阅读说明：本技术 提取核酸的方法 (Method for extracting nucleic acid ) 是由 阿兰·劳伦 阿诺·布尔 阿里·拉尤恩 于 2019-03-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用例如基于二氧化硅的合适的固体载体提取核酸的方法。特别地,所述方法包括通过使样品与合适的固体载体接触来捕获核酸的步骤,其特征在于所述方法包括在捕获步骤之前用至少一种试剂处理样品以掩蔽样品的蛋白质和/或多糖的胺或羧酸官能团的步骤。(The present invention relates to a method for extracting nucleic acids using a suitable solid support, for example based on silica. In particular, the method comprises a step of capturing the nucleic acids by contacting the sample with a suitable solid support, characterized in that it comprises a step of treating the sample with at least one reagent to mask the amine or carboxylic acid functions of the proteins and/or polysaccharides of the sample, prior to the capturing step.)

提取核酸的方法

本发明涉及使用例如基于二氧化硅的合适的固体载体提取核酸的方法。特别地，所述方法包括通过使样品与合适的固体载体接触来捕获核酸的步骤，其特征在于所述方法包括在捕获步骤之前用至少一种试剂处理样品以掩蔽样品的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的步骤。

现有技术

分子生物学的兴起导致诊断学的巨大进步。从测试样品中，可以提取和检测属于样品中包含的宿主或传染性微生物的核酸。对这种遗传物质的检测或甚至定量，使得建立有关微生物感染或致癌基因存在的诊断成为可能。这通常按以下所述的三个步骤来完成：

1)从复杂的生物样品(血液、肿瘤、食物等)中提取核酸，其包括对细胞的化学裂解或机械裂解，以释放细胞内容物，特别是核酸。如果它们的量不足以进行直接检测，则将其选择性纯化并随后扩增。

2)通过DNA扩增技术NASBA、RT-PCR、PCR等扩增经纯化的核酸。当从生物样品中收集到的核酸量非常低或测试的灵敏度不足以进行直接检测时，该步骤是必需的。

3)通过称为终点、实时、测序等技术来检测扩增的核酸。根据所使用的检测技术，该步骤使得能够选择性地定量所测试的目标核酸。

为了灵敏且特异性地检测核酸，特别是为了尽可能准确地进行诊断，以有效的方式从细胞中提取和/或分离核酸(DNA和RNA)显得至关重要。该提取和/或纯化步骤通常是至关重要的，因为该第一步将决定获得诊断测试最终结果的一系列事件的质量。因此，必须具有尽可能特异性和有效(在量、纯度和时间上)的核酸提取方法，以免丢失可能导致误诊并对患者致命的信息。

已经开发出许多技术来尝试从不同的生物样品中提取核酸。最初的方法涉及许多步骤，通常包括富集含有核酸的细胞，裂解这些细胞，分离和除去蛋白质、膜和其他细胞组分，以及通过在有机溶剂中沉淀来纯化剩余的核酸。这些技术昂贵、费时并且常常无法自动化。因此，它们不再适合于需要自动化以快速获得结果并避免污染和人为错误的当前实践，特别是在威胁患者生存的败血症“血液感染”的情况下。

最新的核酸提取技术使用固相，其中将细胞在特定的反应条件下裂解，并且使释放的核酸与固相结合。在现有技术中众所周知的，当前的核酸提取技术经常用固相，例如涂覆二氧化硅的颗粒。在一定的盐浓度和pH条件下，二氧化硅具有可逆吸附核酸的性质，这使其成为用于该目的的非常合适的材料。这些技术例如在“Rapid and simple method forpurification of nucleic acids”，Boom，Journal of Clinical Microbiology，1990年第495页或在相同作者的美国专利第5234809号中描述。

还已知使用涂覆二氧化硅的磁性颗粒。颗粒的磁性部分最常用于促进和自动化核酸的捕获、洗涤和洗脱步骤，因为简单的磁体能够使试管中的颗粒移位并收集上清液以进行洗涤步骤。核酸的提取收率显著提高。这些技术在"Magnetic Partials for theSeparation and Purification of Nucleic Acids",S.Berensmeier,Applied MicrobialBiotechnology 2006 73 495-504；"The use of magnetic nanoparticles in thedevelopment of new molecular detection systems",I.J.Bruce,Journal ofNanosciences and Nanotechnology(2006),6(8)2302-2311页；和"Optimization ofinfluencing factors of nucleic acid adsorption onto silica-coated magneticparticles:Application to viral nucleic acid extraction from serum",Ning Sun等人,Journal of Chromatography A,2014,1325,31-39中有详细描述。

本公开旨在提供用于提取核酸的方法，其满足以下一个或多于一个标准：

1)实施简单，

2)可以在不同来源的生物样品上实施，

3)该方法在基本上是水性的介质中实施，

4)提取收率良好，

5)提取后的核酸纯度水平高，

6)自动化的可能性，

7)DNA的质量足以用于扩增和/或检测目标序列的步骤，特别是在体外诊断测试的情况下，和/或

8)更好的检测灵敏度，并且结果更可靠。

本公开涉及从包含蛋白质和/或多糖的样品中提取核酸的方法，所述方法包括通过使样品与合适的固体载体接触来捕获核酸的步骤，其特征在于所述方法包括在捕获步骤之前用至少一种试剂处理样品以掩蔽样品的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的步骤。在一个具体的实施方案中，用于掩蔽胺官能团的试剂选自酰化剂或烷基化剂。例如，掩蔽剂选自下式(I)的酰化剂：

其中R为有机基团、有机氧基或有机氨基，

LG是选自卤素、有机氧基和有机氨基的离去基团。

更具体地，掩蔽剂可以是选自活化的酯、酰卤、氯甲酸酯、酸酐、活化的碳酸酯和羰基二咪唑的酰化剂。在另一个实施方案中，掩蔽剂是选自乙酸酐、丙酸酐、异丁酸酐、丁酸酐或苯甲酸酐的酸酐。

在另一个实施方案中，掩蔽剂是选自卤代烷、重氮化合物和醛的烷基化剂。

在另一个实施方案中，掩蔽剂选自胺、醇和硫醇，与偶联剂组合使用，用于掩蔽蛋白质的羧酸官能团。可以举出碳二亚胺作为偶联剂的实例，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或二环己基碳二亚胺(DCC)。

