阅读说明：本技术 Egfr二聚体干扰物及其用途 (EGFR dimer disruptors and uses thereof ) 是由 穆克什·K·尼亚蒂 西奥多·S·劳伦斯 克里斯托弗·怀特黑德 詹森·克里斯托弗·雷希 布雷南 于 2019-02-25 设计创作，主要内容包括：本文提供了调节EGFR的化合物以及使用所述化合物例如治疗癌症的方法。(Provided herein are compounds that modulate EGFR and methods of using the compounds, for example, to treat cancer.)

EGFR二聚体干扰物及其用途

背景技术

EGFR小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼作为治疗具有体细胞突变(如L858R或外显子19缺失，即E746-A750缺失)的肺腺癌的单药最为成功，所述体细胞突变赋予对此类药物的敏感性，根据种族和性别的不同，这种肺腺癌会在7-20％的患者中发生(19)。不幸的是，反应很少持续超过一年，因为几乎所有患者都对治疗产生耐药性(20)。第三代不可逆抑制剂奥希替尼(AZD9291)可有效治疗未经治疗的患者以及对第一代或第二代TKI产生耐药性的患者(7)。然而，在用奥希替尼治疗的一年内，大多数患者在EGFR激酶结构域中发生了另一个突变(C797S)，所述结构域是药物结合位点(12、21、22)。尽管已经报道了靶向奥希替尼耐药性EGFR的几种方法(12、13、23)，但截至目前，这些具有C797S突变的患者尚无TKI治疗选择。化疗是唯一的选择。

鉴于前述内容，需要以除抑制EGFR酪氨酸激酶活性以外的方式靶向EGFR的癌症治疗剂。还需要一种治疗癌症的治疗剂，该治疗剂在初次使用后不会产生耐药性。

发明内容

本文提供了用于调节EGFR的化合物和方法。更具体地说，提供了EGFR调节剂以及这种调节剂在治疗或预防与异常EGFR活性有关的疾病或病症(例如，癌症)中的用途。

在一方面，本公开提供了式I化合物或其药学上可接受的盐：

其中X为O-C_0-6亚烷基、S-C_0-6亚烷基或NR³-C_0-6亚烷基，并且所述亚烷基为X为O-C_0-6亚烷基、S-C_0-6亚烷基或NR³-C_0-6亚烷基，并且所述亚烷基任选地被1-3个独立地选自卤基、N(R³)₂和OR³的基团取代；Y为C_0-6亚烷基，并且所述亚烷基任选地被1-3个独立地选自卤基、N(R³)₂和OR³的基团取代；A为C_6-10芳基或具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基，并且所述芳基或杂芳基任选地被1到3个R⁴取代；B为C_6-10芳基、具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基、3-8元环烷基环或具有1-3个选自O、S和N的环杂原子的3-12元杂环烷基，并且所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被1到3个R⁵取代；R¹和R²各自独立地为C_1-6烷基，或R¹和R²与其所连接的碳原子一起形成4-8元环烷基或杂环烷基环，其中所述杂环烷基环具有1个或2个选自O、S和N的环杂原子，并且其中所述环烷基环或杂环烷基环任选地被1-2个R⁶取代；每个R³独立地为H或C_1-6烷基；每个R⁴和R⁵独立地为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、卤基或C_1-6烷氧基；并且R⁶为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、(C＝O)R³、(C＝O)OR³、CON(R³)₂、C_0-3亚烷基-C_3-8环烷基、C_0-3亚烷基-C_6-10芳基或C_0-3亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中所述芳基或杂芳基任选地被1到3个R⁵取代。

本文进一步提供了使用所公开的化合物调节EGFR的方法。本公开的其它方面包含使用所公开的化合物抑制EGFR二聚化的方法，以及使用所公开的化合物诱导EGFR降解的方法。

本公开的其它方面包含如本文所公开的化合物，其用于制备用于在受试者中治疗或预防与异常EGFR活性有关的疾病或病症的药物，以及如本文公开的化合物的用途，其用于在受试者中治疗或预防与异常EGFR活性有关的疾病或病症的方法。

附图说明

图1示出了(左)用小肽进行的处理，与邻近的正常组织相比，所述小肽更能抑制EGFR二聚化作用的肿瘤(标有*)特异性EGFR；以及(右)EGFR降解示意图。EGFR显示为通过跨膜部分连接至双叶激酶结构域的细胞外结构域(小斑点＝n-叶，大斑点＝c-叶)和柔性C端尾。EGF结合促进细胞外结构域之间和/或两个单体的n-叶和c-叶之间的活性(不对称)二聚体形成。处于这种构象的EGFR保持稳定并诱导C端尾的磷酸化，从而促进肿瘤进展酪氨酸激酶抑制剂(例如奥希替尼)，抑制ATP募集并促进两个单体的n-叶之间的非活性(对称)二聚化。处于这种构象的EGFR保持激酶失活构象，但保持蛋白质稳定性。EGFR活性的失活与肿瘤生长抑制相关。EGFR的c-叶的αC-螺旋和β4-折叠与n-叶的h-螺旋与之间的环参与EGF诱导的活性二聚体形成。该模型假定干扰素(Disruptin)或化合物8C结合在该囊中，并干扰EGF诱导的活性二聚体形成。与配体和化合物8C结合的EGFR单体迅速降解。EGFR蛋白质的丢失与细胞死亡相关。箭头的粗细显示了化合物8C在肿瘤细胞与正常细胞中的影响。

图2示出了(A)EGFR的不对称活性二聚体的示意图。EGFR的一种与EGF结合的单体足以诱导二聚化。插图中示出了与EGFR的c-叶结合的干扰素的模型(PDB代码：2RFD)，以及(B)经过纯化的EGFR激酶结构域与干扰素之间假定的相互作用。

图3示出了(A)干扰素处理对NCI-H1975细胞中EGF诱导的二聚化的影响；(B)干扰素对其在NCI-H1975异种移植物中的靶EGFR的影响；(C)干扰素在体内的功效；以及(D)处理对肿瘤组织学、EGFR表达和有丝***指数的长期影响(通过Ki-67评分测量)。

图4示出了(A)用于预筛选先导化合物的过程，以及两种预先导化合物C95和C67的结构；(B)得到的SAR以及微粒体稳定性(在蓝色框中显示)，以及选择性最高的有效分子(化合物8C)的结构；(C)两种预先导化合物8C对厄洛替尼耐药性NCI-H1975肺癌细胞系中EGF刺激的EGFR二聚化的影响，如图3A所示(制备了裂解液并用抗EGFR抗体进行了免疫印迹)；以及(D)在处理后24小时评估的所选的三种先导分子(1μM)对稳态EGFR蛋白质的影响。

图5示出了(A)化合物8C与干扰素的竞争性EGFR结合；(B)通过热稳定性测定证实的化合物8C对经过纯化的EGFR的热稳定性的影响；以及(C)在存在0到10μM化合物8C的情况下，化合物8C的浓度对EGFR在44℃下的热稳定性的影响。

图6示出了(A)来自Ba/F3-AZD细胞的全细胞裂解物中化合物8C对EGFR热稳定性的影响；(B)针对表达特定EGFR突变的奥希替尼耐药性Ba/F3细胞测量的化合物8C的效力；(C)化合物8C对EGF诱导的EGFR二聚化的影响，如图3A所示；(C-D)化合物8C处理对EGFR诱导的二聚体和EGFR蛋白质水平的影响；(E)由两种奥希替尼耐药性Ba/F3细胞系制成表的响应于厄洛替尼、奥希替尼和化合物8C的IC₅₀值。

图7示出了(A)针对一组奥希替尼耐药性细胞确定的化合物8C的特异性和效力，并使用克隆形成存活测定法与正常肺成纤维细胞(MRC5)进行了比较；(B)化合物8C的浓度对奥希替尼耐药性PC9细胞中EGF诱导的EGFR二聚化的影响，如图6所示；(C)化合物8C处理对PC9-AZR细胞中EGFR诱导的二聚体和EGFR蛋白质水平的影响。

图8示出了(A)在携带人NCI-H1975肿瘤异种移植物(>150mm³)的裸鼠中腹膜内给予的单一100mg/kg剂量的化合物8C的药代动力学；以及(B)在携带人NCI-H1975肿瘤异种移植物(>150mm³)的裸鼠中通过口服灌胃给予的单一100mg/kg剂量的化合物8C的药代动力学。

图9示出了(A)在携带NCI-H1975异种移植物的小鼠中的基础生物发光和预先导化合物95对不同时间点的影响；以及(B)生物发光的量化和绘图变化。

图10示出了携带UMSCC74B的裸鼠的平均肿瘤体积随时间的变化，头颈肿瘤模型(约100mm²)，并用化合物8C(每天30mg/kg，持续一周)或媒剂(5％DMSO，于PBS中)进行处理。每组至少有5只小鼠。每周记录3-4次肿瘤体积和体重，并作图。处理期间体重的平均损失小于10％。误差条表示平均值的标准误差。

图11示出了化合物8C在奥希替尼耐药性肿瘤模型中的影响。用媒剂、奥希替尼或化合物8C处理患有奥希替尼耐药性Ba/F3腹水瘤的裸鼠。通过免疫印迹确定处理对EGFR、pEGFR和其它分子的影响。

图12示出了原发性肿瘤、UMLCA7的第1和第2异种移植物中FFPE-肺PDX的病理学评估，以及在另外两个PDX中使用IHC进行的EGFR蛋白质表达的分析。注意，在鳞状细胞癌(UMLT16)中有大量的EGFR表达，而在大细胞癌(UMLT14)PDX样品(20X)中则没有。

图13显示，用化合物8C处理小鼠胰腺癌模型显示出显著降低的发展为PanIn(胰腺上皮内瘤变)(一种胰腺导管病变)的倾向。胰腺组织的病理组织学检查显示，与对照组(以B量化)相比，经处理的小鼠的病变受累明显减少。

