阅读说明：本技术 一种dna甲基化检测粪便采样装置、保存液及其方法 (Excrement sampling device, preservation solution and method for DNA methylation detection ) 是由 钟玙沄 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种DNA甲基化检测粪便采样装置、保存液及其方法。本发明中的DNA甲基化检测粪便采样装置包括：双向贯通的筒体；筒内贯穿设置有顶杆；顶杆位于筒内的一端固定连接有活塞；活塞与筒体内侧壁滑动连接。该粪便采集装置及本发明中的保存液克服了目前市场上该领域产品的空白,既可以有效保存DNA以及其中甲基化特征,又可以提高用于粪便DNA甲基化检测的样本采集的可靠性及有效性,进一步大规模进行肠癌粪便DNA甲基化筛查提供帮助。(The invention discloses a DNA methylation detection excrement sampling device, preservation solution and a method thereof. The DNA methylation detection feces sampling device comprises: a cylinder body which is communicated in two directions; a mandril penetrates through the cylinder; one end of the ejector rod positioned in the cylinder is fixedly connected with a piston; the piston is connected with the inner side wall of the cylinder in a sliding manner. The excrement collecting device and the preservation solution overcome the blank of products in the field in the current market, can effectively preserve DNA and methylation characteristics in the DNA, can improve the reliability and effectiveness of sample collection for excrement DNA methylation detection, and further provide help for large-scale intestinal cancer excrement DNA methylation screening.)

一种DNA甲基化检测粪便采样装置、保存液及其方法

技术领域

本发明涉及粪便分子检测领域，具体涉及一种DNA甲基化检测粪便采样装置、保存液及其方法。

背景技术

结直肠癌是我国发病率和死亡率位居第5的恶性肿瘤。对于结直肠癌的早期诊断和筛查能有效降低恶性肿瘤死亡率。粪便DNA甲基化检测是无创、高灵敏、高特异的检测手段，明显优于目前的肠镜以及大便隐血试验，其有效性已经写入美国结直肠癌筛查指南以及中国结直肠癌筛查专家共识中。

粪便DNA甲基化检测的精准程度在一定程度上受到粪便样本的采集以及其中DNA甲基化特征的保存情况的的影响。目前粪便保存的常用方法是液氮速冻，在-20℃～-80℃保存后的粪便样品，无疑加大了试验的可操作性，不能适用于多样的采集环境。而且常见的粪便保存液，稳定性较差，即使可用于常温保存，也无法保证样品中DNA甲基化特征的保存情况。

而且，目前市面上并未有专利以及技术专门对用于DNA甲基化检测的粪便样本采集及保存。常规的粪便保存液及采集器均具有较高的检测失败率，且不能够方便快捷地衡量采集粪便样本。

由于粪便内人来源的DNA所占比例较少，因此，需要采集粪便的量相对于目前的粪便隐血试验明显增高。现在市场上常见的粪便采集装置主要是用于大便隐血试验，主要的问题在于：1)采集量少；2)由于粪便的黏稠性导致每次取量大小不一。

因此，为了解决上述缺陷，需要一种快捷有效的DNA甲基化检测粪便采样装置、保存液及其方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种DNA甲基化检测粪便保存液；

本发明的另一目的在于提供一种DNA甲基化检测粪便采样装置；

本发明的另一目的在于提供一种DNA甲基化检测粪便采集方法；

本发明的另一目的在于提供上述粪便保存液在粪便DNA甲基化检测中的应用；

本发明的另一目的在于提供上述粪便保存液在制备结直肠癌粪便DNA诊断与筛查试验产品中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种DNA甲基化检测粪便保存液，该粪便保存液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)、氯化钠(NaCl)、硫酸铵、乙二胺四乙酸(EDTA)。

进一步地，上述粪便保存液的组分的浓度为：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液10-1000mM、氯化钠1-10mM、硫酸铵1-100mM、乙二胺四乙酸1-100mM。

更进一步地，上述粪便保存液的组分的浓度为：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液50-150mM、氯化钠1-10mM、硫酸铵1-100mM、乙二胺四乙酸1-100mM。

本发明的第二个方面，提供：

一种DNA甲基化检测粪便采样装置，该粪便采样装置包括：

双向贯通的筒体；

筒内贯穿设置有顶杆；

顶杆位于筒内的一端固定连接有活塞；

顶杆与筒内壁有卡槽限制活塞的活动范围；

活塞与筒体内侧壁滑动连接。

进一步地，上述顶杆位于筒外的一端固定连接有按块。

发明人发现，本发明的采集装置可提取的粪便DNA浓度和纯度都明显优于目前市场上的采集装置。

本发明的第三个方面，提供：

一种DNA甲基化检测粪便采集方法，该粪便采集方法步骤包括：

将上述的粪便采样装置***粪便样品中，使粪便样品进入装置内；

将装置内的粪便样品转移至上述的粪便保存液中；

对粪便保存液中的粪便样品进行DNA甲基化检测。

进一步地，上述粪便保存液与粪便样品的体积比为(3-7)：(1-3)。

进一步地，上述粪便采样装置装纳的粪便样品的质量为1-20g。

本发明的第四个方面，提供：

上述粪便保存液在粪便DNA甲基化检测中的应用。

DNA异常甲基化是恶性肿瘤发生发展的早期事件，是恶性肿瘤的检测指标之一。

本发明的第五个方面，提供：

上述粪便保存液在制备结直肠癌诊断与筛查试验产品中的应用。

由于粪便DNA甲基化检测比临床上主要用的粪便隐血试验更加精准，特别是在腺瘤等癌前病变的检测上。因此，粪便DNA甲基化检测是国民肠癌筛查的重要工具。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的粪便DNA甲基化检测的粪便采集装置及保存液克服了目前市场上该领域产品的空白，创造并提供了一种可用于粪便DNA甲基化检测的粪便采集装置及保存液，本发明中的采集装置能方便快捷地衡量采集粪便样本。