在可以与上述实施方案结合的一个特定实施方案中，从生物样品中提取核酸的方法包括以下步骤：

a.裂解细胞，例如通过使生物样品与裂解缓冲液接触，

b.用掩蔽样品的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的试剂处理裂解物，

c.通过使经处理的裂解物与合适的固体载体，例如基于二氧化硅的载体接触来捕获核酸，

d.在适当的情况下，用洗涤缓冲液洗涤载体，以及

e.在适当的情况下，洗脱核酸。

通常，在以上定义的方法中，固体载体可以由二氧化硅颗粒，特别是磁性二氧化硅颗粒组成。

在可以与以上实施方案组合的一个特定实施方案中，生物样品是血液、血浆或血清的样品。

在可以与以上实施方案组合的一个特定实施方案中，捕获步骤在离散剂的存在下进行。

在可以与以上实施方案结合的一个特定实施方案中，提取方法不包括使用蛋白酶除去蛋白质。

在可以与以上实施方案结合的一个特定实施方案中，在核酸捕获步骤之前或期间不添加有机溶剂。有利地，在核酸捕获步骤之前或期间，每100μL样品添加小于50μL，优选小于10μL，甚至更优选小于1μL的有机溶剂。

在可以与以上实施方案组合的一个特定实施方案中，该方法包括检测目标核酸的额外步骤，特别是通过扩增所提取的核酸来进行。

本公开还涉及核酸提取试剂盒，其至少包含：

i.如上所定义的用于掩蔽蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的试剂，ii.用于提取核酸的合适的固体载体，例如基于二氧化硅的固体载体，

iii.在适当的情况下，用于使用试剂掩蔽胺和/或羧酸官能团的反应的催化剂，

iv.在适当的情况下，偶联剂。

本公开还涉及试剂用于掩蔽如上定义的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团以用于核酸酶抑制的用途。例如，待抑制的核酸酶包含在通过裂解生物样品获得的裂解物中，例如用于扩增或检测样品中的核酸。

定义

“提取”应理解为指从任何样品中分离核酸的技术，例如从真核细胞、原核细胞、人动物细胞、微生物细胞或组织细胞中分离DNA和/或RNA。因此，在本发明的意义上，从生物样品中提取通常包括细胞裂解和从裂解物中纯化核酸。

纯化本身包括在合适的固体载体，优选基于二氧化硅的固体载体上捕获核酸并洗涤，然后可能洗脱核酸。捕获包括将核酸吸附在固体载体上，在发生洗脱的情况下，包括从固体载体中解吸或释放核酸。

“样品”应理解为指至少包含核酸和抑制核酸提取的试剂的任何类型的样品，例如蛋白质和/或多糖。样品可以具有多种来源，例如饮食来源、环境来源、人类来源、兽医来源或化妆品来源的样品。所有这些样品，如果不是液体，则将它们预处理为液体形式。因此，在提取过程中使用的样品为液体形式。优选地，在提取过程中使用的样品是未固定的样品。“未固定的样品”应理解为指未经处理以其原始状态保存的样品。样品的固定是本领域技术人员众所周知的技术，其可以例如用醛如甲醛或戊二醛进行。

饮食来源的样品的实例包括但不限于牛奶产品(酸奶、奶酪等)、肉、鱼、蛋、水果、蔬菜、饮料(牛奶、果汁、苏打水等)的样品。当然，这些饮食来源的样品也可能来自调味酱或更精致的菜肴，或者来自未加工或部分加工的原料。饮食样品也可能来自动物饲料，例如饲料饼、肉和骨粉。

如上所述，样品可以是环境来源的样品，并且可以包括例如表面采样、水采样等的样品。

样品还可以包含人类或动物来源的生物样品，其可能对应于来自生物体液(尿、全血或衍生物，例如血清或血浆、痰或唾液、脓、脑脊髓液等)、粪便(例如霍乱样腹泻)的样品，来自鼻、喉咙、皮肤、伤口、器官、分离的组织或细胞、拭子标本、支气管肺泡灌洗液或标本、活体标本检查的样品。该列表显然不是详尽的。

术语“样品”通常指从一个或多于一个实体收集用于分析的一部分或量，更特别是一小部分或少量。该样品可能已经经过预处理，包括例如混合、稀释或压碎的步骤，特别是如果初始实体为固态时。

通常，分析后的样品可能含有-或怀疑其含有-至少一些代表微生物存在、代表患者病症(例如免疫抑制、怀孕等)或代表待检测、表征或监测的疾病的核酸。

在一个特定的实施方案中，样品包含等电点小于8或甚至小于7的蛋白质。特别地，在一个特别具体的实施方案中，样品包含以下蛋白质中的至少一种：人血清白蛋白(HSA)、纤维蛋白原、免疫球蛋白，特别是IgG和血红蛋白。

“微生物”应理解为指细菌、真菌、酵母、原生动物或病毒中的一些或全部。

“核酸”应理解为指所有类型的DNA或RNA：单链或双链形式的基因组DNA、互补DNA、信使RNA、互补RNA、转移RNA、线粒体RNA、叶绿体DNA、核糖体RNA、质粒DNA、病毒DNA或RNA、微RNA、snoRNA、siRNA、RNAi。

“蛋白质”应理解为指包含至少一个多肽链的任何分子，其特征在于通过肽键连接在一起的氨基酸残基序列。这特别包括由翻译后或其他修饰产生的肽和多肽以及任何经修饰的多肽或其衍生物、它们的降解产物，特别是通过酶促降解的产物、脂蛋白等。

“合适的固体载体”应理解为指能够参与从生物样品中提取核酸的任何载体。在一个优选的实施方案中，它是包含或组成为磁性或非磁性的二氧化硅或其衍生物(硅酸盐、玻璃、经有机基团改性的二氧化硅等)中的一种的载体，其能够参与从生物样品中提取核酸。它还可以是基于纸、纤维素或纯磁铁矿或其他已知用于核酸提取的聚合物的载体。它可以至少是平面载体、中空载体、晶片、针、膜、板、片、锥、管、纤维、珠、颗粒等。固体载体优选为珠或颗粒或膜。固体载体优选是磁性的。

在从生物样品中提取核酸的方法的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：

a)裂解细胞，例如通过将生物样品与裂解缓冲液接触，

b)用掩蔽裂解物的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的试剂处理裂解物，

c)通过将经处理的裂解物与合适的固体载体接触来捕获核酸，

d)在适当的情况下，用洗涤缓冲液洗涤载体并洗脱核酸。

有利地，在步骤b)之后紧接步骤c)，换句话说，在步骤b)和c)之间没有中间步骤，例如没有使被掩蔽的官能团脱保护的步骤。在一个具体的实施方案中，用于提取核酸的方法不包括使被掩蔽的胺和/或羧酸官能团脱保护的步骤。