图14显示，与接受处理媒剂或西妥昔单抗的对照小鼠相比，用化合物8C处理的携带UMSCC74B头颈肿瘤模型的小鼠异种移植物显示出明显更小的肿瘤。

具体实施方式

尽管使用小分子和抗体抑制致癌蛋白的激酶活性一直是抗癌药物开发工作的主要手段，从而导致了几种FDA批准的癌症治疗方法，但靶向激酶的药剂的临床疗效一直不一致(22，24)。EGFR除具有酪氨酸激酶活性外，还显示出支架功能(24-36)。这可以通过表达EGFR的激酶死亡(KD)突变体(例如K745A、V741G和Y740F)或通过在不表达这些受体的Ba/F3细胞中表达ErbB3(无激酶活性)来证明(37-39)。这些激酶缺陷型突变体的表达促进细胞存活，这表明这些受体仍可能通过形成二聚体而传递存活信号，这意味着EGFR具有超出了激酶活性的功能(39)。

当与单体相比时，已知EGFR二聚体是相对稳定的(40)。二聚体能够产生下游的促有丝***信号(41)。不受理论的束缚，假设阻断EGFR二聚化会加速EGFR的降解，并且这种方法将有效抵抗由TKI耐药性EGFR驱动的肿瘤(14、24、27)。简而言之，证明了与EGF结合的EGFR(在大多数肿瘤中普遍存在的磷酸化EGFR)蛋白质稳定性受二聚体形成的调节，所述二聚体通过位于EGFR激酶结构域的c-叶的αC螺旋和β4折叠与n-叶的h-螺旋之间的EGFR激酶结构域中的片段形成(15，42)。正常细胞中的EGFR蛋白质稳定性主要不受此二聚体界面的调节，因为在没有EGF的情况下，EGFR不会形成不对称的二聚体(43)。肿瘤细胞与正常细胞之间的这种差异提供了新的可靶向的蛋白质-蛋白质相互作用。

为了检验这个想法，产生了十几种模拟该结合表面的肽。最有效的肽含有来自EGFR的αC-β4环的六个氨基酸，其被称为干扰素(17)。干扰素能够抑制EGF诱导的EGFR二聚化。这种肽直接与EGFR结合，与对照肽(乱序肽)相比，重复进行HEPES洗涤不会明显影响该结合。尽管干扰素在酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药性肺异种移植物模型中有效(14)，但在人体内传递肽仍然具有挑战性(44)。

本文提供了调节EGFR的化合物，例如，阻断EGFR二聚化、诱导EGFR降解并杀死EGFR驱动的细胞的化合物。这些化合物可用于预防或治疗多种疾病和病症，例如用于治疗癌症。

因此，本文提供了具有式I结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中

X为O-C_0-6亚烷基、S-C_0-6亚烷基或NR³-C_0-6亚烷基，并且所述亚烷基任选地被1-3个独立地选自卤基、N(R³)₂和OR³的基团取代；

Y为C_0-6亚烷基，并且所述亚烷基任选地被1-3个独立地选自卤基、N(R³)₂和OR³的基团取代；

A为C_6-10芳基或具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基，并且所述芳基或杂芳基任选地被1到3个R⁴取代；

B为C_6-10芳基、具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基、3-8元环烷基环或具有1-3个选自O、S和N的环杂原子的3-12元杂环烷基，并且所述芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被1到3个R⁵取代；

R¹和R²各自独立地为C_1-6烷基，或R¹和R²与其所连接的碳原子一起形成4-8元环烷基或杂环烷基环，其中杂环烷基环具有1个或2个选自O、S和N的环杂原子，并且其中所述环烷基环或杂环烷基环任选地被1-2个R⁶取代；

每个R³独立地为H或C_1-6烷基；

每个R⁴和R⁵独立地为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、卤基或C_1-6烷氧基；并且

R⁶为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、(C＝O)R³、(C＝O)OR³、CON(R³)₂、C_0-3亚烷基-C_3-8环烷基、C_0-3亚烷基-C_6-10芳基或C_0-3亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中芳基或杂芳基任选地被1到3个R⁵取代。

在各个实施例中，R¹和R²各自独立地为C_1-6烷基。在一些实施例中，R¹和R²各自为甲基。

在各个实施例中，R¹和R²与其所连接的碳原子一起形成4-8元环烷基或杂环烷基环。在一些实施例中，R¹和R²与其所连接的碳原子一起形成5元或6元环烷基或杂环烷基环。在一些实施例中，R¹和R²与其所连接的碳原子一起形成环己基环。

在各个实施例中，R¹和R²与其所连接的碳原子一起形成具有以下结构的杂环烷基环：

其中*表示与式I化合物的其余部分的连接点。在一些实施例中，R⁶为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、(C＝O)R³、(C＝O)OR³、CON(R³)₂、C_0-3亚烷基-C_3-8环烷基、C_0-3亚烷基-C_6-10芳基或C_0-3亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中芳基或杂芳基任选地被1到3个R⁵取代。在一些实施例中，R⁶为C_1-6烷基、(C＝O)R³、(C＝O)OR³或CON(R³)₂。在一些实施例中，R⁶为C_1-6烷基。在一些实施例中，R⁶为甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基或异戊基。在一些实施例中，R⁶为甲基。在一些实施例中，R⁶是氘化的。在一些实施例中，R⁶为C_1-6卤代烷基。在一些实施例中，R⁶为3,3,3-三氟丙基。在一些实施例中，R⁶为C_0-3亚烷基-C_3-8环烷基。在一些实施例中，R⁶为环丁基、环戊基或环己基。在一些实施例中，R⁶为环丁基或环戊基。在一些实施例中，R⁶为C_0-3亚烷基-C_6-10芳基。在一些实施例中，R⁶为苄基。在一些实施例中，R⁶为C_0-3亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中所述杂芳基任选地被1到3个R⁵取代。在一些实施例中，R⁶为C₁亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中所述杂芳基任选地被1到3个R⁵取代。在一些实施例中，R⁶为C_0-3亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中所述杂芳基被1到3个R⁵取代。在一些实施例中，R⁶为C_0-3亚烷基-(具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基)，其中所述杂芳基是未经取代的。在一些实施例中，R⁶为

在各个实施例中，A为C_6-10芳基。在一些实施例中，A为苯基。

在各个实施例中，B为C_6-10芳基。在一些实施例中，B为苯基。在各个实施例中，B为具有1-4个选自N、O和S的杂原子的5-10元杂芳基。在一些实施例中，B为吡啶基。在一些实施例中，B为喹啉基。在各个实施例中，B为3-8元环烷基。在一些实施例中，B为5元或6元环烷基。在各个实施例中，B为具有1-3个选自O、S和N的环杂原子的3-12元杂环烷基。

在一些实施例中，A被一个R⁴取代。在一些实施例中，A具有以下结构：

在一些实施例中，A被两个R⁴取代。在一些实施例中，至少一个R⁴为C_1-6烷基。在一些实施例中，至少一个R⁴为甲基。在一些实施例中，至少一个R⁴为卤基。在一些实施例中，R⁴为溴。在一些实施例中，至少一个R⁴为C_1-6烷氧基。在一些实施例中，至少一个R⁴为甲氧基。

在一些实施例中，B被一个R⁵取代。在一些实施例中，B被两个R⁵取代。在一些实施例中，B具有结构

在一些实施例中，至少一个R⁵为卤基。在一些实施例中，至少一个R⁵为氟或氯。在一些实施例中，一个R⁵为氟，而另一个R⁵为氯。在一些实施例中，至少一个R⁵为C_1-6烷氧基。在一些实施例中，至少一个R⁵为甲氧基。在一些实施例中，一个R⁵为卤基，而另一个R⁵为C_1-6烷氧基。在一些实施例中，一个R⁵为氯，而另一个R⁵为甲氧基。

在一些实施例中，每个R⁴和R⁵独立地为C_1-6烷基、卤基或C_1-6烷氧基。在一些实施例中，R⁶为C_1-6烷基、(C＝O)R³、(C＝O)OR³或CON(R³)₂。

在各个实施例中，X为O-C_0-6亚烷基或S-C_0-6亚烷基。在一些实施例中，X为S-C_0-6亚烷基。在一些实施例中，X为O、S、O-CH₂-或S-CH₂-。在各个实施例中，Y为C_0-2亚烷基。在一些实施例中，Y为空或CH₂。在一些实施例中，X为NR³-CH₂、O-CH₂-或S-CH₂-，并且Y为空。在一些实施例中，X为NR³-CH₂、O-CH₂-或S-CH₂-，并且Y为CH₂。在一些实施例中，R³是H。

设想的特定化合物包含表1、表2所列的化合物或其药学上可接受的盐：

表1

表2

在某些情况下，该化合物是表1中所列的化合物或其盐。

化合物8C显示出药理学性质以及生物学活性的显著改善(46分钟内的微粒体半衰期，克隆形成细胞测定法中的亚微摩尔IC₅₀)。化合物8C抑制EGF诱导的EGFR二聚化，直接与经过纯化的EGFR结合，并在EGFR驱动的奥希替尼耐药性细胞系和异种移植物模型中有选择地活跃。

定义

如本文所使用的，术语“烷基”是指含有一到三十个碳原子(例如，一到二十个碳原子或一到十个碳原子)的直链和支链饱和烃基。术语C_n表示烷基具有“n”个碳原子。例如，C₄烷基是指具有4个碳原子的烷基。C₁-C₇烷基是指具有涵盖整个范围(例如，1到7个碳原子)以及所有子范围(例如，1-6个、2-7个、1-5个、3-6个、1个、2个、3个、4个、5个、6个和7个碳原子)的碳原子数的烷基。烷基的非限制性实例包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基(2-甲基丙基)、叔丁基(1,1-二甲基乙基)、3,3-二甲基戊基和2-乙基己基。除非另有说明，否则烷基可以是未经取代的烷基或经取代的烷基。

本文使用的术语“亚烷基”是指具有取代基的烷基。例如：术语“亚烷基卤代”是指被卤基取代的烷基。亚烷基可以是-CH₂CH₂-或-CH₂-。术语C_n表示亚烷基具有“n”个碳原子。例如，C_1-6亚烷基是指具有涵盖整个范围以及所有子范围的碳原子数的亚烷基，如先前针对“烷基”基团所述。除非另有说明，否则亚烷基可以是未经取代的亚烷基或经取代的亚烷基。

