黄连碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用
阅读说明：本技术 黄连碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 (Application of coptisine in preparation of medicine for treating ulcerative colitis ) 是由 李彩兰 鲁强 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,公开了黄连碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用,所述黄连碱的结构式为式(Ⅰ)。本发明表明黄连碱对溃疡性结肠炎具有良好的治疗功效,并提供一种黄连碱的新用途,即用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物；黄连碱是黄连中天然来源的单体成分,尚未被报道有明显副作用,因此将黄连碱用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物,具有毒性小、安全性高的特点。<Image he="501" wi="700" file="DDA0002589781010000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the field of medicines, and discloses an application of coptisine in preparation of a medicine for treating ulcerative colitis. The invention shows that the coptisine has good treatment effect on the ulcerative colitis, and provides a new application of the coptisine, namely the coptisine is used for preparing a medicament for treating the ulcerative colitis; coptisine is a natural monomer component in coptis and has no reported obvious side effect, so that the coptisine has the characteristics of low toxicity and high safety when being used for preparing the medicine for treating ulcerative colitis.)
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及黄连碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)属于炎症性肠病(Inflammatory BowelDisease，IBD)的一种，是一种病因尚不明确的直肠和结肠的慢性非特异性疾病。临床主要表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便以及里急后重等，具有易复发、难治愈、易癌变的特点，已被世界卫生组织(WHO)列为现代难治病之一。中医将UC归为“肠癖”、“下痢”、“泄泻”等范畴，大肠湿热为其主要病机。该病在西方国家较为常见，近年来，我国UC的发病率呈明显升高趋势。目前，尚缺乏公认且疗效确切的治疗药物及方法，临床上对UC的防治药物包括免疫抑制剂、氨基水杨酸类、生物制剂、糖皮质激素等，虽具有一定的疗效，但存在副作用严重，易复发、病人耐受性低等问题。因此，探究可防治UC的有效安全的新药及其阐明其效应机制已成为相关临床研究的热点。
传统中药黄连始载于《神农本草经》，为毛茛科植物黄连(Coptis ChinesisFranch)、三角叶黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hisao)或云连(Coptis teetaWall)的干燥根茎。黄连为中医治疗湿热痢疾要药，具有“清热解毒，燥湿止痢”的功效，长于入中焦与大肠以治泻痢。现代药理研究证实，黄连具有抗炎、抗菌、胃肠保护、抗UC等作用，季胺型异喹啉类生物碱如小檗碱、巴马丁、黄连碱、表小檗碱、药根碱等为其主要活性成分，但一般认为其中小檗碱是治疗胃肠疾病的主要功效来源。