本公开还涉及试剂在使用合适的固体载体从生物样品中提取核酸的方法中用于掩蔽蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的用途。

在下面更详细地描述该方法的步骤。

裂解步骤

裂解步骤包括破裂样品细胞(细胞壁和细胞膜)以释放核酸。裂解的方法有几种：特别是可以列举机械裂解(例如用珠和/或研磨材料)、化学裂解或酶裂解或通过热激裂解。

在一个特定的实施方案中，通过使样品与裂解缓冲液接触来化学裂解细胞。裂解缓冲液必须有效地破裂细胞膜，并且足够温和以避免降解核酸。

裂解缓冲液可以包含例如洗涤剂，在适当的情况下，包含螯合剂。通常使用合适的缓冲液，例如Tris HCl，任选浓度为10mM至100mM，将pH值保持在4至8，例如6至8。

洗涤剂可以选自吐温、Triton、SDS和通常以0.05％至20％的浓度使用的其他洗涤剂。

任选地，裂解缓冲液包含用于灭活核酸酶和/或用于去除蛋白质，例如蛋白酶，如蛋白酶K的试剂。还可以使用其他酶，例如裂解酶(水解酶、消解酶等)以消化酵母和真菌的壁。

在一个具体实施方案中，裂解缓冲液不包含用于去除蛋白质，特别是蛋白酶的试剂。实际上，发明人已经表明根据本公开的提取方法中使用的用于掩蔽胺和/或羧基官能团的试剂还有利地能够抑制可能已经释放到裂解物中的核酸酶的酶活性。

在一个具体实施方案中，裂解缓冲液还包含离散剂。离散剂干扰弱的(非共价)分子内相互作用，例如氢键、范德华力和疏水力。在离散剂中，可以列举尿素、胍盐，如盐酸胍或硫氰酸胍、和高氯酸锂。它们通常以1M至6M的浓度使用，特别是对于GuSCN和GuHCl。

在另一个具体实施方案中，裂解缓冲液不包含离散剂。

还可以添加螯合剂，例如5mM至50mM的EDTA或类似化合物，和/或还原性化合物，例如浓度为0.5mM至100mM的DTT(二硫苏糖醇)或TCEP(三羧乙基膦)或β-巯基乙醇。

裂解缓冲液还可以包含有机溶剂，例如醇(乙醇、异丙醇等)。然而，在一个优选的实施方案中，裂解缓冲液不包含有机溶剂。

当优化裂解缓冲液时必须考虑样品的化学特性。例如，样品(例如一些土壤样品)的酸度可能破坏核酸，因此可以中和以确保核酸的适宜产量。将样品与裂解缓冲液接触足够的时间，例如0分钟至15分钟，以使细胞裂解而不会损坏核酸。

用掩蔽剂处理样品或裂解液

根据本公开的用于提取核酸的方法的基本特征涉及用掩蔽样品的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的试剂处理裂解物的步骤。该处理步骤可以在裂解步骤之后通过将掩蔽剂添加到裂解物中来进行。或者，掩蔽剂直接包含在裂解缓冲液中，样品的裂解和处理同时进行。目的是中和蛋白质和/或多糖的带电官能团，其可能影响通过固体载体，优选基于二氧化硅的固体载体的提取收率。实际上，在以下实施例中，发明人已经证明了在使用固体载体，例如二氧化硅涂覆的颗粒的提取方法中，生物分子对提取收率的影响，特别是对生物样品的蛋白质和/或多糖的影响。蛋白质和/或多糖可以特别通过其带电官能团，特别是其胺和/或羧酸官能团与二氧化硅珠和/或核酸相互作用。

发明人于是想到了使用试剂来掩蔽这些带电官能团，特别是蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团，以阻断生物分子的这种抑制作用。因此，“掩蔽剂”应理解为指能够与生物样品的裂解物中存在的蛋白质和/或多糖的至少某些胺和/或羧酸官能团反应(优选不可逆地反应)，以改变这些蛋白质和/或多糖的极性、等电点和/或电荷性质的任何化合物。用掩蔽剂处理使得可以掩蔽带电官能团，特别是蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团。然而，在一个具体的实施方案中，核酸没有被掩蔽剂改性。可以选择反应条件，特别是掩蔽剂的浓度以使核酸在掩蔽步骤中不被改性。在一种具体的实施方案中，当存在掩蔽剂或偶联剂时，其浓度为0.01M至1.8M，例如0.1M至1.0M，例如0.2M至0.6M。

在一个具体的实施方案中，在根据本公开的用于提取核酸的方法的整个过程中，改性的蛋白质和/或多糖的被掩蔽的胺和/或羧酸官能团保持被掩蔽。在这种情况下，用于提取核酸的方法不包括使被掩蔽的胺和/或羧酸官能团脱保护的步骤。

在一个具体的实施方案中，掩蔽剂选自酰化剂或烷基化剂，其能够掩蔽蛋白质或多糖的胺官能团。优选地，酰化剂或烷基化剂必须能够掩蔽水性介质中蛋白质或多糖的胺官能团。

通常，在用于提取核酸的方法中可以用作掩蔽剂的酰化剂具有下式(I)：

其中，

R是有机基团、有机氧基或有机氨基；

LG是离去基团。

“离去基团”应理解为指在酰化反应期间从结合它的碳原子上脱去的原子或基团。

在一个实施方案中，LG是选自卤素、有机氧基和有机氨基的离去基团。

在一个特定的实施方案中，掩蔽剂可以是选自活化的酯、酰卤、氯甲酸酯、酸酐、活化的碳酸酯和羰基二咪唑的酰化剂。在活化的酯中，可以提及四氟苯基乙酸酯或五氟苯基乙酸酯、硝基苯乙酸酯、五氟苯基三氟乙酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。在酰卤中，可以提及酰氯，例如乙酰氯、丙酰氯、异丁酰氯、丁酰氯或苯甲酰氯。在氯甲酸酯中，可以提及9-芴基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl)。在酸酐中，可以提及乙酸酐、丙酸酐、异丁酸酐、丁酸酐、苯甲酸酐、马来酸酐、琥珀酸酐或邻苯二甲酸酐。在活化的碳酸酯中，可以提及二碳酸二叔丁酯(Boc₂O)。

在一个特别优选的实施方案中，掩蔽剂是乙酸酐或其干燥形式、N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。