如本文所使用的，术语“环烷基”是指含有三到八个碳原子(例如，3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子)的脂肪族环状烃基。术语C_n表示环烷基具有“n”个碳原子。例如，C₅环烷基是指在环中具有5个碳原子的环烷基。C₆-C₈环烷基是指具有涵盖整个范围(例如，6到8个碳原子)以及所有子范围(例如，6-7个、7-8个、6个、7个和8个碳原子)的碳原子数的环烷基。环烷基的非限制性实例包含环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。除非另有说明，否则环烷基可以是未经取代的环烷基或经取代的环烷基。本文所述的环烷基可以是单独的，或与另一个环烷基、杂环烷基、芳基和/或杂芳基稠合。当环烷基与另一个环烷基稠合时，除非另有说明，否则每个环烷基可以含有三到八个碳原子。除非另有说明，否则环烷基可以是未经取代的或经取代的。

如本文所使用的，术语“杂环烷基”与环烷基类似地定义，不同之处在于，环含有一个到三个独立地选自氧、氮和硫的杂原子。具体地说，术语“杂环烷基”是指总共含有三到十二个原子(例如，3-8个、5-8个、3-6个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个，11个或12个)的环，其中环原子中的1个、2个或3个原子是独立地选自由氧、氮和硫组成的组的杂原子，并且环中其余的原子是碳原子。杂环烷基的非限制性实例包含哌啶、吡唑烷、四氢呋喃、四氢吡喃、二氢呋喃、吗啉等。

环烷基和杂环烷基可以是饱和或部分不饱和的环体系，其任选地被例如一到三个基团取代，所述基团独立地选自烷基、亚烷基OH、C(O)NH₂、NH₂、氧基(＝O)、芳基、亚烷基卤基、卤基和OH。杂环烷基可以任选被烷基(例如，甲基或乙基)、亚烷基-OH、亚烷基芳基和亚烷基杂芳基进一步N-取代。本文所述的杂环烷基可以是单独的，或与另一个杂环烷基、环烷基、芳基和/或杂芳基稠合。当杂环烷基与另一个杂环烷基稠合时，除非另有说明，否则每个杂环烷基可以含有三到十二个总环原子，以及一到三个杂原子。除非另有说明，否则杂环烷基可以是未经取代的或经取代的。

如本文所使用的，术语“芳基”是指具有6到10个环原子的单环或双环香芳族基团。除非另有说明，否则芳基可以是未经取代的或被一个或多个(并且具体地说，一到四个)基团取代，所述基团选自例如卤基、烷基、烯基、OCF₃、NO₂、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、烷氨基、CO₂H、CO₂烷基、芳基和杂芳基。芳基可以是单独的(例如，苯基)，或与另一个芳基(例如，萘基、蒽基)、环烷基(例如四氢萘基)、杂环烷基和/或杂芳基稠合

如本文所使用的，术语“杂芳基”是指具有5到10个总环原子并且在芳香族环中含有一到四个选自氮、氧和硫原子的杂原子的单环或双环芳香族环。除非另有说明，否则杂芳基可以是未经取代的或被一个或多个(并且具体地说，一到四个)取代基取代，所述取代基选自例如卤基、烷基、烯基、OCF₃、NO₂、CN、NC、OH、烷氧基、氨基、CO₂H、CO₂烷基、芳基和杂芳基。在一些情况下，杂芳基被烷基和烷氧基中的一个或多个取代。杂芳基的实例包含但不限于噻吩基、呋喃基、吡啶基、吡咯基、噁唑基、三嗪基、***基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。

如本文所使用的，本文所用的术语“烷氧基(alkoxy或alkoxyl)”是指“-O-烷基”基团。烷氧基(alkoxy或alkoxyl)可以是未经取代的或经取代的。

如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指改善、减轻或消除特定疾病或病状(例如，癌症)的一种或多种症状或预防或延迟特定疾病或病状的一种或多种症状的发作的化合物或治疗活性化合物的组合的量。

如本文所使用，术语“患者”和“受试者”可以互换使用，并且是指动物(如狗、猫、牛、马和绵羊(例如，非人类动物))和人类。特定的患者或受试者是哺乳动物(例如，人类)。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指参考物质(如本公开的化合物、或含有所述化合物的调配物或特定的赋形剂)是安全的并且适合于施用于患者或受试者。术语“药学上可接受的赋形剂”是指不干扰一种或多种活性成分的生物学活性的效力并且对所施用的宿主无毒的介质。

本文所公开的化合物可以是药学上可接受的盐。如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应等，并与合理的利益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等人在《药物科学杂志(J.Pharmaceutical Sciences)》,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐，所述文献通过引用并入本文。本发明的化合物的药学上可接受的盐包含衍生自合适的无机和有机酸以及碱的盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有机酸(、如乙酸、三氟乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(如离子交换)形成的氨基盐。其它药学上可接受的盐包含己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。含有羧酸或其它酸性官能团的化合物的盐可以通过与合适的碱反应来制备。此类盐包含但不限于碱金属、碱土金属、铝盐、铵、N⁺(C_1-4烷基)₄盐以及有机碱(如三甲胺、三乙胺、吗啉、吡啶、哌啶、甲基吡啶、二环己胺、N,N'-二苄基乙二胺、2-羟乙基胺、双-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、普鲁卡因、二苄基哌啶、脱氢松香胺、N,N'-双脱氢松香胺、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、可力丁、奎宁、喹啉)和碱性氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)的盐。本发明还预想了本文所公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。通过这种季铵化可以获得水溶性或油溶性或分散性产物。代表性碱或碱土金属盐包含钠、锂、钾、钙、镁等。另外的药学上可接受的盐包含在适当时使用抗衡离子(如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。

如本文所使用的，术语“治疗(treating、treat或treatment等)”包含预防性(例如，预防性)治疗和缓解性治疗。

如本文所使用的，术语“赋形剂”是指除活性药物成分(API)以外的任何药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂、佐剂或其它成分。

本公开的化合物的合成

可以使用商业上可获得的起始材料、文献中已知或来自容易制备的中间体的化合物，通过采用本领域技术人员已知的或鉴于本文教导的标准合成方法和步骤，以各种方式来制备本文所公开化合物。通常可以通过遵循实例部分中所述的合成方案并对特定的期望取代基进行修饰来合成本文所公开的化合物。

用于有机分子制备以及官能团转化和操控的标准合成方法和程序可以从相关科学文献或从本领域中的标准教科书中获得。尽管不限于任何一个或若干个来源，但是经典文本(如Smith,M.B.、March,J.,《玛奇高等有机化学：反应、机制和结构(March's AdvancedOrganic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure)》,第5版,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons):纽约,2001；以及Greene,T.W.、Wuts,P.G.M.,《有机合成中的保护基团(Protective Groups in Organic Synthesis)》,第3版,约翰威利父子公司:纽约,1999)是本领域技术人员已知的有用和公认的有机合成参考教科书。以下对合成方法的描述旨在说明但不限制用于制备本公开的化合物的一般程序。

本文所公开的合成方法可以容许各种各样的官能团；因此可以使用各种被取代的起始材料。所述方法在整个过程结束时或接近结束时基本上提供所期望的最终化合物，但是在某些情况下可能需要进一步使所述化合物转化成其药学上可接受的盐。

通常，可以根据方案1合成式(I)化合物。

方案1

可以使用方案1中所示的程序合成具有结构c的化合物。经取代的2,5-二氢咪唑衍生物a与酰胺化合物b在适当的溶剂(例如，乙腈)中反应，产生本文所述的化合物，即，具有结构c的式(I)化合物。酰胺化合物b包括基于基团Q的性质选择的合适的离去基团LG，例如，卤素或甲苯磺酸酯。可以基于取代基R¹、R²、A、Y和B的性质选择具有结构c的化合物的适当的另外的衍生化反应。

可以通过基于化合物a和b的精确性质选择的适当的试剂来催化化合物a和b的偶联。例如，当化合物b的LG为卤素时(例如，当LG为氯时)，可以通过碱(例如，碳酸钠或碳酸钾)催化化合物a和b的偶联。偶合反应有时可能不需要催化剂。

有时，在与具有结构b的化合物偶联之前，可以通过用适当的试剂进行处理，将具有选自O、S和NR³的Q的化合物a转化为具有选自由O、S和NR³组成的组的不同成员的Q的化合物。例如，可以通过用硫杂化试剂(例如，劳森试剂或五硫化二磷)进行处理，将具有Q＝O的结构a的化合物转化为具有Q＝S的结构a的化合物。然后可以将这种化合物与具有结构b的化合物偶联以产生本文所述的化合物，即具有结构c的式(I)化合物。

化合物a和b可以商购或通过多种方法由商业上可获得的起始材料制备。例如，可以通过例如酰氯与胺的反应来制备具有结构b的酰胺化合物。

可以基于化合物c中取代基R¹、R²、A、Y和B的性质以及衍生化合物中期望的官能度来选择将具有结构c的化合物转化为本文所公开的其它化合物的另外的衍生化反应。例如，R¹和R²与其所连接的碳原子一起可以形成杂环，例如哌啶环，其可以通过本领域已知的方法进一步衍生化(例如，甲基化、添加保护基团等)，从而形成本文所述的多种其它式(I)化合物。

药物调配物、剂量和施用途径

进一步提供了药物调配物，其包括本文所述的化合物(例如，式I化合物或其药学上可接受的盐)和药学上可接受的赋形剂。

可以以治疗有效量(例如，足以预防或减轻与异常EGFR有关的疾病或病症的症状的量)将本文所述的化合物施用于受试者。化合物可以单独施用或作为药学上可接受的组合物或调配物的一部分施用。另外，化合物可以一次全部施用、多次施用，或在一段时间内基本均匀地递送。还应注意，化合物的剂量可以随时间变化。