当前研究仅表明黄连碱(COP)具有抗氧化、抗炎、抗菌、调节脂质代谢等多种生物学活性，但其在抗溃疡性结肠炎方面的作用尚未见报道，更没有将黄连碱用于制备治疗溃疡性结肠炎药物的先例。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种黄连碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，黄连碱可显著改善溃疡性结肠炎动物的病状，具有修复肠黏膜上皮屏障和减轻肠道炎症的作用，防治溃疡性结肠炎的效果显著。
黄连碱在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，所述黄连碱的结构式为式(Ⅰ)：
所述黄连碱的分子式为C19H14NO4，分子量为320.32。
本发明的实验表明，黄连碱可显著改善溃疡性结肠炎小鼠的体重下降、腹泻、血便、结肠缩短等症状，降低促炎细胞因子和增加抗炎细胞因子的表达，并通过抑制结肠黏膜细胞凋亡和增加紧密连接蛋白表达，保护结肠黏膜完整性，从而减轻溃疡性结肠炎。
一种治疗溃疡性结肠炎的药物，以黄连碱作为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
优选的，所述药物中黄连碱的质量含量为0.5-25％。
优选的，所述药物的制剂形式为片剂、颗粒剂、胶囊剂或栓剂。
优选的，所述药物的给药方式为口服或直肠给药。
本发明采取给小鼠灌胃葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液诱导构建溃疡性结肠炎模型，通过比较美沙拉嗪(5-ASA，常用于治疗溃疡性结肠炎)与黄连碱(COP)对溃疡性结肠炎的治疗效果，表明黄连碱在较低的剂量下也具有较好的治疗效果。
实验表明，黄连碱可明显改善溃疡性结肠炎小鼠的结肠组织损伤情况。具体为有效恢复隐窝结构并减少结肠黏膜上皮坏死，改善黏膜下层水肿程度，减少炎性细胞浸润并降低MPO(髓过氧化物酶)活性。黄连碱还可显著减少溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中促炎细胞因子，包括有TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ，并增加抗炎细胞因子如IL-10和TGF-β的含量。
黄连碱还可修复DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜上皮屏障破坏情况。具体是通过增加结肠组织紧密连接蛋白(ZO-1、ZO-2、occludin和claudin-1)的表达水平，抑制促凋亡蛋白Bax的蛋白和基因表达及Caspase-3和Cytochrome c的基因水平，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的基因和蛋白表达，并有效下调Bax/Bcl-2比值，从而改善DSS诱导的肠黏膜屏障功能破坏。
黄连碱还可抑制NF-κB信号通路的激活。具体是通过显著上调胞浆内p65蛋白表达，下调胞核内p65蛋白表达，并降低p-IκBα/IκBα比值，从而抑制了NF-κB信号通路的激活。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明表明黄连碱对溃疡性结肠炎具有良好的治疗功效，并提供一种黄连碱的新用途，即用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物；
(2)相比于具有较明显副作用的美沙拉嗪，黄连碱是黄连中天然来源的单体成分，尚未被报道有明显副作用，因此将黄连碱用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物，具有毒性小、安全性高的特点。
附图说明
图1表示黄连碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠症状的影响；(图1A)第0天至第8天每日体重变化；(图1B)DAI评分；(图1C)小鼠结肠长度的宏观图；(图1D)小鼠结肠长度差异的条状图。
图2表示黄连碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学损伤和MPO活性的影响；(图2A)小鼠结肠组织结构病理学变化，IFI：炎性浸润；(图2B)组织病理学评分；(图2C)MPO活性。
图3表示黄连碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠促炎细胞因子和抗炎细胞因子表达的影响；(图3A)TNF-α；(图3B)IFN-γ；(图3C)IL-1β；(图3D)IL-6；(图3E)IL-17；(图3F)IL-10；(图3G)TGF-β。
