阅读说明：本技术 一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法 (Method for extracting soybean isoflavone from soy sauce residues ) 是由 程云辉 罗诗华 黄福气 许宙 焦叶 陈茂龙 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法。该方法包括以下步骤：S1、乙醇提取：以乙醇为溶剂与酱油渣混合,得到大豆异黄酮粗提取液；S2、浓缩离心：将所述大豆异黄酮粗提取液浓缩、离心得到大豆异黄酮第一提取物；S3、二氯甲烷萃取：将所述二氯甲烷与所述大豆异黄酮第一提取物混合,得到大豆异黄酮第二提取物；S4、金属有机框架化合物吸附：将所述大豆异黄酮第二提取物与所述金属有机框架化合物混合,得到吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物。本发明从酱油渣中高效率地提取纯度较高的大豆异黄酮。(The invention relates to a method for extracting soybean isoflavone from soy sauce residues. The method comprises the following steps: s1, ethanol extraction: mixing ethanol as solvent with soy sauce residue to obtain crude extract of soybean isoflavone; s2, concentration and centrifugation: concentrating and centrifuging the crude extract of the soybean isoflavone to obtain a first extract of the soybean isoflavone; s3, extraction with dichloromethane: mixing said dichloromethane with said first extract of soy isoflavones to obtain a second extract of soy isoflavones; s4, adsorption of metal organic framework compound: mixing the second extract of soy isoflavones with the metal-organic framework compound to obtain the soy isoflavone-adsorbed metal-organic framework compound. The invention efficiently extracts the soybean isoflavone with higher purity from the soy sauce residue.)

一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法

技术领域

本发明涉及于农副产品深加工及食品工业技术领域，尤其涉及一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法。

背景技术

对于异黄酮的分离精制的方法有柱层析法(硅胶柱层析法、聚酰胺柱层析法、大孔吸附树脂柱层析法等)、膜分离法和高速逆流色谱法。柱层析法可通过分子筛作用、分子间作用力(氢键或范德华力)将大豆异黄酮从样品液中分离出来，通过此法可以得到高纯度的大豆异黄酮产品；膜分离法则基于分子量截留的原理将大豆异黄酮与其它杂质分离开来，有能耗低、分离效率高、工艺简单的优点。

高速逆流色谱是不需固态载体的液-液分配色谱技术，利用化合物之间的溶解性不同进行分离纯化，不会引起分析物变性分解，产品回收率高、纯化效果好且能连续高效进行分离。MOFs是近年新兴的一类由金属离子和有机框架配体组成的结晶多孔聚合物材料，它具有巨大的比表面积、吸附量大、制备原料易获得、可设计性强，易于实现特定选择性等优点。由于MOFs材料可以通过结合不饱和位点、酸碱作用、形成π-π络合物、氢键作用、静电作用等原理发生选择性吸附作用，MOFs被应用在许多方面，如分离和储存，催化、药物输送载体和化学传感等领域。因此，MOFs材料作为一种有效、简便的分离技术，可以应用于多种复杂成分的精制纯化。现将MIL-100(Fe)材料应用于酱油渣中大豆异黄酮的富集精制，为酱油渣异黄酮的精制提供一条高效、环保、经济和工艺简单的方法途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何高效率地从酱油渣中提取纯度较高的大豆异黄酮。

为解决上述技术问题，本发明提出了一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法。

本发明提出一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：

S1、乙醇提取：以乙醇为溶剂与酱油渣混合，得到大豆异黄酮粗提取液；

S2、浓缩离心：将所述大豆异黄酮粗提取液浓缩、离心得到大豆异黄酮第一提取物；

S3、二氯甲烷萃取：将所述二氯甲烷与所述大豆异黄酮第一提取物混合，得到大豆异黄酮第二提取物；

S4、金属有机框架化合物吸附：将所述大豆异黄酮第二提取物与所述金属有机框架化合物混合，得到吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物。

进一步地，在步骤S4之后，还包括步骤：S5、解吸：将所述吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物用解吸液解吸，得到大豆异黄酮。

优选地，在步骤S1中，将所述酱油渣与所述乙醇按照质量比1:8-11混合。

优选地，在步骤S1中，将所述酱油渣与所述乙醇混合，在60℃-80℃下提取3-5h，得到所述大豆异黄酮粗提取液。

优选地，在步骤S1中，所述乙醇的体积浓度为60％-80％。

优选地，在步骤S3中，将所述二氯甲烷与所述大豆异黄酮第一提取物混合，之后真空浓缩得到浓缩液，之后洗涤所述浓缩液得到所述大豆异黄酮第二提取物。根据相似相溶原理，异黄酮可溶于二氯甲烷中，而总糖、灰分溶于水相中，分液后获得有机相即可除去总糖、灰分。

