新型保存液的pH为7～8。所述保存液能有效抑制尿液中的白细胞或者是上皮细胞裂解,同时抑制尿液中的游离核酸降解,维持游离核酸的稳定性,从而可以提高尿液检测的准确性,且所述的核酸新型保存液成分相对简单、成本低廉,同时还能够在室温条件下保持游离核酸的稳定性,非常适合在临床广泛使用。(The invention discloses a novel preservation solution for microbial nucleic acid in urine, which comprises the following components: the novel urine preservation solution comprises a nuclease inhibitor, a tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer solution, a preservative, a formaldehyde quencher, a penetrating agent, a metabolic inhibitor and glycerol, wherein the pH value of the novel urine preservation solution for microbial nucleic acid is 7-8. The novel preservation solution for the nucleic acid has the advantages that the preservation solution can effectively inhibit the lysis of leucocytes or epithelial cells in urine, simultaneously inhibit the degradation of free nucleic acid in the urine, and maintain the stability of the free nucleic acid, so that the accuracy of urine detection can be improved, the components of the novel preservation solution for the nucleic acid are relatively simple, the cost is low, simultaneously, the stability of the free nucleic acid can be kept at room temperature, and the novel preservation solution is very suitable for being widely used clinically.)

一种尿液中微生物核酸新型保存液

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种尿液中微生物核酸新型保存液。

背景技术

液态活检是直接从体液(例如血液或尿液)而不是实体组织中获得生物标记物的方法，是一种简单的非侵入性的手术活组织检查替代方法。尿液检测是分子生物学检测中常见的离体样本之一，尿液是由肾脏生成，经输尿管，膀胱排出的含有大量代谢终产物的液体。人体内各种体液与器官的关系中很少有像尿液与肾脏这般密切联系且容易获得的，可以能够动态反应肾脏和***的变化以及其他部位的异常或疾病信息。核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。尿液中含有核酸，对人体来说，尿液核酸的检验与血液核酸的检验相比，更具有无创伤性。但是尿液中含有能破坏细胞内细胞器以及降解核酸的尿素、尿酸等成分，导致尿液保存时长对检测结果有直接影响。此外，相比与外周血，尿液中的核酸酶含量更高、代谢物质更多、pH范围波动较大，故尿液中游离核酸所处的生物环境相对于血液来说会更复杂。如果尿液中有白细胞或者是上皮细胞破裂基因组核酸降解进入尿液中，或者是如果尿液中的核酸酶未被抑制，分泌的核酸酶能引起DNA链发生断裂、降解，初始游离DNA将会被降解掉，达不到检测水平，也会增加了检测的背景噪音，给后续的检测带来假阴性结果。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种尿液中微生物核酸新型保存液，所述保存液能有效抑制尿液中的白细胞或者是上皮细胞裂解，同时抑制尿液中的游离核酸降解，维持游离核酸的稳定性，从而可以提高尿液检测的准确性。

本发明采取的技术方案如下：

一种尿液中微生物核酸新型保存液，包括如下组份：核酸酶抑制剂、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、防腐剂、甲醛猝灭剂、渗透剂、代谢抑制剂，所述尿液中微生物核酸新型保存液的pH为7～8。

本发明所述的尿液中微生物核酸新型保存液使用核酸酶抑制剂能够抑制体系中的核酸酶活性，防止尿液样本中的核酸被降解，同时还可以维持白细胞或者是上皮细胞的稳定性，避免细胞裂解；三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液能够保持尿液样本为中性或弱碱性，为尿液样本中的核酸提供相对稳定的pH值环境；防腐剂同时具有抗凝血的作用，保障血细胞不致破裂，维持其稳定性；甲醛淬灭剂主要是与游离的自由醛反应，猝灭游离甲醛等自由醛，避免其对游离核酸造成损伤，使得尿液中的核酸能够维持自身结构的稳定，同时避免了自由醛抑制聚合酶链式反应和测序过程中的酶反应；渗透剂可以较好地维持细胞渗透压，裂解进一步避免细胞裂解；代谢抑制剂能够进一步抑制游离核酸的降解，稳定尿液中的游离核酸；丙三醇可以使保存液更加稳定。本发明通过对上述各组分的合理使用，使得所制备的尿液中微生物核酸新型保存液能够快速稳定尿液样本，有效抑制核酸酶的活性，防止细胞裂解，同时可以很好的保护尿液中的游离核酸，且保存时间久。