在另一个具体的实施方案中，烷基化剂可以选自卤代烷、硫酸芳酯、芳基重氮甲基、三氮烯和醛。在卤代烷中，可以提及碘甲烷、碘乙烷或碘丙烷、或溴甲烷。在芳基重氮甲基化合物中，可以提及甲基重氮吡啶(WO2010012949A1)。在醛中，可以提及甲醛和乙醛。

在一个实施方案中，酰化剂或烷基化剂与本领域技术人员已知的催化剂组合使用。在用乙酸酐进行酰化的情况下，例如可以使用4-二甲基氨基吡啶(DMAP)作为催化剂。

在另一个实施方案中，使用的试剂选自胺、醇和硫醇，与偶联剂组合使用，用于掩蔽蛋白质和/或多糖的羧酸官能团。偶联剂用于通过形成活化的酯来活化蛋白质和/或多糖的羧酸官能团。然后，这些活化的酯将与选自胺、醇和硫醇的亲核试剂反应。亲核试剂可以存在于蛋白质和/或多糖(蛋白质和/或多糖的氨基酸的胺、醇或硫醇)上或培养基中，如亲核缓冲液，例如Tris的情况。

偶联剂可以例如选自碳二亚胺，其中可以列举1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和二环己基碳二亚胺(DCC)。碳二亚胺可以与其他试剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺和***组合使用，其中可以列举1-羟基苯并***(HOBt)和1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)。

为了在蛋白质的反应性残基(桥接化合物，例如双醛、双-N-羟基琥珀酰亚胺酯、双酰氯及其衍生物)之间建立桥梁，掩蔽剂还可以被双官能化或多官能化。

例如，可以以0.01M至1.8M，例如0.1M至1.0M，例如0.2至0.6M的浓度使用酰化剂，例如乙酸酐。用于处理样品的掩蔽剂的浓度可以根据样品中蛋白质和/或多糖的浓度、使用的掩蔽剂、样品的来源以及使用的裂解条件进行调整。可以选择酰化剂的浓度，以使其与蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团反应而不与核酸反应。

在存在掩蔽剂的情况下，裂解物或裂解和处理步骤同时进行时被裂解的样品的孵育时间通常为1秒至30分钟，但优选小于10分钟。

在一个实施方案中，例如用氢氧化钠(NaOH)进行控制经处理的裂解物的酸度的步骤，特别是为了获得pH优选为5至7的经处理的裂解物。在该步骤中添加的氢氧化钠的量很低，因此该步骤只能在捕获步骤之前控制pH，而不是对蛋白质和/或多糖的掩蔽的胺和/或羧酸官能团进行脱保护的步骤。该控制经处理的裂解物的酸度的步骤是任选的；在一个特定实施方案中，不存在该步骤。

在处理步骤结束时，获得包含改性的蛋白质和/或多糖的经处理的裂解物。特别地，蛋白质和/或多糖的至少一部分胺和/或羧酸官能团在处理后被掩蔽；优选地，核酸不被掩蔽剂改性。

捕获

捕获步骤包括在允许核酸吸附的条件下将经处理的裂解物置于固体载体，例如基于二氧化硅的固体载体的存在下(核酸的固相提取)。基于二氧化硅的载体，例如二氧化硅珠或颗粒使得可以将通过吸附在二氧化硅上而保留的核酸与其他细胞污染物(膜、用掩蔽剂处理的蛋白质等)分离。有利的是，在捕获步骤中不使用抗体。

在一个具体的实施方案中，在用掩蔽剂处理样品或裂解物的步骤之后直接进行捕获步骤。在这种情况下，在掩蔽步骤和捕获步骤之间没有中间步骤。特别地，在掩蔽步骤和捕获步骤之间或在捕获步骤期间，没有使被掩蔽的胺和/或羧酸官能团脱保护的步骤。优选地，在捕获步骤期间，样品包含改性的蛋白质和/或多糖(即被掩蔽剂掩蔽)和未改性的核酸(即未被掩蔽剂掩蔽)。

在一个具体的实施方案中，将足够量的二氧化硅珠或颗粒添加到经处理的裂解物中。在具有二氧化硅珠的该实施方案中，优选地，能够吸附核酸的条件包括存在离散剂，例如pH 4至pH 8，例如借助于有机化合物，例如TRIS(三(羟乙基)氨基甲烷)盐、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或MES(吗啉代乙烷磺酸)的盐的缓冲介质中的盐酸胍或硫氰酸胍。

还可以添加洗涤剂，优选Triton X100或其类似物中的一种(Tergitol、吐温、Brij、Nonidet、Ecosurf等)。在另一个实施方案中，所述洗涤剂包含在裂解缓冲液中。基于二氧化硅的载体优选在pH 5.0至pH 8.0下带负电荷。

在一个特定的实施方案中，在通过在固体载体上吸附的捕获步骤期间，不使用离散剂或醇。然后将使用合适的载体，特别是氨基载体。

作为可用于捕获步骤的二氧化硅珠或颗粒的实例，可以列举包含在以下试剂盒中的颗粒：NucliSENS easyMAG Magnetic Silica(BioMerieux)、Film Array(BioMérieux/Biofire Diagnostic)、Qiasymphony kits(Qiagen)和Magnapure Kits(Roche)。

在另一个实施方案中，基于二氧化硅的固体载体是具有二氧化硅膜的提取柱。例如，可以列举以Purelink Genomic DNA Extraction Kit(Invitrogen)和DNeasy Bloodand Tissue Kit(Quiagen)的名称出售的试剂盒。将经处理的裂解物用二氧化硅膜沉淀在柱上，然后离心，使裂解物通过柱。核酸保留在柱上，蛋白质、多糖和其他细胞碎片通过柱。

其他基于二氧化硅的载体及其在核酸提取中的用途在以下文章中特别描述：Cady等人,Nucleic acid purification using micro fabricated siliconstructures.Biosensors and Bioelectronics 19,59-66(2003)；A.Melzak,C.S.Sherwood,R.F.B.Tumer,C.A.Haynes,Driving Forces for DNA Adsorption toSilica in Perchlorate Solutions.J Colloid and Interface Science 181,635-64(1996)；Tian等人,Evaluation of Silica Resins for Direct and EfficientExtraction of DNA from Complex Biological Matrices in a Miniaturized Format,Analytical Biochemistry283,175-191(2000)；Wolfe等人,Toward a microchip-basedsolid-phase extraction method for isolation of nucleic acids.Electrophoresis23,727-733(2002)。

