阅读说明：本技术 一种基于n端编码序列改造调控蛋白质表达的方法 (Method for modifying and regulating protein expression based on N-terminal coding sequence ) 是由 刘松 徐奎栋 李江华 陈坚 周景文 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法,属于基因工程及酶工程技术领域。本发明是以枯草芽孢杆菌为表达宿主,通过预测模型,评价N端编码区同义突变中,最有利于促进基因表达的核苷酸序列。通过结合超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的NCS的前十个氨基酸同义突变文库,测定文库中蛋白的荧光强度,选择172个代表性样本并测序鉴定,使用统计学方法建立预测模型。通过该模型优化融合了BlgS信号肽的普鲁兰酶,可使普鲁兰酶胞外酶活提高至改造前的2.67倍以及降低48％,从而为N端基因的从头设计提供理性改造的方向,有利于简易地调控基因的表达。(The invention discloses a method for modifying and regulating protein expression based on an N-terminal coding sequence, belonging to the technical field of genetic engineering and enzyme engineering. The invention uses bacillus subtilis as an expression host, and evaluates the nucleotide sequence which is most beneficial to promoting gene expression in the synonymous mutation of an N-terminal coding region through a prediction model. Fluorescence intensity of proteins in the library was determined by combining the first ten amino acid-synonymous mutation libraries of NCS of superfolder green fluorescent protein (sfGFP), selecting 172 representative samples and sequencing for identification, and using statistical methods to build a predictive model. The pullulanase fused with the BlgS signal peptide is optimized through the model, so that the extracellular enzyme activity of the pullulanase is improved to 2.67 times before modification and reduced by 48%, a rational modification direction is provided for de novo design of an N-terminal gene, and the expression of the gene is easily regulated.)

一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法

技术领域

本发明涉及一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

基因的突变对于改变蛋白的性质具有非常重要的意义，通常通过突变，可以从中找到性质更好的突变序列，从而提高蛋白的应用价值。基因的同义突变就是常用的一种突变手段，基因的同义突变可实现表达量相差巨大。

目前常用的方法：是通过构建同义突变文库，并结合高通量筛选策略，以期找到最佳突变体。然而这种方法耗时耗力，并且专一性强，无法用于指导其他基因的设计。尽管有的研究通过发现，合成一系列的短肽，有利于广泛提高基因的表达，然而这种方法会对酶活产生影响，由于这些促表达的短肽，占据了信号肽的位置，从而不适合于需要添加信号肽的胞外蛋白。

现有用于改善基因表达量的方法，往往都是通过非翻译区(5’UTR)的优化，然而当5’UTR模块已经足够强时，难以继续优化并显著提高表达量。而关于N端编码区(NCS)的研究较少。因此，建立一种适用于广泛基因设计的NCS改造策略非常重要。

发明内容

本发明的方法是基于对代表性样本的生物信息学分析而建立的，通过此方法，可从头设计任意基因的N端前30位碱基的核苷酸序列，对其进行同义突变。本模型的实施方案中，是通过突变引物，改变任意基因的NCS核苷酸序列为目的核苷酸序列所完成。本发明通过优化NCS的核苷酸序列，可用于指导任意基因的设计，并不需要添加额外的氨基酸序列，对蛋白质的性质降到最低。可极大的提高目的基因的表达水平。

本发明提供了一种筛选编码高表达量蛋白的核苷酸序列的方法，测定GC3和ΔG的值，再应用下述方程式计算蛋白的相对表达量，即P_sfGFP值：

P_sfGFP＝274497.657－108717.401×GC3+4886.529×ΔG。

在本发明的一种实施方式中，所述GC3为目的基因靠近ATG的N端编码区前9～10个氨基酸的同义密码子第三位碱基是GC的含量；所述ΔG为目的基因的任意启动子转录起始位点至N端编码区的第90～99bp区域间的mRNA二级结构的最小自由能。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为能够在枯草芽孢杆菌中表达的任意蛋白。