针对特定受试者的特定施用方案将部分地取决于化合物、所施用的化合物的量、施用途径以及任何副作用的原因和程度。根据本公开的施用于受试者(例如，哺乳动物，如人)的化合物的量应该足以在合理的时间范围内影响期望的反应。剂量通常取决于施用的途径、时间和频率。因此，临床医生滴定剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果，并且常规的测距技术是本领域普通技术人员已知的。

纯粹通过举例说明，所述方法包括根据上述因素施用例如约0.1mg/kg到约100mg/kg的本文所公开的化合物。在其它实施例中，剂量范围为1mg/kg到约100mg/kg；或5mg/kg到约100mg/kg；或10mg/kg到约100mg/kg。一些病状需要延长治疗，这可能会或可能不会导致多次施用后施用较低剂量的化合物。如果需要的话，该化合物的剂量可以在一天中以适当的间隔分别以两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用，任选地以单位剂型施用。治疗期将视具体情况而定，可能持续一天到几个月。

施用生理学上可接受的组合物(如包括本文所公开的化合物(例如，式(I)化合物)的药物组合物)的合适方法是本领域众所周知的。尽管可以使用一种以上的途径来施用化合物，但是特定的途径可以比另一种途径提供更直接和更有效的反应。根据情况，将包括该化合物的药物组合物施用或滴入体腔中，通过皮肤或粘膜吸收，摄入、吸入和/或引入循环中。例如，在某些情况下，令人期望的是通过注射或通过以下方式之一来口服递送包括药剂的药物组合物：静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、***或直肠。可以通过缓释系统或植入装置施用化合物。

为了促进施用，在各个方面，将化合物配制成包括载剂(例如，媒剂、佐剂或稀释剂)的生理学上可接受的组合物。所采用的特定载剂受化学-物理考虑因素(如溶解性和与化合物的反应性不足)以及施用途径限制。生理学上可接受的载剂是本领域众所周知的。适用于注射用途的说明性药物形式包含无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(例如，参见美国专利第5,466,468号)。可注射的调配物在以下文献中进一步描述：例如《药剂学和药学实践(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)》,利平科特出版公司(J.B.Lippincott Co.),宾夕法尼亚州费城,Banker和Chalmers编辑,第238-250页(1982)，以及《ASHP可注射药物手册(ASHP Handbook on Injectable Drugs)》,Toissel,第4版,第622-630页(1986))。一方面，将包括所述化合物的药物组合物与包装材料一起放置在容器内，所述包装材料提供有关此类药物组合物的用途的说明书。通常，此类说明书包含描述试剂浓度的有形表达，以及在某些实施例中，包含重组药物组合物可能需要的赋形剂成分或稀释剂(例如，水、盐水或PBS)的相对量。

适用于肠胃外注射的组合物可以包括药学上可接受的无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在无菌的注射溶液或分散液中重构的无菌粉末。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包含水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，可以通过使用如卵磷脂等包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒度并且通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来防止微生物污染。还可以令人希望的是包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物组合物的延长的吸收。

用于口服施用的固体剂型包含胶囊、片剂、粉末和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性化合物与以下混合：至少一种惰性惯用赋形剂(或载剂)，如柠檬酸钠或磷酸二钙或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如羧甲纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***胶；(c)保湿剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯木薯淀粉、海藻酸、某些复杂的硅酸盐和碳酸钠；(a)溶液缓凝剂，例如石蜡；(f)吸收促进剂，例如季铵化合物；(g)湿润剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；以及(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或其混合物。在胶囊和片剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂，所述明胶胶囊使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。

固体剂型(如片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可以制备有包衣和外壳，如肠溶包衣和本领域众所周知的其它包衣。固体剂型还可以含有遮光剂。此外，固体剂型可以是包埋组合物，使得其以延迟的方式在肠道的某些部分中释放一种或多种活性化合物。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。活性化合物还可以任选地与一种或多种赋形剂一起呈微包囊形式。

用于口服施用的液体剂型包含药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有在本领域中常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地说，棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。

除了此类惰性稀释剂以外，所述组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。除活性化合物之外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶或这些物质的混合物等。

在调配后，将以与剂量调配物相容的方式并以治疗上有效的量施用溶液。可以以各种剂型(如可注射溶液、药物释放胶囊等)容易地施用调配物。例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，所述溶液应当被适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的生理盐水或葡萄糖进行等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。

在禁止对人体实践的方法申请专利的司法管辖区中，将组合物“施用于”人类受试者的含义应限于规定一种人类受试者可以通过任何技术(例如，口服、吸入、局部施用、注射、***等)自行施用的受控物质。旨在与定义专利主题的法律或法规相一致的最广泛的合理解释。在不禁止对人体上实践的方法申请专利的司法管辖区中，组合物的“施用”既包含在人体上实践的方法，又包含前述活动。

使用方法

本文所述的化合物可以调节EGFR。在一些实施例中，所述化合物抑制EGFR二聚化。在各个实施例中，所述化合物诱导EGFR降解。

尽管EGFR已经被明确地鉴定为癌基因和癌症中的重要分子靶标，但是仍然存在对调节该癌基因活性的改进方法的巨大需要和机会。通过使用阻断二聚化(干扰素)或siRNA的细胞穿透肽，已证明EGFR降解对细胞存活也具有深远影响，即使在TKI耐药性细胞中也是如此(14、23、25、26)。不受理论的束缚，据推测，抑制二聚化的小分子对活性EGFR的降解(肿瘤中丰富)是选择性的，因为大多数正常细胞不表达高水平的EGF/EGFR，并因此形成对称二聚体，所述对称二聚体预计不会受到化合物8C的影响。这种方法甚至在TKI耐药性肿瘤细胞中也有效，因为TKI耐药性肿瘤中的二聚体界面保持完整(见图1A和1B)。与当前批准的疗法相比，本文描述的方法是独特的。通过降解EGFR蛋白质而不是简单地抑制其激酶活性，在临床前模型中已证明了广泛的活性，同时由于该药剂仅影响与EGF结合的EGFR(与正常组织相比，其在肿瘤细胞中含量丰富)，从而提高了靶向肿瘤组织的能力，进而改善了安全性和治疗范围。

降解EGFR而不是简单地抑制其激酶活性的方法克服了在非小细胞肺癌患者中不断发展的对奥希替尼的抗性。尽管本申请的重点是肺癌，但在其它由EGFR驱动的癌症(如头颈部、结直肠癌和成胶质细胞瘤)中也存在另外的重要的临床机会。因此，肿瘤中癌蛋白的靶向选择性降解代表了一种新的机制，其不仅仅可以抑制激酶活性，而且这种方法可能适用于其它致癌蛋白质(22、25、26、46)。

本文所公开的化合物对于治疗或预防由异常EGFR活性引起的疾病或病症特别有利。

如本文所使用的，“异常EGFR活性”是指与表皮生长因子受体(EGFR)的突变和过表达有关的活性。这种突变和过表达与多种癌症的发展有关(Shan等人，《细胞(Cell)》2012,149(4)860-870)。

鉴于EGFR的生物学作用的重要性，本公开的化合物可用于多种场合中的许多应用。例如并且最简单地，本公开的活性剂可用于抑制细胞中EGFR的二聚化。在这方面，本公开提供了一种抑制细胞中的EGFR二聚化的方法。所述方法包括使细胞与有效抑制二聚化的量的本公开的化合物或其药学上可接受的盐接触。在一些方面，细胞是体外或离体细胞培养物或体外或离体组织样品的一部分。在一些方面，所述细胞是体内细胞。在某些实施例中，所述方法旨在用于研究目的，而在其它实施例中，所述方法旨在用于治疗目的。

EGFR二聚化的抑制导致EGFR降解的增加。因此，本公开进一步提供了一种增加细胞中EGFR降解的方法。所述方法包括使细胞与有效增加降解的量的本公开的化合物或其药学上可接受的盐接触。在一些方面，细胞是体外或离体细胞培养物或体外或离体组织样品的一部分。在一些方面，所述细胞是体内细胞。在某些实施例中，所述方法旨在用于研究目的，而在其它实施例中，所述方法旨在用于治疗目的。

如本文所示，抑制EGFR二聚化的化合物增加了肿瘤细胞死亡。因此，本公开提供了一种增加受试者中肿瘤细胞死亡的方法。所述方法包括以有效增加肿瘤细胞死亡的量向受试者施用本公开的化合物或其药学上可接受的盐。

根据前述内容，本公开进一步提供了一种治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括以有效治疗受试者癌症的量向所述受试者施用本公开的化合物或其药学上可接受的盐。

如本文所使用的，术语“治疗”以及与之相关的词语不一定暗含100％或完全的治疗。相反，存在不同程度的治疗，本领域普通技术人员认为其中一种具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本公开的治疗癌症的方法可以提供任何数量或任何水平的癌症治疗。此外，通过本公开的方法提供的治疗可以包含治疗所治疗的癌症的一种或多种病状或症状。而且，通过本公开的方法提供的治疗可以涵盖减缓癌症的进展。例如，所述方法可以通过减少肿瘤或癌症的生长、减少肿瘤细胞的转移、增加肿瘤或癌细胞的细胞死亡等来治疗癌症。

通过本文所公开的方法可治疗的癌症可以是任何癌症，例如，由异常和不受控制的细胞***引起的任何恶性生长或肿瘤，其可以通过淋巴系统或血流扩散到身体的其它部分。在一些实施例中，癌症是其中EGFR由癌症细胞表达的癌症。在一些方面，癌症是其中EGFR蛋白过表达、编码EGFR的基因被扩增和/或EGFR突变蛋白(例如，截短的EGFR、点突变的EGFR)被表达的癌症。