图4表示黄连碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜屏障功能的影响；(图4A)凋亡相关蛋白的Western blot图；(图4B)Bax蛋白表达；(图4C)Bcl-2蛋白表达，(图4D)Bax/Bcl-2比值；(图4E)Bax mRNA水平；(图4F)Bcl-2mRNA水平；(图4G)Caspase-3 mRNA水平；(图4H)Cytochrome c mRNA水平。
图5表示黄连碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠紧密连接蛋白表达的影响；(图5A)小鼠结肠组织结构紧密连接蛋白表达的Western blot图；(图5B)ZO-1；(图5C)ZO-2；(图5D)Occludin；(图5E)Claudin-1。
图6表示黄连碱对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠NF-κB信号通路的影响；(图6A)NF-κB信号通路相关蛋白的Western blot图；(图6B)NF-κB p65(核)(图6C)NF-κB p65(质)；(图6D)p-IκBα/IκBα。
以上各图中与正常组相比，##表示P<0.01；与模型组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
Control：空白组，DSS：模型组，5-ASA：美沙拉嗪(200mg/kg)，COP：黄连碱(25、50和100mg/kg)。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实验药物：黄连碱(COP)购于成都植标化纯生物技术有限公司；美沙拉嗪(5-ASA)购于Losan Pharma GmbH制药公司。
实验试剂：葡聚糖硫酸钠(DSS，MW：36000-50000)购于美国MP Biomedicals公司；H&E染色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；髓过氧化物酶(MPO)试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；小鼠ELISA试剂盒：TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17，IFN-γ和TGF-β，购于北京诚林生物科技有限公司；抗体ZO-1、ZO-2、claudin-1、occludin、p65、p-IκBα、IκBα、Bax、Bcl、GAPDH和辣根过氧化物酶偶联的二抗购自Affinity Biosciences公司。
实验动物：6-8周SPF级雄性BALB/c小鼠(20-23g)，购于广东省医学实验动物中心。小鼠在温度为22±2℃，相对湿度为50±10％，每天12小时光照和12小时黑夜的环境中适应性饲养7天，期间喂以标准小鼠饲料并让小鼠自由饮水。
实验分组与剂量设计：实验开始前，记录BALB/c小鼠称重，并按体重随机分为7组：正常组(Control)，模型组(DSS)，美沙拉嗪组(5-ASA，200mg/kg)、黄连碱低剂量组(COP-L，25mg/kg)、黄连碱中剂量组(COP-M，50mg/kg)、黄连碱高剂量组(COP-H，100mg/kg)，每组10只小鼠。
溃疡性结肠炎小鼠模型的建立：BALB/c小鼠自由饮用3％葡聚糖硫酸钠DSS水溶液7天，即诱导形成溃疡性结肠炎模型。模型建立的同时，各组小鼠给予相应的药物进行治疗，其中正常组、模型组则给予治疗药物的相应溶剂(0.5％CMC-Na水溶液)。持续给药7天。第8天采用颈椎脱臼法处死所有小鼠。
实施例1
一种治疗溃疡性结肠炎的黄连碱药剂(片剂)，其制备方法包括以下步骤：
取黄连碱50g，加入乳糖48g、淀粉75.4g混合均匀，用7％的淀粉浆35g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁1.6g混匀，压制成每片含黄连碱50mg的片剂1000片，每片净重0.21g。
口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、腹泻、便血、体重减轻等。
实施例2
一种治疗溃疡性结肠炎的黄连碱药剂(胶囊剂)，其制备方法包括以下步骤：
取黄连碱50g，加入乳糖98g、淀粉125.4g混合均匀，用7％的淀粉浆35g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁1.6g混匀，填充至1号胶囊制成1000粒，每粒胶囊内含黄连碱50mg，每粒净重0.31g。
口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、腹泻、便血、体重减轻等。
实施例3
一种治疗溃疡性结肠炎的黄连碱药剂(颗粒剂)，其制备方法包括以下步骤：