优选地，在步骤S4中，所述金属有机框架化合物为MIL-100(Fe)材料。

优选地，所述MIL-100(Fe)材料通过以下步骤制得：

将FeCl₃·6H₂O、均苯三甲酸及水混合超声处理5-15min，之后在150-160℃下加热12h-16h制得。

优选地，在步骤S5中，所述解吸液为乙醇、甲醇、正丁醇或者乙酸乙酯；所述甲醇的浓度优选为90％以上。

优选地，在步骤S5中，所述将所述吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物用所述甲醇解吸具体包括：将所述吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物与所述甲醇混合，进行超声处理15-25min，之后静止40min以上离心即可。

本发明与现有技术对比的有益效果包括：乙醇的极性与大豆异黄酮极性相近，可根据相似相溶的性质，使用乙醇对酱油渣中的大豆异黄酮进行提取，使得大豆异黄酮溶解至乙醇中，得到大豆异黄酮粗提取液，之后再采用浓缩离心法与二氯甲烷萃取法联用的方法对酱油渣大豆异黄酮粗提取液进行初步纯化；通过将大豆异黄酮粗提取液浓缩可除去乙醇，由于溶液极性的改变，大豆异黄酮疏水性较强，不溶于强极性的水中，得到大豆异黄酮沉淀物，而蛋白质仍留在水中，之后通过离心沉降取沉淀，洗涤沉淀及冷冻干燥，即可得到大豆异黄酮第一提取物，从而通过浓缩离心可有效除去大豆异黄酮粗提取液中的蛋白质，之后通过二氯甲烷萃取可较好的除去大豆异黄酮第一提取物中的总糖、灰分，这是因为根据相似相溶原理，异黄酮在二氯甲烷中分配系数较高，而总糖、灰分在水相中分配系数较高，分液后获得有机相即可除去总糖、灰分，得到大豆异黄酮第二提取物，两法联用可初步有效去除大豆异黄酮粗提液中的杂质，显著提高异黄酮的纯度；之后采用金属有机框架化合物吸附，进一步从大豆异黄酮第二提取物中吸附得到大豆异黄酮，金属有机框架化合物对酱油渣中大豆异黄酮因可以与大豆异黄酮通过氢键作用、与金属离子发生螯合作用、表面吸附或孔内吸附作用而对其有亲和力，可从酱油渣中选择性吸附苷元类异黄酮(染料木素、大豆素、大豆黄素)，特别地对染料木素吸附效果最佳；大豆异黄酮的回收率为80.31％，大豆异黄酮纯度高达56.17％。

附图说明

通过参考附图会更加清楚的理解本发明的特征和优点，附图是示意性的而不应理解为对本发明进行任何限制，在附图中：

图1为从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法的工艺流程图。

图2为MIL-100(Fe)材料吸附酱油渣中大豆异黄酮原理图。

图3为本发明实施例1中MIL-100(Fe)材料用量对静态吸附的影响结果图。

图4为本发明实施例1中大豆异黄酮第二提取物的浓度对静态吸附的影响结果图。

图5为本发明实施例1中不同解吸液对大豆异黄酮解吸率的影响结果图。

图6为本发明实施例1中不同浓度的甲醇对大豆异黄酮解吸率的影响结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

结合图1-2本具体实施方式提出一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：

S1、乙醇提取：将酱油渣与乙醇按照质量比1:8-11混合，在60℃-80℃下提取3-5h，得到大豆异黄酮粗提取液；其中，所述乙醇的体积浓度为60％-80％；

S2、浓缩离心：将所述大豆异黄酮粗提取液浓缩至液体为原体积的1/4-1/2，具体在60℃的旋转蒸发器中旋转蒸发至液体为原体积的1/4-1/2、之后在3500-4500r/min条件下离心，之后加水搅拌混合20min-30min再次离心，倒出水洗液，得到大豆异黄酮沉淀，将大豆异黄酮沉淀冷冻干燥得到大豆异黄酮第一提取物；

S3、二氯甲烷萃取：将所述第一提取物加入水使其分散于水中，之后加入等体积二氯甲烷，450-550rpm/min下搅拌0.5h-1h后，转移至分液漏斗中静止1h以上，分液，萃取3-4次，合并萃取的有机溶剂相，之后真空浓缩得到浓缩液，用蒸馏水洗涤浓缩液得到大豆异黄酮第二提取物；

S4、金属有机框架化合物吸附：将所述大豆异黄酮第二提取物与所述金属有机框架化合物混合，得到吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物；所述金属有机框架化合物优选为MIL-100(Fe)材料；

其中，所述MIL-100(Fe)材料通过以下步骤制得：

将FeCl₃·6H₂O、均苯三甲酸及水混合超声处理5-15min，之后在150-160℃下加热12h-16h制得。

S5、解吸：将所述吸附有大豆异黄酮的金属有机框架化合物与解吸液混合，进行超声处理15-25min，之后静止40min以上离心得到大豆异黄酮；所述解吸液为乙醇、甲醇、正丁醇或者乙酸乙酯；所述甲醇的浓度优选为90％以上。