在本发明的一种实施方式中，P_sfGFP值与蛋白的实际表达量呈正相关。

在本发明的一种实施方式中，根据P_sfGFP值筛选相应的核苷酸序列。

本发明提供了一种调控基因工程菌蛋白表达量的方法，选取目的蛋白N端编码区的长度为27～30个核苷酸，建立同义突变库；计算同义突变库中的基因的GC3和ΔG参数，根据方程计算每个核苷酸序列的相对表达量，选择具有所需表达量的核苷酸序列，将目的蛋白N端编码区进行相应突变，并将其转化到宿主细胞中；

所述方程为：P_sfGFP＝274497.657－108717.401×GC3+4886.529×ΔG。

在本发明的一种实施方式中，所述GC3为目的基因靠近ATG的N端编码区前9～10个氨基酸的同义密码子第三位碱基是GC的含量。

在本发明的一种实施方式中，所述ΔG为目的基因的任意启动子转录起始位点至N端编码区的第90～99bp区域间的mRNA二级结构的最小自由能；

在本发明的一种实施方式中，蛋白表达量需要上调的时候，选择突变库中的P_sfGFP值处于前10％；蛋白表达量需要下调的时候，选择突变库中的P_sfGFP值处于后10％。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为能够在枯草芽孢杆菌中表达的任意蛋白。

本发明提供了一种调控普鲁兰酶表达量的方法，将选取普鲁兰酶N端编码区前27～30个核苷酸，进行同义突变，构建突变体库，并计算P_sfGFP值，根据P_sfGFP值选择相应的同义突变序列；将目的蛋白的N端编码区进行相应突变，连接至表达载体，构建重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，普鲁兰酶表达量需要上调的时候，选择突变库中的P_sfGFP值处于前10％。

在本发明的一种实施方式中，普鲁兰酶表达量需要下调的时候，选择突变库中的P_sfGFP值处于后10％。

在本发明的一种实施方式中，将重组质粒导入枯草芽孢杆菌，利用枯草芽孢杆菌生产蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶NCBI登录号为AMQ67157。

本发明还保护所述筛选编码高表达量蛋白的核苷酸序列的方法，或调控基因工程菌蛋白表达量的方法在调节目的蛋白表达量中的应用。

本发明还保护所述调控普鲁兰酶表达量的方法在调节普鲁兰酶中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过结合sfGFP、并对目的基因的N端编码区进行改造(同义突变)，探究出了一条用于指导蛋白做出定向改造、从而提高或降低目的蛋白表达的公式PsfGFP＝274497.657－108717.401×GC3+4886.529×ΔG。所算得的PsfGFP值与蛋白的实际表达量成正相关，根据此公式，计算出PsfGFP值即根据需要选择相应的同义突变序列。将其应用于改造融合了Bgls信号肽的核苷酸序列的普鲁兰酶N端，选择的同义突变序列可使胞外酶活上调2.67倍、以及下调48％。

附图说明

图1为sfGFP表达质粒P43-NMK-sfGFP图谱。

图2为sfGFP的NCS文库相对荧光强度情况图。

图3为172个样本的核苷酸序列指标和荧光值。

图4为改造前后相对荧光值分布图。

图5为融合BglS信号肽的普鲁兰酶表达质粒P43-NMK-Bgls图谱。

图6为BglS信号肽的5种NCS变体蛋白胶图。

图7为添加5种Bgls信号肽序列的普鲁兰酶的表达预测值与酶活测量值相关性图。

具体实施方式

1、培养基组成：

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；

发酵培养基(g/L)：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。

各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的0.17mol/L的KH₂PO₄、0.72mol/L的K₂HPO₄溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶在足量的水中，使终体积为100mL；0.22μm的滤膜过滤除菌)；

2、培养方法：

种子培养：挑取工程菌单菌落接入种子培养基中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养24h；

发酵培养：种子培养液按4％的接种量接入发酵培养基中，培养温度37℃，发酵24h

3、绿色荧光蛋白表达量及生物量测定

在96孔板中加入用PBS缓冲液(100mM和pH 7.2)稀释成合适浓度的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，绿色荧光激发波长：480nm,绿色荧光发射波长：520nm，细胞生长OD吸收波长：600nm。