称取30g黄连碱加入到适量β-环糊精中制成包合物，加入适量蔗糖粉、微晶纤维素、淀粉浆，混合均匀，逐渐加入乙醇和水，制成颗粒，进行分装。规格为每包含黄连碱50mg的颗粒剂，每包净重7g。
开水冲服，口服，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、腹泻、便血、体重减轻等。
实施例4
一种治疗溃疡性结肠炎的黄连碱药剂(栓剂)，其制备方法包括以下步骤：
取黄连碱20g，加入可可豆脂等辅料，配置成含黄连碱50mg的栓剂。
直肠给药，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、腹泻、便血、体重减轻等。
实施例5
疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分
在实验过程中，每天观察记录小鼠体重变化、活动状况、粪便性状、血便情况。DAI评分根据以下标准进行评分：
体重变化评分：未变化，0分；下降1-5％，1分；下降5-10％，2分；下降10-20％，3分；下降大于20％，4分。
大便形状评分：正常，0分；粪便较软，1分；粪便湿软，2分；半稀便，3分；稀便，4分。
血便情况评分：无血便，0分；便血检测阳性，2分；明显血便，4分。
DAI＝(体重下降分数+大便形状分数+血便分数)/3。
结肠长度的测量：小鼠颈椎脱臼处死后，解剖获取结肠，随后，测量结肠长度，记录数据并拍照获取图片。取1cm左右的结肠置于4％多聚甲醛中用于后续H&E(苏木精-伊红)染色实验，其余结肠组织储存于-80℃。
本研究发现，在试验周期内，空白对照组小鼠摄食饮水正常，毛发干净有光泽；动作灵敏、活跃，体重保持稳定趋势。而模型组小鼠毛发稀疏、竖起、无光泽，小鼠常静卧蜷缩，前4天体重稳定，基本保持不变；到第5天后，模型组小鼠体重下降明显且呈持续下降状态。
如图1A所示，黄连碱和阳性药物美沙拉嗪的各给药处理组均可明显改善DSS诱导的小鼠体重下降情况，且黄连碱抑制体重下降效果还明显优于阳性药美沙拉嗪。
如图1B所示，模型组小鼠DAI评分从第1天开始上升且呈持续上升状态，评分较空白对照组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，黄连碱给药处理组可以剂量依赖方式显著降低DAI评分(P<0.05)，且黄连碱中剂量组和黄连碱高剂量组的效果还优于美沙拉嗪组。
如图1C和图1D所示，与正常组比较，模型组小鼠结肠长度明显缩短(P<0.05)；而给予黄连碱、美沙拉嗪药物治疗后情况有所恢复，且给药各组小鼠结肠长度均较模型组显著增长(P<0.05)。
综上可知，黄连碱可明显改善葡聚糖硫酸钠DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠的宏观症状，具有抗溃疡性结肠炎的作用。
实施例6
结肠组织病理学观察及评分
取出实施例5中固定于4％多聚甲醛溶液小鼠结肠样品，进行脱水，石蜡包埋，切片(厚度为5μm)，使用苏木精和伊红进行染色，于显微镜下观察结肠组织常规病理变化，并按照进行组织病理状态评分(Histological score)：
炎症程度：无炎症，0分；浅显炎症，1分；轻微溃疡，2分；明显溃疡，3分。
隐窝损伤程度：形态正常，0分；少量隐窝变形，1分；中等水平隐窝变形，2分；高水平隐窝变形，3分；明显的隐窝缺失，4分。
炎症浸润面积：无炎症细胞浸润，0分；10％视野呈低水平炎症细胞浸润，1分；10-25％视野呈中等水平炎症细胞浸润，2分；25-50％视野呈高水平炎症细胞浸润，3分；明显炎症细胞浸润，4分。
肠壁炎症深度：无炎症，0分；炎症限于黏膜层，1分；炎症逐步深入黏膜下层，2分；炎症深入固有层，3分。
总分为0分(正常)-14分(严重肠炎)不等。
MPO活性的测定
取出储存在-80℃中的结肠组织，按重量体积比为1：19加入MPO试剂盒中的相关试剂，制备成5％的组织匀浆液，继而严格按照试剂盒说明书操作计算MPO活力。
如图2A所示，与空白对照组、美沙拉嗪组和黄连碱给药处理组相比，模型组小鼠的黏膜结构破坏严重，其特征包括上皮损伤严重、杯状细胞减少、隐窝或肠腺基本消失、黏膜下层或肌层水肿严重、黏膜下层炎症细胞浸润明显；如图2B-C所示，与空白对照组相比，模型组小鼠较高的组织病理学评分和MPO活性；与模型组(DSS)相比，黄连碱给药处理组(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)以剂量依赖方式显著恢复隐窝结构并减少结肠黏膜上皮坏死，改善黏膜下层水肿程度，减少炎性细胞浸润，降低组织病理学评分和降低MPO活性(P<0.05)；并且与美沙拉嗪组(5-ASA，200mg/kg)相比，黄连碱高剂量组(COP-H，100mg/kg)的药物用量更少，但降低组织病理学评分和降低MPO活性的效果更好，证实黄连碱对治疗溃疡性结肠炎具有更好的疗效。