2.本发明中的粪便DNA甲基化检测的保存液可以有效保存DNA以及其中甲基化特征，可以提高用于粪便DNA甲基化检测的样本采集的可靠性及有效性，同时提高用于检测DNA甲基化的DNA样本的保存，为进一步大规模进行肠癌粪便DNA甲基化筛查提供帮助。

附图说明

图1为本发明的DNA甲基化检测粪便采样装置示意图；

图2为本发明的粪便采样装置***粪便样品的示意图；

图3为将本发明的装置内的粪便样品转移至粪便保存液中的示意图；

图4为甲基化荧光定量PCR检测结果；

图5为本发明保存液保存的粪便样本的时间性能测试结果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1DNA甲基化检测粪便保存液的制备

一种DNA甲基化检测粪便保存液，该粪便保存液的组分的浓度为：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液10-1000mM、氯化钠1-10、硫酸铵1-100mM、乙二胺四乙酸1-100mM。

该DNA甲基化检测粪便保存液的制备方法，其步骤如下：

用纯水将三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化钠、硫酸铵、乙二胺四乙酸溶解并稀释至上述浓度；

混合，即得DNA甲基化检测粪便保存液。

实施例2DNA甲基化检测粪便保存液的制备

一种DNA甲基化检测粪便保存液，该粪便保存液的组分的浓度为：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液50-150mM、氯化钠1-10、硫酸铵1-100mM、乙二胺四乙酸1-100mM。

该DNA甲基化检测粪便保存液的制备方法如实施例1所示。

实施例3一种DNA甲基化检测粪便采样装置

如图1所示，该DNA甲基化检测粪便采样装置包括：

双向贯通的筒体；

筒内贯穿设置有顶杆；

顶杆位于筒内的一端固定连接有活塞；

顶杆与筒内壁有卡槽限制活塞的活动范围；

活塞与筒体内侧壁滑动连接。

实施例4一种DNA甲基化检测粪便采集方法

一种DNA甲基化检测粪便采集方法，该粪便采集方法步骤包括：

将上述的粪便采样装置***粪便样品中，使粪便样品进入装置内(图2)；

将装置内的粪便样品转移至上述的粪便保存液中(图3)；

对粪便保存液中的粪便样品进行DNA甲基化检测。

DNA甲基化检测效果验证

粪便采集装置：

本实施例中使用的市场上粪便采集装置1为江苏华能医疗器械有限公司的粪便采集器，购自江苏华能医疗器械有限公司。

根据实施例4所述的方法，使用本发明粪便采集装置和市场上粪便采集装置1采集同一粪便样品，样品1-9为9份随机体检人员粪便样本。本发明中将采集器竖直***粪便，并左右旋转，而后打入收集管中。市场上采集器勺取或蘸取样品，置于同种保存液中，进行粪便DNA浓度和纯度检测。

结果如表1所示。

表1本发明粪便采集装置和市场上粪便采集装置1采集粪便DNA浓度和纯度结果

结果显示，本发明采集装置可提取的粪便DNA浓度和纯度都明显优于目前市场上的采集装置。

粪便保存液：

本实施例中的市面上的保存液1为江苏华能医疗器械有限公司的粪便保存液，主要成分为NaCl，购自江苏华能医疗器械有限公司。

本实施例中的市面上的保存液2为深圳华晨阳科技有限公司的粪便保存液，主要成分为hanks液、谷氨酸钠、甘氨酸，购自深圳华晨阳科技有限公司。

根据实施例4所述的方法，采集同一粪便，分别置于本发明保存液、市面上的保存液1、市面上的保存液2和无水乙醇(对照)中，进行甲基化荧光定量PCR检测(内参基因GADPH)。

甲基化荧光定量PCR检测步骤如常规技术。

结果如图4-5所示。

结果显示，对比市场上现有保存液以及无水乙醇，通过粪便保存液保存并提取的粪便DNA，进行甲基化荧光定量PCR检测，其内参基因GADPH CT值明显优于现有保存液以及无水乙醇(图4)。而且，性能测试显示，该保存液可在常温下保存粪便样本达96小时不降解(图5)。

因此，基于上述结果，本发明中的粪便DNA甲基化检测的保存液可以有效保存DNA以及其中甲基化特征，可以提高用于粪便DNA甲基化检测的样本采集的可靠性及有效性，以此可以用于检测DNA甲基化的DNA样本的保存，并进一步大规模应用于进行肠癌粪便DNA甲基化筛查。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。