在一些方面，所述癌症是选自由以下组成的组的一种癌症：急性淋巴细胞癌；急性髓细胞性白血病；肺泡横纹肌肉瘤；骨癌；脑癌；乳腺癌；***、肛管或***直肠癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈部、胆囊或胸膜癌；鼻、鼻腔或中耳癌；口腔癌；外阴癌；白血病(例如，慢性淋巴细胞性白血病)；慢性髓样癌；结肠癌；食道癌；***；胃肠道类癌；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；肾癌；喉癌；肝癌；肺癌；恶性间皮瘤；黑色素瘤；多发性骨髓瘤；鼻咽癌；非霍奇金淋巴瘤；卵巢癌；胰腺癌；腹膜、大网膜和肠系膜癌；咽癌；***癌；直肠癌；肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))；小肠癌；软组织癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；输尿管癌和膀胱癌。在特定方面，所述癌症选自由以下组成的组：头颈癌、卵巢癌、***、膀胱癌和食道癌、胰腺癌、胃肠道癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、膀胱癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、支气管肺泡癌。在特定方面，所述癌症是奥希替尼耐药性癌症。在一些情况下，所述癌症是胰腺癌、头颈癌、黑色素瘤、结肠癌、肾癌、白血病或乳腺癌。在一些情况下，所述癌症是黑色素瘤、结肠癌、肾癌、白血病或乳腺癌。

本文还提供了本文所公开的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于调节EGFR或用于治疗或预防与异常EGFR活性有关的疾病或病症。

通过参考以下实例，将更容易理解本文的公开内容。

鉴于可以应用本公开的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示出的实施例仅仅是实例，并且不应被视为限制本发明的范围。

实例

实例1：一般程序A：

向3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-硫酮6于无水乙腈中的溶液中加入乙酰胺7A-G(1当量效)。将反应混合物升温至40℃。接下来，将2M碳酸钾水溶液(1当量)加入到反应混合物中。将反应保持在40℃，直到TLC显示出起始材料损失和新的R_f斑点(通常为2-6小时)。一旦通过TLC完成反应，则对其进行后处理。将粗品反应混合物倒入分液漏斗中，并加入乙酸乙酯和水。将有机层分离，然后用盐水(1x)洗涤。然后将有机层经无水MgSO₄干燥，过滤并在减压下浓缩，从而得到粗品产物。通过闪式色谱法纯化粗品产物。使用最少量的乙酸乙酯将粗品产物装载到二氧化硅柱上。将该柱置于另一个预先平衡的二氧化硅柱的顶部。通常使用乙酸乙酯/庚烷(1-100％)或甲醇/二氯甲烷(0-10％)的梯度来洗脱产物。在减压下浓缩产物级分，从而得到期望的产物。

实例2-化合物8A(2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺)的合成

遵循一般程序A，使用乙酰胺7A。将粗品产物通过闪式色谱法纯化，在10％甲醇/二氯甲烷溶液中洗脱，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.30(s,1H),8.31(d,J＝2.29Hz,1H),7.74-7.86(m,5H),6.78(d,J＝8.87Hz,1H),4.14(s,2H),3.79(s,3H),2.50-2.67(m,4H),2.24(s,3H),1.55-1.75(m,4H)；MS(ESI+m/z 503.10,ESI-m/z 501.10)；TLC:(90:10:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.56。

实例3-化合物8B(2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(6-氯吡啶-3-基)乙酰胺)的合成

遵循一般程序A使用乙酰胺7B。将粗品产物通过闪式色谱法纯化，在10％甲醇/二氯甲烷溶液中洗脱，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.72(s,1H),8.63(s,1H),8.10(br d,J＝9.15Hz,1H),7.85(q,J＝8.23Hz,4H),7.53(d,J＝8.60Hz,1H),4.24(s,2H),2.56-2.81(m,4H),2.27(br s,3H),1.55-1.85(m,4H)；MS(ESI+m/z507.95,ESI-m/z505.95)；TLC:(95:5:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.17。

实例4-化合物8C(2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺)的合成

遵循一般程序A使用乙酰胺7C。将粗品产物通过闪式色谱法纯化，在10％甲醇/二氯甲烷溶液中洗脱，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.89(br s,1H),8.95(s,1H),8.67(s,1H),7.96(br d,J＝8.33Hz,1H),7.92(br d,J＝8.33Hz,1H),7.78-7.87(m,4H),7.52-7.72(m,2H),4.29(s,2H),2.43-2.52(m,4H),2.18(br s,3H),1.55-1.85(m,4H)；MS(ESI+m/z 523.05,ESI-m/z 521.00)；TLC:(90:10:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.47。

实例5-化合物8D(2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(吡啶-4-基)乙酰胺)的合成

遵循一般程序A使用乙酰胺7D。将粗品产物通过闪式色谱法纯化，在13％甲醇/二氯甲烷溶液中洗脱，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.66(s,1H),8.41(brd,J＝6.13Hz,2H),7.78(q,J＝8.51Hz,4H),7.52(d,J＝6.04Hz,2H),4.18(s,2H),2.50-2.73(m,4H),2.19(br s,3H),1.28-1.91(m,4H)；MS(ESI+m/z 473.05,ESI-m/z 471.05)；TLC:(90:10:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.24。

实例6-化合物8E(2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-环己基乙酰胺)的合成

遵循一般程序A使用乙酰胺7E。遵循一般程序A中的后处理程序，得到标题化合物，无需进行柱纯化。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.04(br d,J＝7.78Hz,1H),7.78(q,J＝8.63Hz,4H),3.89(s,2H),3.45-3.55(m,1H),2.50-2.71(m,4H),2.29(s,3H),1.58-1.80(m,7H),1.51(br d,J＝12.44Hz,1H),1.05-1.28(m,6H)；MS(ESI+m/z 478.90,ESI-m/z476.90)；TLC:(90:10:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.60。

实例7-化合物8F(2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-环戊基乙酰胺)的合成

遵循一般程序A使用乙酰胺7F。将粗品产物通过闪式色谱法纯化，在10％甲醇/二氯甲烷溶液中洗脱，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.15(br d,J＝6.77Hz,1H),7.79(q,J＝8.42Hz,4H),3.92-4.01(m,1H),3.91(s,2H),2.50-2.71(m,4H),2.32(s,3H),1.58-1.82(m,8H),1.45-1.54(m,2H),1.38(td,J＝6.27,12.35Hz,2H)；MS(ESI+m/z 464.10,ESI-m/z 462.15)；TLC:(90:10:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.62。

实例8-化合物8G(N-苄基-2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)乙酰胺)的合成

遵循一般程序A使用乙酰胺7G。将粗品产物通过闪式色谱法纯化，在10％甲醇/二氯甲烷溶液中洗脱，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.65(br t,J＝5.81Hz,1H),7.73-7.82(m,4H),7.17-7.30(m,5H),4.27(d,J＝5.95Hz,2H),3.99(s,2H),2.50-2.73(m,5H),2.28(s,3H),1.66(br s,3H)；MS(ESI+m/z 486.00,ESI-m/z 484.10)；TLC:(90:10:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.59。

实例9-11-化合物3-5的合成

实例9-化合物3(4-(2-((3-氯-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯)的合成

向2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯，1于无水DMF中的溶液中加入氢化钠(2当量)。将反应混合物升温至40℃，持续三十分钟。接下来，将2-氯-N-(3-氯-4-甲氧基苯基)乙酰胺盐酸盐，2(1.76当量)加入反应混合物中。将反应混合物保持在40℃，并在N₂流下搅拌。五小时后，尽管TLC表明起始材料有剩余，但仍将反应纯化。将粗品反应混合物冷却至室温，然后装载到二氧化硅上。将干燥装载的材料放入干载柱中并进行填充。将干载柱置于预先平衡的(1％乙酸乙酯/庚烷)硅胶柱的顶部。使用闪式色谱法，用1-100％乙酸乙酯/庚烷的梯度洗脱来纯化粗品产物。收集期望的级分(在50％乙酸乙酯下洗脱)，并在减压下浓缩，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.67(s,1H),8.46(d,J＝8.97Hz,2H),7.55(d,J＝2.56Hz,1H),7.27-7.39(m,1H),6.99(d,J＝8.97Hz,2H),6.84(d,J＝8.87Hz,1H),4.01-4.22(m,2H),3.88(s,3H),3.86(s,3H),3.39(m,2H),2.21(dt,J＝4.80,12.69Hz,2H),1.50(s,9H),1.19-1.40(m,4H)；MS(ESI+m/z 501,ESI-m/z 556.15)；TLC:(50:50EA:HEP)R_f＝0.21。

实例10-化合物4(N-(3-氯-4-甲氧基苯基)-2-(3-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-3-烯-1-基)乙酰胺盐酸盐)的合成

向3，4-(2-((3-氯-4-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)-2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯于无水二噁烷中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(3.3当量)。一小时后，通过TLC未观察到反应，因此加入另一份含4M HCl的二噁烷(3.3当量)。一小时后，观察到新的斑点(基线)，但起始材料有剩余。加入另一份含4M HCl的二噁烷(3.3当量)，并将反应混合物在40℃下搅拌过夜。一夜之间，在反应混合物中形成黄色沉淀。将固体通过烧结漏斗(fritted funnel)过滤，并用过量的二噁烷冲洗。将固体转移到小瓶中，并在减压下干燥，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.48(s,1H),9.22(br d,J＝9.70Hz,1H),8.93(br d,J＝10.70Hz,1H),8.39(d,J＝8.97Hz,2H),7.78(d,J＝2.47Hz,1H),7.45(dd,J＝2.52,9.01Hz,1H),7.07-7.14(m,3H),4.98(br s,2H),4.25(s,2H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.39-3.48(m,2H),3.25-3.39(m,2H),1.55(br d,J＝13.45Hz,2H)；MS(ESI+m/z 457.10,ESI-m/z455.10)；TLC:(95:5:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.03。

实例11-化合物5(N-(3-氯-4-甲氧基苯基)-2-(3-(4-甲氧基苯基)-8-甲基-2-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-3-烯-1-基)乙酰胺)的合成