实施例7
ELASA检测炎症因子取出储存在-80℃中的结肠组织，按重量体积比为1：9加入预冷的PBS溶液，匀浆，3500g，4℃离心15min后，取上清液，严格按照ELASA试剂盒说明书操作，分别测定炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β的含量。
如图3所示，相较于空白对照组，DSS诱导的结肠炎模型组小鼠结肠组织中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ)显著升高(P<0.05)，抗炎细胞因子(IL-10和TGF-β)显著减少(P<0.05)。与模型组相比，黄连碱给药处理组以剂量依赖方式显著减少上述5种抗炎细胞因子，增加上述2种抗炎细胞因子的水平(P<0.05)，表明黄连碱可通过有效抑制DSS诱导的UC小鼠炎症蛋白水平来改善UC症状。
实施例8
RT-PCR检测相关基因的表达
总RNA提取：称取小鼠结肠组织100mg于2mL EP管内，加入1mL Trizol(主要成分为苯酚)。用剪刀将结肠组织剪碎后进行匀浆，后加入氯仿200μL，盖紧离心管盖，涡旋混合1min至溶液乳化呈乳白色，室温静置10min。经15000g，4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的1.5mL EP管中。向上清中加入异丙醇500μL，上下颠倒离心管充分混匀后，-20℃静置1小时。12000g，4℃离心5min，小心弃去上清。加入500μL无水乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，经7500g，4℃离心5min后小心用滤纸吸走残余液体。室温挥干乙醇，加入20μL DEPC水溶解RNA，再将该溶液在NanoDrop2000超微量分光光度计中进行RNA纯度检测，控制吸光度比值OD260/OD280的范围为1.8-2.2。
逆转录：用镊子取八连排管，用移液枪吸取4μL 4×gDNA wisper Mix溶液到管底部，再依次加入4μL上述RNA溶液，8μL RNase free ddH2O溶液，离心后于PCR仪42℃下反应2min，取出加入4μL 5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡa溶液，再于PCR仪以25℃，10min；50℃，30min；85℃，5min；4℃，最后每个样加40μL RNase free ddH2O，合成的cDNA保存于-20℃。
荧光定量PCR：使用NCBI在线工具Primer-BLAST设计针对小鼠RT-PCR检测的引物后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成并纯化引物，引物序列见于表1：
表1
引物配制：各合成引物干粉4℃离心1min后按照说明书要求加入相应量的DEPC水，涡旋混匀，离心，制得100μM母液，再用DEPC水稀释获得10μM工作浓度引物液。
按照正向引物：反向引物：DEPC水＝1：1：3的体积比混匀，得到引物混合液
用镊子取八连排管，加入10μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mixa于每管底部，再依次加入5μL引物混合液，5μL cDNA，离心30s，立即按以下条件进行PCR反应。
具体反应程序为：预变性，95℃反应30s，1个循环；PCR反应，95℃反应10s，60℃反应30s，40个循环；溶解曲线，95℃反应15s，65℃反应10s，95℃反应30s。
以GAPDH为内参基因，每个反应重复三次，利用循环次数Ct值进行相对定量。基因表达倍数＝2-△△Ct，△△Ct＝(Ct Sample–Ct GAPDH)–(Ct Control–Ct GAPDH)。
黄连碱对DSS致UC小鼠结肠组织中细胞凋亡的影响
如图4E-H所示，分别为各组小鼠结肠组织中Bax，Bcl-2，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和细胞色素C(Cytochrome c)的mRNA表达量。与空白对照组相比，模型组小鼠的Bax，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，细胞色素C的基因表达显著上升，Bcl-2显著下降(P<0.05)。但黄连碱给药处理组(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)以剂量依赖方式显著下调Bax、Caspase-3、Cytochrome c，并上调Bcl-2的基因表达(P<0.05)。结果表明黄连碱可通过减少肠黏膜细胞的凋亡，进而达到抗溃疡性结肠炎的作用。