在另一个实施方案中，使用磁性二氧化硅颗粒。磁性二氧化硅颗粒可以在洗涤步骤中以及在捕获后适当的洗脱步骤中被磁体保留。对于提取过程的自动化，该实施方案是特别优选的。可用的磁性颗粒的实例包括以NucliSENS easyMAG Magnetic Silica(BioMérieux)名称出售的试剂盒。

在一个特定的实施方案中，用于从包含蛋白质和/或多糖的未固定的样品中提取核酸的方法包括通过使未固定的样品与合适的固体载体接触来捕获核酸的步骤，其特征在于所述方法包括在捕获步骤之前用至少一种试剂处理样品以掩蔽样品的蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的步骤，并且在用掩蔽剂处理样品的步骤之后直接进行捕获步骤。

洗涤和洗脱

在捕获步骤之后，可以在洗涤缓冲液的存在下进行一个或多于一个洗涤步骤，从而能够除去污染元素而不从载体上脱去核酸。例如，洗涤步骤可以包括在合适的洗涤缓冲液，例如可能包含醇的低盐溶液中洗涤的步骤，和/或在醇的存在下洗涤以除去盐的步骤。在本发明的一个优选实施方案中，进行至少一个洗涤步骤。

如有必要，然后可以进行洗脱步骤。洗脱步骤包括释放保留在固体载体上的核酸。通常，使用具有例如pH 8至10的碱性pH和例如Tris或硼酸盐缓冲液的低离子强度的缓冲液。或者，在捕获和洗涤步骤之后直接进行检测或扩增步骤。该检测和/或扩增直接在捕获了经纯化的核酸的合适固体载体上进行，无需事先进行洗脱步骤。优选地，这是在珠或颗粒或膜上完成的，更优选是在可能为磁性或不为磁性的颗粒上完成的。

通过上述方法(有或没有洗脱步骤)纯化的核酸可以特别用于扩增和体外检测。

扩增和/或检测的其他步骤

本发明特别适用于制备核酸，以用于(在体外检测测试中)检测样品中的目标核酸，特别是在扩增目标核酸之后。

因此，本发明涉及一种用于检测生物样品中目标核酸序列的方法，所述方法包括：

(i)从可能含有目标核酸序列的生物样品中提取核酸，

(ii)检测提取的核酸中的核酸序列。

根据一个特定的实施方案，检测步骤(ii)包括扩增目标核酸序列的步骤。

因此，本发明还涉及一种用于扩增核酸的方法，其包括：(i)实施如上所述的在合适的载体上提取核酸的方法，和(ii)使用DNA聚合酶的核酸扩增步骤。

本方法的一个优点是扩增步骤可以紧接在捕获步骤之后进行。由于核酸没有被掩蔽剂改性，因此在进行扩增之前不必使核酸脱保护。

在一个具体的实施方案中，使用DNA聚合酶，例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、T7聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段和/或逆转录酶或任何其他聚合酶进行扩增方法。

在可以与前述实施方案组合的另一个实施方案中，扩增方法是本领域技术人员众所周知的聚合酶链反应(PCR)扩增。PCR方案包括20个至40个循环，例如每个循环至少包括(i)在通常为90℃至95℃的温度下使待扩增的DNA变性的阶段，(ii)在通常为55℃至65℃的温度下用待扩增的DNA杂交引物的阶段，和(iii)在通常为68℃至75℃的温度下的延伸阶段。

还可以实施通过PCR的核酸扩增方法的变体。特别地，可以列举巢式PCR、定量PCR(或qPCR)、半定量或实时PCR、易错PCR或逆转录PCR(RT-PCR)。还可以实施其他扩增技术，例如LAMP、NASBA、TMA、RPA、LCR、RCR、3SR、RCA、SDA，或本领域技术人员已知的任何核酸扩增技术。

核酸提取试剂盒

本发明还涉及核酸提取试剂盒或套装，其至少包含：

i.如前文所述的用于掩蔽蛋白质和/或多糖的胺和/或羧酸官能团的试剂，例如酰化剂，优选乙酸酐或其干燥形式、N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯，

ii.适用于提取核酸的固体载体，

iii.在适当的情况下，用于使用试剂掩蔽胺和/或羧酸官能团的反应的催化剂，和/或

iv.在适当的情况下，偶联剂。

提取试剂盒还可包含缓冲液、控制元件和/或使用说明。

在一个具体的实施方案中，提取试剂盒不包含使被掩蔽的胺和/或羧酸官能团脱保护的试剂。

在一个具体的实施方案中，提取试剂盒不包含有机溶剂。

在另一个具体的实施方案中，试剂盒可以包含以下要素：

i.偶联剂，例如EDC，

ii.适用于提取核酸的基于二氧化硅的固体载体，例如二氧化硅珠，特别是磁性二氧化硅珠，以及至少一种以下任选要素：

iii.包含Tris或其他亲核缓冲液的裂解缓冲液，

iv.一种或多于一种洗涤缓冲液，和/或

v.任选的洗脱缓冲液，

vi.任选的催化剂。

在一个特定的实施方案中，试剂盒包含具有二氧化硅膜的柱作为基于二氧化硅的固体载体。

这些试剂盒特别适用于实施前文中所述的提取方法。借助于以下详述的实施例并参考附图将更好地理解根据本公开的方法。

附图说明

图1：在离散条件下通过某些蛋白质抑制固体载体上的DNA捕获。

图2：在离散条件下通过某些多糖抑制固体载体上的DNA捕获。

图3：通过模型单官能聚合物抑制固体载体上的DNA捕获。

图4：A.使用easyMAG提取试剂盒(BioMérieux)提取血液样品中包含的核酸，并用乙酸酐(Ac₂O)或乙酸(AcOH)进行裂解液的预处理(在3M GuHCl+1％Triton中捕获并用乙醇洗涤)。B.通过色谱分析测量核酸的量。

图5：HPLC分析DNA和RNA混合物的提取洗脱液，DNA和RNA混合物经受或不经受乙酸酐处理。上图：在乙酸酐存在下从提取的10μg DNA和RNA和5.2mg蛋白质的混合物获得的洗脱液。下图：从提取的10μg DNA和RNA的混合物获得的洗脱液。

图6：通过PCR实时扩增的血液中的CMV病毒核酸的荧光检测(RFU)曲线。图6的曲线分别对应于在没有生物基质(三角形)、没有经过乙酸酐处理的生物基质(X形)和在经过乙酸酐处理的生物基质(圆形)提取后进行的对照扩增。