为进一步说明本发明具体实施方式提出的方法，下面列举相关实施例进行详细说明。

实施例1

一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：

S1、乙醇提取：首先称取酱油渣100g，以体积浓度70％的乙醇，质量比1:9.5，在70℃下提取4h，得到大豆异黄酮粗提取液；

S2、浓缩离心：在60℃的旋转蒸发器中旋转蒸发至液体为原体积的1/4，然后将浓缩液在4000r/min条件下离心，离心后快速倒出上清液，而沉淀中加入100mL冷水，均匀搅拌混合20min，再次离心，倒出水洗液，得到沉淀，将异黄酮沉淀冷冻干燥，得到大豆异黄酮第一提取物；

S3、二氯甲烷萃取：将所得大豆异黄酮第一提取物加入适量水使其分散于水中，加入等体积的二氯甲烷，500rpm/min下搅拌0.5h后，转移至分液漏斗中静止1h，分液，萃取3次，合并三次萃取的有机溶剂相，对其进行真空浓缩，回收有机溶剂，并用适量的蒸馏水洗涤浓缩液得到大豆异黄酮第二提取物；

S4、金属有机框架化合物吸附：准确称取50mg的MIL-100(Fe)材料放于50mL离心管中，加入40mL的大豆异黄酮第二提取物，将离心管放置摇床上中振荡2h后，7000r/min离心10min；所述金属有机框架化合物为MIL-100(Fe)材料；

S5：吸附有的大豆异黄酮的MIL-100(Fe)材料留至离心管，加入50mL的解吸液进行解吸，进行超声处理20min，静止置1h后，7000r/min离心15min，收集解吸液，对解吸液进行体积和异黄酮的浓度的测定，旋转蒸发至浸膏，干燥处理称重即获得大豆异黄酮，最后计算精制纯化物中的大豆异黄酮纯度及回收率。

其中，所述MIL-100(Fe)材料通过以下步骤制得：

准确称取2.7g FeCl₃·6H₂O、1.4g均苯三甲酸到120mL聚四氟乙烯内衬反应釜内胆中，而后加入60mL超纯水混合，将内胆放入超声波清洗机中超声10min；

超声完毕后，将反应釜内胆置于高压反应釜，拧紧盖子，而后放入电热恒温鼓风干燥箱中于150℃加热12h；

加热完毕后快速冷却，将浅橙色固体去除并加入到离心管中离心(6000r/8min)；去除上清后用80℃超纯水与60℃乙醇进行两步反复洗涤离心，直到上清变得澄清透明；取出固体在80℃干燥后，将MIL-100(Fe)材料放入真空干燥箱在150℃的真空中干燥过夜。

MIL-100(Fe)材料精制大豆异黄酮的方法体系建立：

(1)MIL-100(Fe)材料用量对静态吸附的影响

按照步骤S4的吸附方法，分别准确称取20、30、40、50、60、70、80、90、100mg MIL-100(Fe)材料于离心管中，再加入40mL大豆异黄酮第二提取物，超声20min，摇床上吸附2h后，7000r/min离心10min，测定上清液异黄酮黄酮含量，计算MIL-100(Fe)材料用量对大豆异黄酮的吸附量，结果如图3所示，60mg的MIL-100(Fe)材料吸附效果最好，超过60mgMIL-100(Fe)材料对大豆异黄酮的吸附量几乎不变。

(2)样品初始浓度对静态吸附的影响

将大豆异黄酮第二提取物配制成22.37、44.75、67.12、89.49、134.25、201.38mg/L不同浓度的样品液，加入40mg MIL-100(Fe)材料于离心管中，再加入40mL样品液，超声20min，吸附2h后，7000r/min离心10min，测定上清液异黄酮含量，计算MIL-100(Fe)材料对异黄酮的吸附量，结果如图4所示，样品初始浓度为134.25mg/mL时，吸附效果最好。

(3)最佳解吸条件的确定

将吸附平衡之后MIL-100(Fe)材料按步骤S5进行解吸实验，考察不同的解吸液(乙醇、甲醇、正丁醇和乙酸乙酯)以及最佳解吸液浓度对MIL-100(Fe)材料解吸性能的影响，测定在不同浓度的解吸液下异黄酮的含量，由此计算相应的解吸率，结果如图5和6所示，甲醇的吸附效果最好，体积浓度100％甲醇的吸附效果最好。