向4，N-(3-氯-4-甲氧基苯基)-2-(3-(4-甲氧基苯基)-2-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-3-烯-1-基)乙酰胺盐酸盐于甲醇中的溶液中加入甲醛水溶液(37wt％溶液，7当量)。将反应混合物搅拌5分钟，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。第二天早上，TLC(95:5:0.5，DCM:MeOH:NH₄OH)显示反应完成，带有新的更高R_f斑点。将粗品反应物倒入分液漏斗中。向分液漏斗中加入二氯甲烷。将有机层先后用饱和NaHCO₃水溶液(1x)和盐水(1x)洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.15(s,1H),8.34(d,J＝8.97Hz,2H),7.74(d,J＝2.47Hz,1H),7.39(dd,J＝2.56,8.97Hz,1H),7.03-7.12(m,3H),4.24(s,2H),3.81(s,3H),3.80(s,3H),2.78(br s,2H),2.29(br s,3H),2.15-2.26(m,2H)1.13-1.33(m,3H)；MS(ESI+m/z 471.10)；TLC:(95:5:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.23

实例12-14-化合物10、11和12的合成

实例12-化合物10(2-(4-甲氧基苯基)-3-((2-((6-甲氧基吡啶-3-基)氨基)-2-氧代乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯)的合成

向2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯，1于无水THF中的溶液中加入劳森试剂(1当量)。将反应混合物在室温下搅拌48小时，然后通过闪式色谱法纯化粗品产物。将粗品反应混合物干燥装载到二氧化硅上。将干燥装载的材料放入干载柱中并进行填充。将干载柱置于预先平衡的(2％乙酸乙酯/庚烷)硅胶柱的顶部。使用闪式色谱法，用2-100％乙酸乙酯/庚烷的梯度洗脱来纯化粗品产物。收集期望的级分(在50％乙酸乙酯下洗脱)，并在减压下浓缩，从而得到粗品固体。将固体与庚烷、二氯甲烷和乙酸乙酯(3:2:1v/v)的混合物一起研磨，并在烧结漏斗中过滤，得从而到9 2-(4-甲氧基苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。MS(ESI+m/z 376.9,ESI-m/z374.9)；TLC:(95:0.5:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.68。

接下来，向2-(4-甲氧基苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯，9于无水乙腈中的溶液中加入2-氯-N-(3-氯-4-甲氧基苯基)乙酰胺盐酸盐，2(1当量)。将反应混合物升温至40℃。接下来，将2M碳酸钾水溶液(2当量)加入到反应混合物中。反应在40℃下持续过夜，直到TLC显示起始材料损失，并观察到两个新的较低R_f斑点。将粗品反应混合物倒入分液漏斗中。向漏斗中加入乙酸乙酯和水。分离有机层，然后用盐水(1x)洗涤。然后将有机层经无水MgSO₄干燥，过滤并在减压下浓缩，从而得到粗品产物。使用最少量的二氯甲烷将粗品产物装载到二氧化硅柱上。将该柱置于另一个预先平衡的二氧化硅柱的顶部。使用乙酸乙酯/庚烷(1-35％)的梯度通过闪式色谱法洗脱产物。在减压下浓缩产物级分，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.30(s,1H),8.32(d,J＝2.38Hz,1H),7.84-7.91(m,3H),7.12(d,J＝8.97Hz,2H),6.80(d,J＝8.97Hz,2H),4.15(s,2H),3.84(s,3H),3.82(s,3H),3.63-3.72(m,2H),3.47-3.56(m,2H),1.72(br t,J＝8.78Hz,2H),1.42(br s,11H)；MS(ESI+m/z540.20,ESI-m/z 538.15)；TLC:(50:50,EA:Hep)R_f＝0.29。

实例13-化合物11(2-((3-(4-甲氧基苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺盐酸盐)的合成

向10，2-(4-甲氧基苯基)-3-((2-((6-甲氧基吡啶-3-基)氨基)-2-氧代乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯于无水二噁烷中的溶液中加入含4MHCl的二噁烷(3当量)。两小时后，通过TLC未观察到起始材料，并且形成了新的斑点(基线)。在反应混合物中形成黄色沉淀。将固体通过烧结漏斗过滤，并用过量的二噁烷冲洗。固体不纯，因此使用最少量的二氯甲烷将其装载到二氧化硅柱上。使用甲醇/二氯甲烷(0-15％)的梯度通过闪式色谱法洗脱产物。在减压下浓缩产物级分，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.40(s,1H),8.45-8.60(br s,1H),8.25-8.43(m,1H),7.85-7.93(m,3H),7.12(d,J＝8.87Hz,2H),6.80(d,J＝8.78Hz,2H),4.18(s,2H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.22-3.56(m,4H),1.84-2.01(m,2H),1.60-1.75(m,2H)；MS(ESI+m/z 440.10,ESI-m/z438.10)；TLC:(50:50,EA:Hep)R_f＝0.25

实例14-化合物12(2-((3-(4-甲氧基苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺)的合成

向11，2-((3-(4-甲氧基苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(6-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺盐酸盐于95:5二氯甲烷:甲醇中的溶液中加入甲醛水溶液(37wt％溶液，7当量)。将反应混合物搅拌一小时，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。第二天早上，TLC(95:5:0.5，DCM:MeOH:NH₄OH)显示反应完成，带有新的更高R_f斑点。将粗品反应物倒入分液漏斗中。向分液漏斗中加入二氯甲烷和水。分离有机层，并用盐水(1x)洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩，从而得到粗品产物。粗品产物不纯，因此使用最少量的二氯甲烷将其装载到二氧化硅柱上。使用甲醇/二氯甲烷(0-10％)的梯度通过闪式色谱法洗脱产物。在减压下浓缩产物级分，从而得到标题化合物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.33(s,1H),8.35(d,J＝2.38Hz,1H),7.85-7.91(m,3H),7.12(d,J＝8.02Hz,2H),6.81(d,J＝9.06Hz,1H),4.16(s,2H),3.85(s,3H),3.82(s,3H),2.53-2.81(m,4H),2.15-2.40(m,2H),1.92(s,3H),1.50-1.80(m,2H)；MS(ESI+m/z 454.10,ESI-m/z452.10)；TLC:(95:5:0.5,DCM:MeOH:NH₄OH)R_f＝0.22。

实例15-28：化合物33a–33l的合成

(i)的一般反应条件：向2-(4-溴苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)的溶液中加入含劳森试剂(0.6当量)的THF(0.1M)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。

(ii)的一般反应条件：向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

(iii)的一般反应条件：向2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF(0.1M)中，并加入三乙胺(5当量)和适当的亲电子试剂(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到期望的产物。

实例15-28

化合物33a 2-((3-(4-溴苯基)-8-异丙基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),8.97–8.90(m,1H),8.00–7.95(m,1H),7.95–7.90(m,1H),7.89–7.83(m,2H),7.83–7.77(m,2H),7.71–7.63(m,1H),7.62–7.55(m,1H),4.26(s,2H),2.73–2.60(m,4H),1.88–1.71(m,2H),1.62–1.40(m,2H),0.90(s,3H),0.88(s,3H)。

化合物33b 2-((3-(4-溴苯基)-8-异丙基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),7.99–7.94(m,1H),7.94–7.90(m,1H),7.88–7.83(m,2H),7.83–7.78(m,2H),7.69–7.62(m,1H),7.62–7.54(m,1H),4.26(s,2H),3.48–3.36(m,4H),2.67–2.56(m,2H),2.31–2.12(m,2H),1.62–1.38(m,2H),1.28–1.15(m,2H),0.81(d,J＝6.5Hz,6H)。

化合物33c 2-((8-苯基-3-(4-溴苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.17(d,J＝2.5Hz,1H),7.95(d,J＝2.5Hz,1H),7.25–7.19(m,1H),7.12–7.02(m,3H),6.96–6.87(m,3H),6.85–6.78(m,1H),6.43–6.30(m,3H),6.30–6.17(m,2H),3.42–3.34(m,2H),2.76–2.60(m,4H),2.10–1.95(m,2H),1.95–1.78(m,2H)。

化合物33d 2-((3-(4-溴苯基)-8-乙基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,2H),7.81(d,J＝8.5Hz,2H),7.69–7.63(m,1H),7.62–7.53(m,1H),4.27(s,2H),2.66(s,4H),2.48–2.33(m,2H),1.90–1.40(m,2H),1.02–0.91(m,3H)。

化合物33e 2-((3-(4-溴苯基)-8-丙基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.4Hz,1H),7.99–7.95(m,1H),7.93(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.88–7.83(m,2H),7.83–7.78(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.8,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.2,6.9,1.3Hz,1H),4.26(s,2H),2.67–2.55(m,4H),2.29–2.16(m,2H),1.90–1.69(m,2H),1.63–1.41(m,2H),1.40–1.29(m,2H),0.79(t,J＝7.3Hz,3H)。

化合物33f 2-((3-(4-溴苯基)-8-异丁基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.95(d,J＝2.6Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.00–7.94(m,1H),7.94–7.90(m,1H),7.87–7.83(m,2H),7.83–7.78(m,2H),7.69–7.62(m,1H),7.62–7.54(m,1H),4.26(s,2H),2.65–2.52(m,4H),2.06–1.93(m,2H),1.92–1.75(m,2H),1.72–1.37(m,3H),0.80(d,J＝6.5Hz,6H)。

化合物33g 2-((3-(4-溴苯基)-8-(3,3,3-三氟丙基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.4Hz,1H),8.00–7.95(m,1H),7.95–7.91(m,1H),7.88–7.83(m,2H),7.83–7.78(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.9,1.3Hz,1H),4.28(s,2H),2.68–2.54(m,6H),1.96–1.40(m,6H)。

化合物33h 2-((3-(4-溴苯基)-8-环戊基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H),8.96(s,1H),8.68(s,1H),8.03–7.90(m,2H),7.90–7.77(m,4H),7.73–7.63(m,1H),7.62–7.54(m,1H),4.25(s,2H),2.77–2.23(m,5H),2.03–0.83(m,12H)。

化合物33i 2-((3-(4-溴苯基)-8-环丁基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),8.96(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.00–7.96(m,1H),7.95–7.90(m,1H),7.88–7.83(m,2H),7.83–7.77(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.2,6.9,1.4Hz,1H),4.25(s,2H),2.67–2.54(m,1H),2.49–2.28(m,1H),1.91–1.61(m,5H),1.63–1.10(m,4H)。