图7：在提取前用或不用乙酸酐Ac₂O处理的血液中的CMV病毒检测的灵敏度(Ct)。左：Tris HCl中10e4个拷贝的CMV；中：血液中10e4个拷贝的CMV；右：血液+Ac₂O中10e4个拷贝的CMV。

图8：在人血清白蛋白和血红蛋白的混合物的存在下，在用或不用Ac₂O处理的情况下，在具有二氧化硅膜的柱上提取DNA。左(深灰色)：不用Ac₂O处理；右(浅灰色)：用Ac₂O处理。

图9：对应于完整的寡核苷酸(A)、在核酸酶P1的存在下并因此降解的相同的寡核苷酸(B)、和在核酸酶P1和乙酸酐的存在下由于核酸酶的酰化显示出更好的寡核苷酸稳定性的相同的寡核苷酸(C)的色谱图。

实施例

一般条件

以下描述了用于以下实施例的化合物的一般分析条件：

使用配备PDA 996光电二极管阵列检测器(Waters)、ZQ 2000质谱检测器(Waters)和Empower软件版本2的WATERS Alliance 2795HPLC系统进行LC-MS分析。ZQ 2000质谱仪具有电喷雾电离源。电离以正离子模式进行，锥电压为20V，毛细管电压为3.5kV。

HPLC分析所用的条件如下(条件A和B)：

实施例1a：证明血液中蛋白质化合物对在固体载体上捕获核酸的抑制作用(pH 7下使用磁性二氧化硅颗粒)

为了尝试改善基于二氧化硅的固体载体上的核酸提取的性能，发明人假设第一步是尝试增加捕获步骤的性能。

为证明血液中最具代表性的化合物对捕获步骤中核酸提取的抑制作用，制备了在4M GuHCl、50mM Tris中含23μg核酸(鲑鱼***DNA 20Kb)的200μl溶液，pH为7。

如在核酸提取条件下发生的，在离散条件下将越来越多的蛋白质添加至该混合物中(0μg至300μg)以模拟细胞裂解液。

对于每个实验，添加磁性二氧化硅颗粒(50μl，在水中为20mg/ml，1mg，easyMAG，bioMérieux，法国)，搅拌3分钟后，通过UV光谱法测量在260nm处DNA的残留量。已知引入的核酸量和吸附的量会容易地计算出吸附在颗粒上的DNA量，从而计算捕获收率。每次对DNA和蛋白质的溶液进行阴性对照。相对于没有抑制剂的参照将曲线归一化。

在图1中可以看出一旦添加了几微克的蛋白质，DNA捕获便会急剧减少，直到例如在添加了一百微克的HSA(人血清白蛋白)的情况下，完全被抑制。

抑制作用似乎部分与蛋白质的等电点相关；按照抑制顺序，人血清白蛋白(HSA)、血纤蛋白原、血红蛋白和免疫球蛋白、溶菌酶的等电点分别为4.8、5.8、7和11.3。生物分子酸性越强，它们与DNA捕获的竞争越多。然而应注意，尽管酸基团最具竞争性，但胺基团也具有竞争性(关于该主题的更多信息，参见实施例2)。

因此，该实施例证明了血液中的化合物，更特别是带负电荷和正电荷的蛋白质化合物对核酸的提取收率的抑制作用。可以看到，最具竞争性的化合物是血液中大量存在的化合物(人血清白蛋白、血纤蛋白原、免疫球蛋白和血红蛋白)。

实施例1b：证明多糖化合物对在固体载体上捕获核酸的抑制作用(pH 7下使用磁性二氧化硅颗粒)

用其他化合物例如带正电荷或带负电荷的多糖代替蛋白质进行实施例1a的实验。再次证明了多糖对核酸提取收率的抑制作用(参见图2)。

实施例2：蛋白质的电荷和化学组成对在固体载体上捕获核酸的抑制作用

为了更好地理解抑制在固体载体上核酸捕获的现象，进行了与实施例1中描述的相同的实验，但是使用多元羧酸、多元胺或多元醇的模型化合物代替了相应的蛋白质(图3)。可以非常清楚地看到，多元羧酸比多元胺更具抑制作用，而多元胺则比多元醇或中性化合物更具抑制作用。

需要约10μg的这些化合物将DNA的捕获抑制50％。这与先前在实施例1中的蛋白质或在实施例1b中的多糖中所观察到的一致。

因此，蛋白质和多糖的胺和羧酸官能团对生物样品中核酸捕获的抑制作用绝对非常明显：例如，血液样品可包含200mg/ml至500mg/ml的蛋白质。因此，在从200ml血液中提取核酸的实际条件下，样品可包含至少40mg至100mg“抑制”核酸捕获的化合物。

实施例3：高蛋白浓度对核酸提取、DNA洗脱收率和提取的DNA纯度的抑制作用(pH7下使用磁性二氧化硅颗粒)

尽管在上个实施例的条件下蛋白质的竞争作用已经非常明显，但是这些条件远低于200μl血液实际提供的蛋白质量(约50mg)。为了更接近现实，发明人进行了另一个实验，其中这次是将相当于5mg的蛋白质(免疫球蛋白、HAS和血红蛋白的混合物，其浓度与实际血液样品中的浓度相似)添加或不添加到200μl裂解溶液中。

裂解溶液分别对应于在200μl GuHCl或GuSCN 3M，50mM Tris pH 7、1％TritonX100或稀释为3M的easyMAG裂解缓冲液(bioMérieux，

法国)中的23μgDNA。

向这些溶液中添加1mg磁性二氧化硅颗粒(easyMAG，bioMérieux，法国)。通过在260nm处用紫外分光光度法测量洗脱液中所含核酸的总DNA提取收率，即在磁性二氧化硅颗粒上捕获后，用easyMAG“Wash buffer 2”洗涤试剂洗涤颗粒，并用easyMAG“Elution buffer 3”洗脱试剂在70℃下洗脱5分钟。

表1：在存在或不存在蛋白质抑制剂的情况下，23μg DNA的提取收率。括号中的数字表示洗脱液的260nm/280nm的比例。

如先前的实施例，观察到提取收率的急剧下降。无论裂解条件如何，当将蛋白质添加到培养基中时，DNA提取收率(捕获、洗涤、洗脱)都将从约60％降至低于6％。

提取的核酸的纯度也受到很大影响，因为蛋白质的存在降低最终洗脱液中代表蛋白质污染的260/280的比例，从2降低至平均低于1.6(参见表1)。因此，这反映了洗脱液中蛋白质的浓度非常高。