最佳静态吸附及解吸条件为：吸附时间为120min，MIL-100(Fe)材料用量为60mg，样品初始浓度为134.25mg/mL，最佳的解吸液为100％甲醇，解吸时间为60min。按照此最佳静态吸附条件及解吸条件对酱油渣中的大豆异黄酮进行精制，MIL-100(Fe)材料对大豆异黄酮的吸附量达到48.13mg/g，吸附率达84.65％，所得大豆异黄酮纯度为56.17％。

实施例2

一种从酱油渣中提取大豆异黄酮的方法，包括以下步骤：

S1、乙醇提取：首先称取酱油渣1kg，以体积浓度70％的乙醇，质量比1:9.5，在70℃下提取4h，得到大豆异黄酮粗提取液；

S2、浓缩离心：在60℃的旋转蒸发器中旋转蒸发至液体为原体积的1/4，然后将浓缩液在4000r/min条件下离心，离心后快速倒出上清液，而沉淀中加入1L冷水，均匀搅拌混合20min，再次离心，倒出水洗液，得到沉淀，将异黄酮沉淀冷冻干燥，得到大豆异黄酮第一提取物；

S3、二氯甲烷萃取：将所得大豆异黄酮第一提取物加入适量水使其分散于水中，加入等体积的二氯甲烷，500rpm/min下搅拌0.5h后，转移至分液漏斗中静止1h，分液，萃取3次，合并三次萃取的有机溶剂相，对其进行真空浓缩，回收有机溶剂，并用适量的蒸馏水洗涤浓缩液，得到大豆异黄酮第二提取物；

S4、金属有机框架化合物吸附：准确称取400mg的MIL-100(Fe)材料放于500mL离心管中，加入400mL的大豆异黄酮第二提取物，将离心管放置摇床上中振荡2h后，7000r/min离心10min；所述金属有机框架化合物为MIL-100(Fe)材料；

S5：吸附有的大豆异黄酮的MIL-100(Fe)材料留至离心管，加入500mL的纯甲醇进行解吸，进行超声处理20min，静止置1h后，7000r/min离心15min，收集解吸液，对解吸液进行体积和异黄酮的浓度的测定，旋转蒸发至浸膏，干燥处理称重即获得大豆异黄酮，最后计算精制纯化物中的大豆异黄酮纯度及回收率。

其中，所述MIL-100(Fe)材料通过以下步骤制得：

准确称取27g FeCl₃·6H₂O、14g均苯三甲酸到聚四氟乙烯内衬反应釜内胆中，而后加入600mL超纯水混合，将内胆放入超声波清洗机中超声10min；

超声完毕后，将反应釜内胆置于高压反应釜，拧紧盖子，而后放入电热恒温鼓风干燥箱中于150℃加热12h；

加热完毕后快速冷却，将浅橙色固体去除并加入到离心管中离心(6000r/8min)；去除上清后用80℃超纯水与60℃乙醇进行两步反复洗涤离心，直到上清变得澄清透明；取出固体在80℃干燥后，将MIL-100(Fe)材料放入真空干燥箱在150℃的真空中干燥过夜。

其他有益效果：

1)发明制备了MIL-100(Fe)材料，利用其多孔性、丰富的活性位点、比表面积大的特点对酱油渣中大豆异黄酮进行富集精制。用MIL-100(Fe)材料对大豆异黄酮第二提取物进行大豆异黄酮的精制，确定了最佳的吸附、解吸条件，从而建立一种从酱油渣中精制大豆异黄酮的方法体系。本发明采用的MIL-100(Fe)材料相较于传统方法，减少了提取溶剂残留的问题，材料可重复使用，对苷元类大豆异黄酮有选择性吸附的效果，并且所得大豆异黄酮的回收率高且纯度较高。

2)本发明利用金属有机框架MIL-100(Fe)材料对大豆异黄酮具有选择性吸附作用，MIL-100(Fe)材料对具有较高活性的苷元类异黄酮有较好的亲和性，能从酱油渣中选择性吸附染料木素、大豆素和大豆黄素，其中对染料木素的选择性吸附效果最显著。

3)金属有机框架MIL-100(Fe)材料对苷元类异黄酮可通过氢键作用、与金属离子发生螯合作用、表面吸附或孔内吸附的空间尺寸排阻作用而产生选择性吸附，有效地将苷元类异黄酮与酱油渣中的其他成分分离开来，达到精制大豆异黄酮的目的。

4)本发明应用金属有机框架MIL-100(Fe)材料对酱油渣中大豆异黄酮进行精制，利用该材料大的比表面积、多孔表面、丰富的活性位点、吸附量大、可设计性强等优点对工业生产副产物—酱油渣进行再利用，解决了其污染环境、利用率低的问题，达到了绿色、经济生产的效果。

5)本发明所提供的MIL-100(Fe)材料对苷元类大豆异黄酮有富集吸附效果，且材料分散性、耐热性好；MIL-100(Fe)材料可重复使用至少5次，吸附、解吸效果仍能良好保持。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。