一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

4、SDS-PAGE电泳检测

胶浓度为10％的

SDS-PAGE胶被用于分析蛋白的表达水平，以MES或MOPS缓冲液为电泳缓冲液，上样量为10μL。电泳电压为150V。具体样品制备及电泳操作依照试剂盒说明书进行。以MES缓冲液进行电泳时，标准蛋白的分子量(kDa)分别为：188，98，62，49，38，28，17，14，6和3；而以MOPS缓冲液进行电泳时，标准蛋白的分子量(kDa)分别为：191，97，64，51，39，28，19，14

5、普鲁兰酶酶活测定方式

将1mL 1g/100mL普鲁兰多糖底物和0.9mL 100mM pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液混合均匀，置于60℃水浴锅内预热10min，加入普鲁兰酶液0.1mL，反应10min后，加入3mL DNS显色液，然后于沸水浴中煮7min，置于冰水中终止显色反应，再加10mL去离子水，混匀，在540nm下测定吸光值。单位时间内生成1μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位。

实施例1：构建NCS同义突变文库

将PLytr启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)使用引物Lytr-F/Lytr-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示)和Lytr-F-plasmid/Lytr-R-plasmid(核苷酸序列如SEQ IDNO.4和5所示)通过一步克隆试剂盒连接至P43NMK质粒，构建得到质粒P43NMK-Lytr；

采用相同的手段，将sfGFP荧光蛋白报告基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)使用引物sfGFP-F/sfGFP-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示)和sfGFP-F-plasmid/sfGFP-R-plasmid(核苷酸序列如SEQ ID NO.9和10所示)，通过一步克隆试剂盒融合至PLytr的下游，得到构建P43NMK-Lytr_sfGFP，如图1所示；

以P43NMK-Lytr_sfGFP为模板，使用简并引物sfGFP-F-NCS/sfGFP-R-NCS(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和12所示)，获得sfGFP的N端前30位碱基发生同义突变的重组质粒，这些重组质粒构成了同义突变文库，使得sfGFP前30个碱基发生改变，但其编码的氨基酸序列保持不变。

实施例2：NCS同义突变文库的表征

将实施例1中构建得到的发生同义突变的重组质粒分别转化至表达宿主枯草芽孢杆菌WB600中，将转化后的单克隆接种至含有200μL LB种子培养基的96浅孔板，培养8小时；

接着，按照4mL/100mL的接种量接种至含有800μL TB培养基的96深孔板，培养24小时得到发酵液；

然后将发酵液迅速置于冰上冷冻，离心后，去除上清，用PBS缓冲液(100mM、pH7.2)稀释至合适倍数后，通过Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)测定荧光值(激发光480，吸收光520)以及OD₆₀₀。共表征了8598个单菌落，如图2。

实施例3：代表性样本的序列鉴定和发酵

实施例2中共表征8598个单克隆宿主细胞，定义荧光值/OD为相对荧光强度RFI，根据RFI值的高低，将单克隆细胞由高到低排序，每50个选择1个测序鉴定(即第1～50个菌株中选择一个，第51～100个菌株中选择一个，依此类推)，共测序鉴定了172个单克隆。

将172个经测序鉴定后的单克隆，接种至含有20mL种子培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm发酵8小时后至OD₆₀₀大于4，按照4mL/100mL的比例接种到含有25mL发酵培养基的250mL摇瓶中，发酵24小时后，测定sfGFP的荧光值和OD₆₀₀。每组实验设置3个平行。其结果如下图3。

实施例4：使用生物信息学工具对样本的核苷酸进行序列分析

使用CodonW、Nupack、RBS calculator创建11个不同的核苷酸序列指标以进行序列分析。

(1)使用CodonW计算GC、GC3、T3s、C3s、A3s、G3s、CAI、CBI、Fop

GC：目的基因的G+C含量；

GC3：同义密码子第三位碱基是GC的含量；

T3s、C3s、A3s、G3s：基因的N端前30位碱基发生同义突变后，第三个同义位置密码子分别是T、C、A、G的频率；

CAI：密码子偏好性；

CBI：密码子偏爱指数；

Fop：最佳密码子的频率(上述计算范围均是NCS突变的30个核苷酸序列)。

(2)使用Nupack计算ΔG

ΔG：最小自由能，其计算的范围包含转录起始位点至NCS下游的区域，在本实施例中选取ATG上游25个碱基处(PLytr启动子的转录起始位点)至ATG下游96碱基处；