优选地，核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸或乙二醇四乙酸，浓度为5～10mmol/L。

优选地，所述三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为1～3mmol/L。

优选地，所述防腐剂为二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、柠檬酸钠、羟甲基甘氨酸钠中的一种或多种，浓度为2～5mmol/L。

优选地，所述甲醛猝灭剂为氨基酸和含胺化合物的混合物。进一步优选地，所述甲醛猝灭剂为精氨酸、赖氨酸、甘氨酸和乙二胺的混合物，混合浓度为20～30mmol。

优选地，所述渗透剂为葡萄糖、氯化钠、氯化钾、丙酸钠中的一种或多种，浓度为20～30mmol。

优选地，所述代谢抑制剂为甘油醛、甘油醛-3-磷酸或3-磷酸-2-磷酸甘油酯，浓度为1～2mmol/L。

优选地，所述丙三醇的质量分数为5～10％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述的尿液中微生物核酸新型保存液能够快速有效抑制核酸酶的活性，防止尿液样本中的核酸被降解，保障了游离核酸的含量，避免因游离核酸降解而达不到检测水平，同时还可以维持白细胞或者是上皮细胞的稳定性，避免细胞裂解，减少了检测背景噪音，提高了尿液检测的准确性；本发明所述的核酸新型保存液成分相对简单且成本低，同时能够在室温条件下保持游离核酸的稳定性，非常适合在临床广泛使用；本发明所述的核酸新型保存液保存时间久，能够提供充足的送检、受检时间。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

下述实施例中所用的实验原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例

将三羟甲基氨基甲烷溶于水中，用盐酸调节pH到7-8，制得60mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；将乙二胺四乙酸溶于水中，制成80mmol/L的乙二胺四乙酸溶液；将二羟甲基脲溶于水配制成80mmol/L的二羟甲基脲溶液，将柠檬酸钠配制成80mmol/L的柠檬酸钠溶液；将二羟甲基脲溶液和柠檬酸钠溶液按照体积比1:1混合得到防腐剂溶液；分别配制的0.1mol/L的精氨酸、0.2mol/L赖氨酸、0.2mol/L甘氨酸和0.3mol/L乙二胺水溶液，按照体积比1:1:1:1混合，得到甲醛猝灭剂溶液；配制0.1mol/L的葡萄糖水溶液，配制0.4mol/L的氯化钠溶液，按照体积比1:1:混合得到渗透剂溶液；将甘油醛溶于100mL丙三醇，配制浓度为40mmol的甘油醛-丙三醇溶液。

分别取100mL乙二胺四乙酸溶液、50mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、50mL防腐剂溶液、100mL甲醛猝灭剂溶液、100mL渗透剂溶液、50mL代谢抑制剂溶液混合均匀，再加入去离子水、稀盐酸和氢氧化钠溶液，调节混合液的pH值为7～8，且总混合液体积为1000mL，得到尿液中微生物核酸新型保存液。

1、健康志愿者样品实验：

样品：选4名健康志愿者晨尿，取每名志愿者的尿液60mL，均分为2份，每个志愿者的两组尿液记为A组、B组，每份约30mL。

处理方法：

(1)实验组

将其中一份30mL晨尿A组尿液与上述尿液中微生物核酸新型保存液按照积比5：1的比例混合，然后将混合后的混合液再分为两份，记为样品1和样品2，每份18mL，其中样品1在在4℃条件下保存，样品2在25℃保存。将B组样品也分为两份，每份18mL，记为样品3和样品4，样品3在4℃条件下保存，样品4在25℃保存。将样品1再分为4份，记为样品A1、样品A2、样品A3、样品A4。保存1h后取2mL样品A1，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液。保存24h后取2mL样品A2，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液；包存48h后取2mL样品A3，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液；保存120h后取2mL样品A4，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液。采用磁珠法分别对取得的上清液进行核酸提取，核酸试剂盒为市售游离DNA提取试剂盒，提取方案按照试剂盒说明书方法。对提取的核酸采用Q-bit进行浓度测定。采用同样的方式，将样品2分为4份，记为样品A5、样品A6、样品A7、样品A8，分别对应保存时间为1h、24h、48h、120h，分别测定提取的核酸浓度。为进一步减少实验误差，每个实验进行两组平行重复实验。实验结果见表1、表2所示。