该实验清楚地表明，由于竞争性作用，以类似于标准提取中所发现的浓度使用的蛋白质化合物，特别是血液的蛋白质化合物对核酸的捕获具有非常强烈的影响。结果是总的提取收率和核酸的纯度受到影响。

实施例4：通过在高浓度蛋白质的存在下使用掩蔽胺和/或羧酸官能团的试剂来提高DNA提取收率(pH 7下使用磁性颗粒)

发明人进行了与以上实施例3中描述的相同的实验，这次在与磁性二氧化硅颗粒接触之前增加了用乙酸酐或EDC的处理。

为此，在200μl GuHCl或GuSCN、50mM Tris pH 7、1％Triton X100或easyMAG裂解缓冲液的溶液中，用5000μg蛋白质(在实际血液样品中可以发现的相似浓度下，25μl含150g/l Hb、50g/l HAS和3g/l血纤蛋白原在50mM Tris-HCl pH7中的混合物)孵育23μg DNA(2.3g/l的10μl DNA)，其浓度为例如3M离液盐提取时所发现的浓度下。

添加足够的乙酸酐或EDC以达到在溶液中为0.3M。

使其反应5分钟，用几微升10M氢氧化钠中和以恢复pH值为7(仅在使用乙酸酐的情况下)，并添加1mg磁性二氧化硅颗粒，在如实施例3中所述洗涤和洗脱纯化的核酸之前将其搅拌15分钟孵育。

相对于初始的23μg DNA和洗脱液中获得的核酸量计算总提取收率。该测定通过在260nm下的UV分光光度法进行。

表2表明在提取过程中蛋白质的存在显著地降低了DNA提取收率以及其260nm/280nm的比例(不管条件如何，从60％降至5％和从2降至约1.6)。但是，在添加磁性二氧化硅颗粒之前，将裂解物用乙酸酐或EDC(在下表2中分别为Ac₂O或EDC)预孵育，其显著地恢复DNA提取性能，无论是数量(约20％)还是纯度(约1.8)。

这证明了在类似于在提取核酸的典型方案中发现的条件下，先前的蛋白质掩蔽对经由固体载体的DNA提取的有益作用。

通常，具有比GuHCl更高的变性能力的GuHSCN在存在蛋白质的情况下可以实现更好的DNA捕获收率。但是，LB中EDTA的存在会降低260/280的比例，而LB中还存在的TritonX-100具有非常有益的作用。

表2:在存在或不存在蛋白质抑制剂、用或不用乙酸酐(Ac2O)或EDC以及在不同的裂解条件下23μg DNA的提取收率。括号中的数字表示洗脱液的260nm/280nm的比例。

实施例5：改善血液中核酸的提取收率(pH 7下使用磁性颗粒提取)

为了证明通过试剂掩蔽实际生物样品的蛋白质的有益效果，使用磁性二氧化硅颗粒(bioMérieux)和稍加修改的方案：使用3M GuHCl、50mM Tris HCl pH 7、1％Triton用于裂解步骤，在50％乙醇中的50mM Tris HCl pH 7用于洗涤和EasyMAG EB3缓冲液(bioMérieux)用于最终洗脱，从200μl的血液中提取了核酸。

在裂解步骤中，血液样品用0.3M乙酸酐或0.3M乙酸处理5分钟，然后通过添加几微升氢氧化钠(与未经处理的参照样品相比)进行中和。

该处理后，按照供应商(bioMérieux)的提取方案，添加磁性颗粒并将裂解物置于easyMAG中。通过UV分光光度仪(Nanodrop，Thermofischer)测量血液中存在的核酸的量。在图4A中值得注意的是使用掩蔽剂的方案也适用于血液样品：在使用的条件下，不使用乙酸酐处理只会产生0.7μg核酸(纯度0.9)，而用乙酸酐处理则会产生大于5μg的核酸(纯度大于1.9)。在对照实验中，用乙酸处理没有表现出改善，这表明乙酸酐的作用与其酰化能力有关。实际上，乙酸不是酰化剂并且不能掩蔽蛋白质的反应性官能团。

可能存在大量与核酸共提取的化合物，这可能会使260/280的比例失真。为了消除使用UV分光光度法测量从生物样品中提取所得洗脱液的光学密度所固有的误差，对这些洗脱液进行了用核酸酶P1和碱性磷酸酶的完全水解。

通过HPLC分析水解产物，以不具有蛋白质干扰，并且通过积分对应于核苷的簇，在色谱图中测量对应于核苷(DNA和RNA)的面积。获得的结果表明，预先用乙酸酐处理的血液样品含有的核酸比未经处理的样品或用乙酸处理的样品(未酰化的)含有的核酸多12倍(图4B)。

实施例6：改善血液中核酸的提取收率(pH 5.5下使用基于二氧化硅的磁性颗粒提取)

进行与实施例5中描述的实验相同的实验，但是改变了核酸的提取条件(不同的缓冲液)。

向133μL的血液溶液中添加237μL裂解缓冲液(6M GuHCl、15％Triton、AcONa，pH5.5)和6μL、12μL或24μL的Ac₂O。将培养基在热混合器中在25℃和500rpm搅拌下孵育3分钟至5分钟，然后根据需要通过添加几微升10M NaOH将pH调节至5.5。例如，对于6μL、12μL和24μL的Ac₂O分别添加3μL、4.5μL和6.8μL的NaOH。将裂解物添加到磁性二氧化硅颗粒中以提取核酸。在洗脱步骤之前用洗涤溶液(70μl的Wash Buffer IX洗涤3次)在70μl的Tris HCl溶液中进行洗涤，同时以1400rpm在70℃下搅拌5分钟。如实施例5中所述，使裂解物经受核酸的水解酶作用，以确定提取的核酸的量。所获得的结果表明，在血液存在下添加掩蔽剂(乙酸酐)可以使提取的核酸的量增加一倍。

观察到在这些条件下约6μl的纯乙酸酐效果最佳。在此浓度下，在裂解缓冲液中存在15％Triton的情况下，洗脱的核酸总量将增加一倍。比率rA/(rA+dA)显示RNA占洗脱液的70％，纳米颗粒占10％，表明RNA被优先洗脱。