化合物33j 2-((3-(4-溴苯基)-8-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.88(s,1H),8.85–8.76(m,1H),8.65(d,J＝2.6Hz,1H),8.11–8.02(m,1H),7.87–7.77(m,3H),7.70–7.61(m,3H),7.56(ddd,J＝8.1,6.9,1.2Hz,1H),7.47(d,J＝0.7Hz,1H),7.37(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,3H),3.62(s,2H),3.04–2.72(m,4H),2.40–2.07(m,2H),1.78(s,2H)。

化合物33k 2-((3-(4-溴苯基)-8-((1-异丙基-1H-吡唑-4-基)甲基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.89(s,1H),8.80(d,J＝2.5Hz,1H),8.66(d,J＝2.6Hz,1H),8.08–7.98(m,1H),7.87–7.76(m,3H),7.69–7.63(m,3H),7.56(ddd,J＝8.2,6.9,1.2Hz,1H),7.50(d,J＝0.9Hz,1H),7.44(s,1H),4.50(p,J＝6.7Hz,1H),4.01(s,2H),3.62(s,2H),3.09–2.76(m,4H),2.40–2.12(m,2H),1.74(d,J＝35.2Hz,2H),1.53(d,J＝6.7Hz,5H)。

化合物33l 2-((3-(4-溴苯基)-8-(甲基-d2)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.4Hz,1H),7.97(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H),7.93(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),7.89–7.83(m,2H),7.83–7.78(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.9,1.3Hz,1H),4.28(s,2H),2.74–2.54(m,5H),1.98–1.36(m,4H)。

实例29-34：化合物34a-34f的合成

化合物34a 2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-4-基)乙酰胺的合成

向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-4-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)，并将反应混合物搅拌10小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。有机物将合并，干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷溶液)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-6-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.65(s，1H)，8.80(dd，J＝4.2，1.7Hz，1H)，8.34(d，J＝2.4Hz，1H)，8.33–8.27(m，1H)，8.04–7.92(m，1H)，7.92–7.76(m，5H)，7.49(dd，J＝8.3，4.2Hz，1H)，4.27(s，2H)，3.70–3.58(m，2H)，3.57–3.46(m，2H)，1.74(d，J＝12.6，8.4，3.9Hz，2H)，1.56-1.44(m，2H)，1.37(s，9H)。

向2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-6-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入甲醛(5当量)和三乙胺(5当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-6-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.67(s,1H),8.80(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.35(d,J＝2.4Hz,1H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H),7.99(d,J＝9.1Hz,1H),7.89–7.77(m,5H),7.49(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),4.26(s,2H),2.67–2.54(m,4H),2.22(s,3H),1.85–1.40(m,4H)。

化合物34b 2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-6-基)乙酰胺的合成

向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-6-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)，并将反应混合物搅拌10小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。有机物将合并，干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷溶液)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-6-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.65(s，1H)，8.80(dd，J＝4.2，1.7Hz，1H)，8.34(d，J＝2.4Hz，1H)，8.33–8.27(m，1H)，8.04–7.92(m，1H)，7.92–7.76(m，5H)，7.49(dd，J＝8.3，4.2Hz，1H)，4.27(s，2H)，3.70–3.58(m，2H)，3.57–3.46(m，2H)，1.74(d，J＝12.6，8.4，3.9Hz，2H)，1.56–1.44(m，2H)，1.37(s，9H)。

向2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-6-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入甲醛(5当量)和三乙胺(5当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-6-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.67(s,1H),8.80(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.35(d,J＝2.4Hz,1H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H),7.99(d,J＝9.1Hz,1H),7.89–7.77(m,5H),7.49(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),4.26(s,2H),2.67–2.54(m,4H),2.22(s,3H),1.85–1.40(m,4H)。

化合物34c 2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-5-基)乙酰胺的合成

向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-5-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)，并将反应混合物搅拌10小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物合并，干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-5-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-5-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入甲醛(5当量)和三乙胺(5当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-5-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),8.93(dd,J＝4.2,1.6Hz,1H),8.52(ddd,J＝8.6,1.7,0.9Hz,1H),7.96–7.71(m,7H),7.57(dd,J＝8.6,4.2Hz,1H),4.36(s,2H),2.75–2.56(m,4H),2.25(s,3H),1.89–1.59(m,4H)。

化合物34d 2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-7-基)乙酰胺的合成

向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-7-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)，并将反应混合物搅拌10小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物合并，干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-7-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-7-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入甲醛(5当量)和三乙胺(5当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-7-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.69(s,1H),8.85(dd,J＝4.2,1.8Hz,1H),8.40(d,J＝2.0Hz,1H),8.28(d,J＝8.1Hz,1H),7.94(d,J＝8.9Hz,1H),7.91–7.84(m,2H),7.83–7.77(m,2H),7.73(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),7.43(dd,J＝8.2,4.2Hz,1H),4.28(s,2H),2.67–2.55(m,4H),2.20(s,3H),1.91–1.38(m,4H)。

化合物34e 2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-8-基)乙酰胺的合成

向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-8-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)，并将反应混合物搅拌10小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物合并，干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-8-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(4-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-8-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入甲醛(5当量)和三乙胺(5当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-8-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),8.85(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.60(dd,J＝7.6,1.3Hz,1H),8.42(dd,J＝8.3,1.7Hz,1H),7.90–7.79(m,4H),7.69(dd,J＝8.3,1.4Hz,1H),7.64(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.62–7.56(m,1H),4.34(s,2H),2.50–2.37(m,4H),2.07(s,3H),1.86–1.17(m,4H)。

化合物34f 2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-甲基-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

向2-(4-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-甲基-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)，并将反应混合物搅拌10小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物合并，干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-溴苯基)-3-((2-(甲基(喹啉-3-基)氨基)-2-氧代乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(4-溴苯基)-3-((2-(甲基(喹啉-3-基)氨基)-2-氧代乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物搅拌4小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入甲醛(5当量)和三乙胺(5当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)N-甲基-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.03(s,1H),8.51(s,1H),8.10(d,J＝8.5Hz,1H),8.00(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),7.89–7.63(m,6H),4.01(s,2H),3.37(s,3H),3.30(s,3H),2.65–2.16(m,7H),1.89–1.18(m,4H)。

实例35-43：化合物35a-35i的合成

化合物35a 2-((3-(4-氟苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将氨基(4-氟苯基)乙酸甲酯HCl在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(4-氟苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(4-氟苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-氟苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.28(s,1H),8.48–8.37(m,2H),7.41–7.31(m,2H),3.71–3.50(m,4H),1.79–1.69(m,2H),1.68–1.56(m,2H),1.44(s,9H)。

向2-(4-氟苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-氟苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.60(s,1H),8.38(dd,J＝8.5,5.7Hz,2H),7.34(t,J＝8.7Hz,2H),3.80–3.70(m,2H),3.60–3.45(m,2H),1.86–1.67(m,4H),1.45(s,9H)。

向2-(4-氟苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-氟苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(4-氟苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-氟苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.74–8.64(m,1H),7.99–7.95(m,1H),7.95–7.92(m,1H),7.91–7.88(m,2H),7.70–7.51(m,4H),4.27(s,2H),3.34(s,3H),2.64–2.55(m,4H),2.26–2.11(m,2H),1.91–1.42(m,4H)。

化合物35b 2-((8-甲基-3-苯基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将2-氨基-2-苯基乙酸甲酯盐酸盐在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-苯基乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-苯基乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到3-氧代-2-苯基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.26(s,1H),8.47–8.23(m,2H),7.61–7.48(m,3H),3.70–3.50(m,4H),1.80–1.68(m,2H),1.68–1.58(m,2H),1.44(s,9H)。

向3-氧代-2-苯基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-苯基-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.58(s,1H),8.30–8.23(m,2H),7.60–7.46(m,3H),3.81–3.70(m,2H),3.60–3.44(m,2H),1.86–1.62(m,4H),1.45(s,9H)。

向2-苯基-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-3-苯基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-3-苯基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((8-甲基-3-苯基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.02–7.90(m,4H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),7.49–7.39(m,2H),4.28(s,2H),2.75–2.56(m,4H),2.24(s,3H),1.99–1.40(m,4H)。

化合物35c 2-((3-(4-氯-3-氟苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将2-氨基-2-(4-氯-3-氟苯基)乙酸甲酯盐酸盐在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(4-氯-3-氟苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(4-氯-3-氟苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-氯-3-氟苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.29(dd,J＝10.4,1.8Hz,1H),8.20(ddd,J＝8.4,1.8,0.8Hz,1H),7.78(dd,J＝8.4,7.7Hz,1H),3.69–3.52(m,4H),1.73(d,J＝6.8Hz,4H),1.44(s,9H)。

向2-(4-氯-3-氟苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-氯-3-氟苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.58(s,1H),8.30–8.23(m,2H),7.60–7.46(m,3H),3.81–3.70(m,2H),3.60–3.44(m,2H),1.86–1.62(m,4H),1.45(s,9H)。

向2-(4-氯-3-氟苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-氯-3-氟苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.78(s,1H),8.91(d,J＝2.5Hz,1H),8.71–8.61(m,1H),8.00–7.95(m,1H),7.95–7.91(m,1H),7.90–7.83(m,2H),7.81–7.76(m,1H),7.67(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.2,6.9,1.3Hz,1H),4.29(s,2H),3.70–3.58(m,2H),3.58–3.45(m,2H),1.82–1.65(m,2H),1.60–1.43(m,2H),1.38(s,9H)。

向2-(4-氯-3-氟苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)₃(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-氯-3-氟苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),7.99–7.95(m,1H),7.93(d,J＝7.7Hz,1H),7.89–7.82(m,2H),7.80–7.75(m,1H),7.66(ddd,J＝8.5,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),4.29(s,2H),2.63–2.55(m,4H),2.20(s,3H),1.93–1.38(m,4H)。

化合物35d 2-((3-(3-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将2-氨基-2-(3-溴苯基)乙酸甲酯在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(3-溴苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(3-溴苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(3-溴苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,1H),8.54–8.48(m,1H),8.39–8.25(m,1H),7.80(d,J＝8.0,2.1,1.1Hz,1H),7.57–7.44(m,1H),3.60(d,J＝19.5Hz,4H),1.73(d,J＝7.4Hz,2H),1.69–1.55(m,2H),1.44(s,9H)。