(2)对照组

将样品3分为4份，记为样品B1、样品B2、样品B3、样品B4，分别在4℃保存1h、24h、48h、120h后，然后分别取2mL样品B1、样品B2、样品B3、样品B4，加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液，再进行直接采用采用Q-bit法进行核酸浓度测定。采用同样的方式，将样品4分为4份，记为样品B5、样品B6、样品B7、样品B8，分别对应保存时间为1h、24h、48h、120h，保存温度为25℃，分别测定提取的核酸浓度。为进一步减少实验误差，每个实验进行两组平行重复实验。实验结果见表1、表2所示。

表1 4℃保存条件下实验组和对照组的核酸浓度测定(健康志愿者)(浓度单位：ng/μL)

从表1的结果可知，经过所述尿液中微生物核酸新型保存液处理的实验组样品1中，在4℃条件下保存1h、24h、48h和120h，所得的核酸其浓度基本维持稳定，没有出现明显的降解，120h后的降解率大约维持在9％～10％左右；而未做任何处理的对照组样样品3，保存120h后核酸其浓度差不多减半。可见本发明所述的尿液中微生物核酸新型保存液能够较好的维持尿液中核酸的稳定性。

表2 25℃保存条件下实验组和对照组的核酸浓度测定(浓度单位：ng/μL)

从表2的结果可知，经过所述尿液中微生物核酸新型保存液处理的实验组样品2中，在25℃条件下保存1h、24h、48h和120h，所得的核酸其浓度也较为稳定，没有出现明显的降解，120h后的降解率大约维持在11％左右；而未做任何处理的对照组样样品4，保存120h后核酸其浓度差不多降低了58％。可见本发明所述的尿液中微生物核酸新型保存液在常温保持条件下也能能够较好的维持尿液中核酸的稳定性。

2、肾炎患者样品实验：

样品：选4名肾炎患者晨尿，取每名患者的尿液60mL，均分为2份，每个患者的两组尿液记为C组、D组，每份约30mL。

处理方法：

(1)实验组

将其中一份30mL晨尿C组尿液与上述尿液中微生物核酸新型保存液按照积比5：1的比例混合，然后将混合后的混合液再分为两份，记为样品5和样品6，每份18mL，其中样品5在在4℃条件下保存，样品6在25℃保存。将D组样品也分为两份，每份18mL，记为样品7和样品8，样品7在4℃条件下保存，样品8在25℃保存。将样品5再分为4份，记为样品C1、样品C2、样品C3、样品C4。保存1h后取2mL样品C1，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液。保存24h后取2mL样品C2，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液；包存48h后取2mL样品C3，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液；保存120h后取2mL样品C4，然后加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液。采用磁珠法分别对取得的上清液进行核酸提取，核酸试剂盒为市售游离DNA提取试剂盒，提取方案按照试剂盒说明书方法。对提取的核酸采用Q-bit进行浓度测定。采用同样的方式，将样品6分为4份，记为样品C5、样品C6、样品C7、样品C8，分别对应保存时间为1h、24h、48h、120h，分别测定提取的核酸浓度。为进一步减少实验误差，每个实验进行两组平行重复实验，实验结果见表3、表4所示。

(2)对照组

将样品7为4份，记为样品D1、样品D2、样品D3、样品D4，分别在4℃保存1h、24h、48h、120h后，然后分别取2mL样品D1、样品D2、样品D3、样品D4，加入离心管，8000rpm离心10min，然后取1mL上清液，再进行直接采用采用Q-bit法进行核酸浓度测定。采用同样的方式，将样品84分为4份，记为样品D5、样品D6、样品D7、样品D8，分别对应保存时间为1h、24h、48h、120h，保存温度是25℃，分别测定提取的核酸浓度。为进一步减少实验误差，每个实验进行两组平行重复实验。实验结果见表3、表4所示。

表3 4℃保存条件下实验组和对照组的核酸浓度测定(肾炎患者)(浓度单位：ng/μL)

表4 25℃保存条件下实验组和对照组的核酸浓度测定(肾炎患者)(浓度单位：ng/μL)

通过表3、表4可知，经过所述尿液中微生物核酸新型保存液处理的肾炎患者的尿液样品，在4℃、25℃条件下保存1h、24h、48h和120h，所得的核酸其浓度也较为稳定，样品的稳定性明显优于而未做任何处理的对照组样品，可见本发明所述的尿液中微生物核酸新型保存液能够较好的维持尿液中核酸的稳定性。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。