实施例7：在根据本发明的方法的条件下用乙酸酐处理DNA不改变核苷的化学结构

为了证明乙酸酐对核酸的反应选择性，发明人进行了以下实验：

在0.6M乙酸酐(24μl)的存在下，将92mg DNA在360μl的3.3M GuHCl、50mM TrisHCl pH 7中的混合物孵育10分钟，之后，通过超滤单元(Ultracel YM-50)纯化DNA，以消除部分吸收紫外线的乙酸酐。然后将该样品用核酸酶P1和碱性磷酸酶的混合物进行完全裂解，然后通过HPLC(条件A)分析。所获得的结果表明，无论是否存在乙酸酐，DNA水解物具有完全相同的特征。仅检测到预期的核苷，而没有酰化的核苷。还通过质谱搜索酰化的核苷，未发现这些产物。这些结果表明与乙酸酐的酰化反应确实是选择性的，并且不影响提取的核酸。

实施例8：证明在核酸提取条件下在用乙酸酐处理过程中DNA和RNA的结构不受影响

进行了与实施例7相同的证明，这次使用DNA和RNA的混合物，将其置于存在或不存在乙酸酐的情况下，然后用磁性二氧化硅颗粒提取。这些洗脱物的酶水解作用明确地证明了在乙酸酐作用后核苷没有化学改性(参见图5)。因此可以得出结论，由此提取的核酸应可通过PCR或通过任何其他反应进行遗传物质的酶促扩增。

实施例9：乙酸酐对血液样品的处理可以更灵敏地检测CMV病毒

将200μl含有10e4拷贝量的CMV病毒(培养中的巨细胞病毒)的血液样品添加到800μl裂解缓冲液(6M GuHCl、15％Triton、AcONa，pH 5.5)中，反应几分钟后向其中添加9ml纯的乙酸酐和任选的1μl的10M NaOH。

在没有预先用乙酸酐处理的情况下，用血液作为对照，另一个没有血液样品，对应于含有10e4个CMV拷贝的63μl Tris HCl pH7，然后与237μl裂解缓冲液混合。

然后如实施例6所述提取并纯化裂解物中包含的核酸。然后使用RGene CMV试剂盒(试剂盒CMV 69-003B：批次1005408010，BioMérieux，

法国)和热循环仪(CFX96 TouchTM BioRad)对洗脱液进行实时PCR扩增以确定提取的核酸的检测灵敏度，以PCR循环数(Ct)表示。该数目是核酸浓度的函数：它越低越容易检测病原体的核酸，因为核酸的初始浓度很高。每个Ct(对数刻度)之间的比例因子为10。

图6的曲线分别对应于在没有生物基质(三角形)、没有经过乙酸酐处理的生物基质(X形)和在经过乙酸酐处理的生物基质(圆形)提取后进行的对照扩增。因此，在没有生物基质的情况下提取CMV病毒时，PCR循环数为34Ct，然后当从包含血液的样品中提取相同量的核酸时，PCR循环数升高至38Ct。这表明生物基质中所含的抑制剂造成了多于99.9％的初始核酸损失。当样品事先用乙酸酐处理时，Ct值返回至34，这与没有基质的样品相当。这些数据显示，在存在生物基质的情况下，检测灵敏度有了显著的改善。

图7是图6的另一种表示，其具有对Ct的进一步说明。

实施例10：在高蛋白质浓度的存在下，通过使用乙酸酐(使用具有硅胶膜的提取柱)改善核酸的提取

在该实施例中，发明人使用了不同于磁性二氧化硅颗粒的核酸提取介质，以证明乙酸酐在其他提取技术，例如具有硅胶膜的提取柱中也是有意义的。

将10μg鲑鱼***DNA(20kB)混合在300μl的3M GuHCl、50mM AcO-Na pH 5.5和30％乙醇的溶液中，其具有0μg、300μg、600μg、1200μg、1800μg和2400μg的递增浓度的血红蛋白和人血清白蛋白混合物(血红蛋白/HSA的比为3/1)。

在热混合器中搅拌的同时，将该混合物用6μl乙酸酐处理或不处理几分钟(10)。

用1μl的5M NaOH中和混合物，将pH恢复至5.5。

将混合物沉积在QiaQuick柱(Qiagen，Heiden，德国)上，并在13200rpm下离心6分钟。

用200μl的50mM MES pH 5.5/80％乙醇将色谱柱洗涤3次，同时在13200rpm下离心3分钟。

然后将固定的核酸第一次用200μl pH 8.5的3mM硼酸缓冲液洗脱，然后再次通过该溶液洗脱所有核酸。

将洗脱液进行酶水解，然后通过色谱分析对提取的核酸进行定量。

如图8所示，当样品经受乙酸酐时，可以看到DNA提取量的显著提高。

实施例11：证明根据本发明使用乙酸酐还可以抑制核酸酶

将60个碱基的模型寡核苷酸(1nmol)与48μl水中的0.01单位核酸酶P1和48μl的500mM MES pH 4.7的溶液接触，同时添加或不添加6μl纯的乙酸酐。结果示于图9中。与未经处理的对照寡核苷酸相比(色谱图A)，在不存在乙酸酐的情况下，寡核苷酸立即被核酸酶水解(色谱图B)。在另一方面，在添加乙酸酐的情况下，寡核苷酸的降解非常小(色谱图C)。因此，这表明乙酸酐通过将核酸酶烷基化而使核酸酶失活。

实施例12：证明试剂(乙酸酐的情况下)可以在离散条件下与蛋白质选择性反应

图10和图11显示了在裂解条件下(3M GuHCl或3M GuSCN、50mM Tris HCl pH 7)通过0M至1.8M的乙酸酐对25mg/ml的HSA或血红蛋白进行乙酰化的HPLC监测(条件B)。在反应5分钟后，根据乙酸酐的浓度，可以看到对应于蛋白质的簇变宽并向右移动，这表明蛋白质变得更加疏水，这是其酰化的结果。对于HSA，当浓度达到1.2M左右时，保留时间不再改变，这意味着蛋白质的所有亲核基团均已反应。在监测血红蛋白乙酰化的色谱图中，注意到血红素没有被乙酰化改性，并且保留时间没有任何变化。

因此这表明乙酸酐可以在裂解条件下以及在亲核化合物如Tris的存在下在蛋白质上快速有效地反应。

乙酸酐在水性介质中可以选择性地乙酰化蛋白质这一事实确实是出人意料的，因为大多数描述的具有乙酸酐的反应都是在有机溶剂中的。由于可能使乙酸酐水解的水、Tris和胍的存在，因此乙酸酐以低浓度与蛋白质反应并非显而易见。