(3)使用RBS calculator计算TIR

TIR：翻译起始率，范围同计算ΔG。

通过对172个样本中，以RFI作为因变量，11个核苷酸序列指标作为因变量进行分析，通过SPSS进行多元回归分析，方法采用逐步回归。

最终获得一条回归预测方程PsfGFP＝274497.657-108717.401×GC3+4886.529×ΔG，见表1。并用以指导基因的NCS改造，在对NCS进行改造时，通过计算相应参数带入公式，即能根据算出的值，选择蛋白表达量高的同义突变序列。

表1多元回归分析

将实施例3中的172个样本的序列代入所述回归预测方程，计算出预测值，并与实施例3中测定的实际荧光值进行比较，进行相关性分析，如图4所示，序列的预测值和测量荧光值之间的皮尔逊系数可达0.675，相关非常强，说明所述的回归预测方程可以用来预测蛋白荧光值。

实施例5：使用预测方程指导信号肽BglS基因的NCS改造

(1)P43NMK-Lytr-BglS野生型的构建

将BglS信号肽(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)融合在普鲁兰酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)的N端，实现了普鲁兰酶的胞外表达。具体方式为利用实施例相同的一步克隆法，将BglS信号肽克隆至P43NMK-Lytr中的PLytr的下游，构建得到P43NMK-Lytr-BglS，如图5。

(2)P43NMK-Lytr-BglS同义突变质粒的构建

为了进一步的提高普鲁兰酶的胞外酶活，优化了靠近ATG的BglS的NCS区：将BglS的前十个氨基酸所有的同义突变组合方式穷举出来，共有131072种可能；按照实施例4的方程进行计算，计算131072条序列每一条序列的GC3和ΔG以及理论值PsfGFP，并根据预测值，选择包括野生型在内的5种Bgls变体：NCS+，NCS+’，NCS-wt，NCS-’，NCS-。

NCS+代表P_sfGFP最大值变体；NCS+’代表P_sfGFP的最大值与野生型之间的中间值变体；NCS-wt代表野生型；NCS-代表P_sfGFP最小值变体，NCS-’代表介于P_sfGFP的最小值与野生型之间的中间值变体，其具有连续降低的预测表达强度。

利用与步骤(1)相同的方法，信号肽Bgls变体NCS+(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)、NCS+’(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)、NCS-’(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)、NCS-(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)，分别连接至克隆至P43NMK-Lytr中的PLytr的下游，分别得到含有BglS信号肽同义突变序列的质粒；再将得到的质粒转化至表达宿主枯草芽孢杆菌WB600中，将转化后的单克隆接种至含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃220rpm发酵8小时后，使得OD₆₀₀达到4以上，按照4mL/100mL的比例接种到含有25mL TB培养基的250mL摇瓶中，在37℃、250rpm发酵30小时后，测定普鲁兰酶的胞外酶活，结果如图7所示，发现其普鲁兰酶胞外酶活实现了预测的高中低5水平变化，并且与预测值有0.89的R²水平。

表2信号肽BglS的NCS突变体的预测及实际检测结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列

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cttgactctt ttgactatta accccgcaac ccgaaagaag caatataaag aacagtaaag 120

caataaattt tttcattttt ttcacctcat tatattttat cgtcaaccta ttttatattt 180

taaagaaaaa ttaagaaaca atgaaacttt tttttataaa aaacgactat tttaggattt 240

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gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgaga ggcgagggcg agggcgatgc caccaatggc 120

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gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcgc 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcagtttc 300

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<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, or t

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<400> 15

ccttatctga aacgagtgtt gctgcttctt cttgtcactg gattgtttat gagtttgttt 60

gcagtcactg ctactgcctc agct 84

<210> 16

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccttatctga agcgtgtatt actactgctt cttgtcactg gattgtttat gagtttgttt 60

gcagtcactg ctactgcctc agct 84

<210> 17

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccatatctga agcgagtctt actgcttctg cttgtcactg gattgtttat gagtttgttt 60

gcagtcactg ctactgcctc agct 84

<210> 18

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccgtacctca agcgcgtctt gctgctgctg cttgtcactg gattgtttat gagtttgttt 60

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