实施例9
Western blot分析
组织总蛋白的提取：取出储存在-80℃中的结肠组织，按100mg：1mL比例加入裂解液(RIPA裂解液：Cocktail：PMSF：磷酸酶抑制剂A：磷酸酶抑制剂B＝100：2：1：1：1)，冰上匀浆，冰上孵育20min(期间偶尔涡旋)，14000g，4℃离心10min后，取上清于1.5mL EP管中，并用BCA试剂盒，测定蛋白浓度。
胞浆、胞核中蛋白的提取：取出储存在-80℃中的结肠组织，按细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒操作说明，提取总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
将上述提取的蛋白上清液以1：4加入5×loading buffer后，100℃变性5min，分装保存于-80℃。
制备8-10％聚丙烯酰胺分凝胶(SDS-PAGE)和5％浓缩胶，待浓缩胶聚合完全后，加满电泳缓冲液。用微量进样器上样等量样品且同时在泳道两侧加5μL marker以指示蛋白分子量，80V恒压电泳30min后调120V恒压电泳，待溴酚蓝线泳至距胶边缘处时，停止电泳，切下分离胶所需部分，湿法转膜到PVDF膜上。将膜用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次10min。取出PVDF膜，并分别与下列抗体在4℃下孵育过夜：NF-κBp-p65(1：1000)、p65(1：1000)、p-IκBα(1：1000)、IκBα(1：1000)、Bax(1：1000)、Bcl-2(1：1000)、claudin-1(1：500)、occludin(1：500)、ZO-1(1：500)、ZO-2(1：500)、GAPDH(1：1000)和Histone H3(1：1000)，在与辣根酶标记的二抗(1：2000)室温孵育2小时，使用ECL化学发光液显影蛋白质条带，使用Image J软件分析目的条带灰度值，以GAPDH内参，计算目标蛋白的相对表达量。
实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS17.0软件进行统计学分析，各组间差异比较采用单因素方差分析(One-Way Analysis of ANOVA)，若组间方差齐则用LSD分析，若不齐则用Dunnett’s T3分析。
黄连碱对DSS致UC小鼠结肠组织中肠屏障功能的影响
如图4A所示为相关凋亡蛋白的western blot图，相关凋亡蛋白表达被GAPDH标准化；如图4B-D所示，黄连碱各剂量组均可显著下调Bax，上调Bcl-2的蛋白表达，并显著降低Bax/Bcl-2的比值(P<0.05)，且黄连碱呈现出明显的剂量依赖关系，表明黄连碱可通过减少肠黏膜细胞的凋亡，进而达到抗溃疡性结肠炎的作用。
如图5A所示为小鼠结肠组织结构紧密连接蛋白表达的western blot图，相关蛋白表达被GAPDH标准化。如图5B-E所示，与空白对照组相比，经DSS处理的模型组小鼠中紧密连接蛋白(ZO-1、ZO-2、occludin和claudin-1)的表达量均显著减少(P<0.05)，表明肠黏膜屏障结构被破坏。与模型组相比，美沙拉嗪组和黄连碱给药处理组(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)以剂量依赖方式显著增加紧密连接蛋白的含量，且黄连碱高剂量组(COP-H，100mg/kg)的小鼠紧密结合蛋白的含量已与空白对照组相近，证实黄连碱具有良好的保护结肠组织肠屏障功能的作用。
黄连碱对DSS致UC小鼠NF-κB信号通路的影响
如图6A所示为NF-κB信号通路蛋白的western blot图，相关蛋白表达被GAPDH标准化。如图6B-D所示为NF-κB p65(核内)、NF-κB p65(胞浆)、p-IκBα/IκBα蛋白表达水平。与空白对照组相比，DSS诱导的结肠炎模型组小鼠p-IκBα/IκBα比值和细胞核内p65的蛋白表达显著上升(P<0.05)，细胞浆p65的蛋白则显著降低(P<0.05)，表明DSS致溃疡性结肠炎后可显著增加IκBα的磷酸化，且细胞浆中的p65蛋白进入细胞核中导致炎症。与模型组相比，美沙拉嗪组(5-ASA，200mg/kg)和黄连碱给药处理组(25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)可显著上调胞浆内p65蛋白表达，下调胞核内p65蛋白表达，并显著降低p-IκBα/IκBα比值(P<0.05)，且黄连碱呈现出明显的剂量依赖关系。该研究结果提示，黄连碱可能通过抑制DSS诱导的UC小鼠结肠组织中IκBα的磷酸化、细胞浆中的p65蛋白进入细胞核中，抑制了NF-κB信号通路的激活，从而表现出明显抗UC疗效。