向2-(3-溴苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(3-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.63(s,1H),8.51–8.42(m,1H),8.27(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.77(ddd,J＝8.0,2.1,1.1Hz,1H),7.51–7.44(m,1H),3.82–3.68(m,2H),3.61–3.43(m,2H),1.86–1.66(m,4H),1.45(s,9H)。

向2-(3-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(3-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.78(s,1H),8.91(d,J＝2.6Hz,1H),8.70–8.59(m,1H),8.05(t,J＝1.8Hz,1H),8.00–7.95(m,1H),7.95–7.90(m,2H),7.84(ddd,J＝8.1,2.1,1.0Hz,1H),7.67(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.61–7.54(m,2H),4.28(s,2H),3.71–3.58(m,2H),3.57–3.46(m,2H),1.80–1.68(m,2H),1.60–1.42(m,2H),1.38(s,9H)。

向2-(3-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(3-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.79(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.03(t,J＝1.8Hz,1H),7.99–7.93(m,1H),7.93–7.88(m,2H),7.83(ddd,J＝8.1,2.1,1.0Hz,1H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.62–7.54(m,2H),4.28(s,2H),2.59(s,4H),2.21(s,3H),1.94–1.48(m,4H)。

化合物35e 2-((8-甲基-3-(萘-2-基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将甲基氨基(2-萘基)乙酸甲酯盐酸盐在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(萘-2-基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(萘-2-基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(萘-2-基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),9.18–9.11(m,1H),8.28(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),8.12–7.96(m,3H),7.68–7.57(m,2H),3.77–3.64(m,2H),3.64–3.51(m,1H),1.86–1.73(m,2H),1.73–1.62(m,2H),1.45(s,9H)。

向2-(萘-2-基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(萘-2-基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(萘-2-基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(萘-2-基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.93(d,J＝2.5Hz,1H),8.73–8.64(m,1H),8.59–8.52(m,1H),8.17–8.09(m,2H),8.09–7.88(m,4H),7.74–7.63(m,3H),7.62–7.55(m,1H),4.32(s,2H),3.68(s,2H),3.61–3.46(m,2H),1.88–1.71(m,2H),1.57–1.43(m,1H),1.39(s,9H)。

向2-(萘-2-基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((8-甲基-3-(萘-2-基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.79(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),7.99–7.95(m,1H),7.95–7.91(m,1H),7.91–7.85(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),7.16–7.10(m,2H),4.26(s,2H),3.86(s,3H),3.32(s,3H),2.65–2.53(m,4H),2.24–2.15(m,2H),1.89–1.29(m,4H)。

化合物35f 2-((3-(4-甲氧基苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将氨基(4-甲氧基苯基)乙酸甲酯盐酸盐在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(4-甲氧基苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),8.39–8.29(m,2H),7.11–7.01(m,2H),3.83(s,3H),3.71–3.48(m,4H),1.78–1.67(m,2H),1.67–1.54(m,2H),1.44(s,9H)。

向2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-甲氧基苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。

向2-(4-甲氧基苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(4-甲氧基苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.77(s,1H),8.92(d,J＝2.5Hz,1H),8.70–8.61(m,1H),7.99–7.93(m,1H),7.93–7.87(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),7.20–7.08(m,2H),4.27(s,2H),3.86(s,3H),3.73–3.57(m,2H),3.57–3.42(m,2H),1.81–1.67(m,2H),1.50–1.40(m,2H),1.37(s,9H)。

向2-(4-甲氧基苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(4-甲氧基苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.79(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),7.99–7.95(m,1H),7.95–7.91(m,1H),7.91–7.85(m,2H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.58(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),7.16–7.10(m,2H),4.26(s,2H),3.86(s,3H),2.65–2.53(m,4H),2.20(s,3H),1.89–1.29(m,4H)。

化合物35g 2-((3-(2-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将2-氨基-2-(2-溴苯基)乙酸甲酯在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(2-溴苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(2-溴苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(2-溴苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.23(s,1H),7.82–7.74(m,1H),7.64–7.40(m,3H),3.73–3.49(m,4H),1.78–1.68(m,4H),1.44(s,9H)。

向2-(2-溴苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(2-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.55(s,1H),7.73(dt,J＝7.8,0.9Hz,1H),7.53–7.40(m,3H),3.85–3.72(m,2H),3.55–3.43(m,2H),1.90–1.70(m,4H),1.44(s,9H)。

向2-(2-溴苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(2-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.78(s,1H),8.90(d,J＝2.5Hz,1H),8.65(d,J＝2.4Hz,1H),8.01–7.91(m,2H),7.83(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.63–7.47(m,4H),4.23(s,2H),3.68–3.53(m,4H),1.83–1.68(m,2H),1.68–1.54(m,2H),1.40(s,9H)。

向2-(2-溴苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((3-(2-溴苯基)-8-甲基-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.79(s,1H),8.91(d,J＝2.5Hz,1H),8.66(d,J＝2.5Hz,1H),7.95(ddd,J＝12.8,8.2,1.3Hz,2H),7.88–7.76(m,1H),7.66(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.62–7.46(m,4H),4.22(s,2H),2.72–2.53(m,4H),2.24(s,3H),1.94–1.64(m,4H)。

化合物35h 2-((8-甲基-3-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺的合成

将2-氨基-2-[4-(三氟甲基)苯基]乙酸甲酯盐酸盐在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(4-(三氟甲基)苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到3-氧代-2-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.36(s,1H),8.53(d,J＝8.1Hz,2H),7.91(d,J＝8.1Hz,2H),3.72–3.52(m,4H),1.85–1.60(m,4H),1.45(s,9H)。

向3-氧代-2-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.66(s,1H),8.58(d,J＝2.0Hz,1H),8.27(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),3.83–3.71(m,2H),3.61–3.45(m,2H),1.89–1.66(m,4H),1.45(s,9H)。

向3-硫代-2-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.97–8.88(m,1H),8.79–8.58(m,1H),8.19–8.08(m,1H),8.08–7.86(m,4H),7.77–7.52(m,2H),4.29(s,2H),3.72–3.46(m,4H),1.82–1.67(m,2H),1.61–1.43(m,2H),1.38(s,9H)。

向2-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-((8-甲基-3-(4-(三氟甲基)苯基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-2-基)硫基)-N-(喹啉-3-基)乙酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.09(t,J＝1.2Hz,1H),8.01–7.91(m,2H),7.91–7.83(m,2H),7.67(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.59(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),4.29(s,2H),2.70–2.57(m,4H),2.23(s,3H),1.98–1.46(m,4H)。

化合物35i 2-(3,4-二氯苯基)-3-((喹啉-3-基氨基甲酰基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯的合成

将2-氨基-2-(3,4-二氯苯基)乙酸甲酯盐酸盐在28％氢氧化铵(5mL/g)溶液中搅拌96小时，导致形成白色沉淀物形式的2-氨基-2-(3,4-二氯苯基)乙酰胺，通过过滤收集所述沉淀物，无需进一步纯化即可使用。向2-氨基-2-(3,4-二氯苯基)乙酰胺(1当量)于乙醇(0.1M)中的溶液中加入4-氧代-1-哌啶甲酸叔丁酯(1当量)，并将反应混合物加热至回流，持续12个小时。将反应混合物冷却到室温，并在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在DCM(0.1M)中，并加入N-溴琥珀酰亚胺(1当量)。将反应混合物搅拌8小时，并加入饱和的碳酸氢钠。将得到的混合物用DCM萃取。将有机物干燥，浓缩并通过FCC(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(3,4-二氯苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.55(d,J＝1.9Hz,1H),8.29(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),7.82(d,J＝8.4Hz,1H),3.70–3.51(m,4H),1.81–1.58(m,4H),1.44(s,9H)。

向2-(3,4-二氯苯基)-3-氧代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于THF(0.1M)中的溶液中加入劳森试剂(0.6当量)，并将反应混合物加热至60℃，直到通过TLC观察反应完成为止。将反应混合物浓缩至硅胶上，并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(3,4-二氯苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.66(s,1H),8.58(d,J＝2.0Hz,1H),8.27(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),3.83–3.71(m,2H),3.61–3.45(m,2H),1.89–1.66(m,4H),1.45(s,9H)。

向2-(3,4-二氯苯基)-3-硫代-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1-烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入2-溴-N-(喹啉-3-基)乙酰胺(1当量)和三乙胺(3当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物用DCM稀释，并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机层干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-100％EtOAc/己烷)纯化，从而得到2-(3,4-二氯苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.97–8.88(m,1H),8.79–8.58(m,1H),8.19–8.08(m,1H),8.08–7.86(m,4H),7.77–7.52(m,2H),4.29(s,2H),3.72–3.46(m,4H),1.82–1.67(m,2H),1.61–1.43(m,2H),1.38(s,9H)。

向2-(3,4-二氯苯基)-3-((2-氧代-2-(喹啉-3-基氨基)乙基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯(1当量)于DCM(0.1M)中的溶液中加入含4M HCl的二噁烷(2当量)，并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩。将得到的残余物吸收在THF中，并加入三乙胺(5当量)和甲醛(3当量)，随后加入NaBH(OAc)3(3当量)，并将反应混合物在室温下搅拌12小时。将反应混合物浓缩，吸收在EtOAc中，并用并用饱和的水性碳酸氢钠洗涤。将有机物干燥，浓缩并通过闪式柱色谱法(0-30％MeOH/DCM)纯化，从而得到2-(3,4-二氯苯基)-3-((喹啉-3-基氨基甲酰基)硫基)-1,4,8-三氮杂螺[4.5]癸-1,3-二烯-8-甲酸叔丁酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.80(s,1H),8.94(d,J＝2.5Hz,1H),8.67(d,J＝2.5Hz,1H),8.09(t,J＝1.2Hz,1H),8.01–7.91(m,2H),7.91–7.83(m,2H),7.67(ddd,J＝8.4,6.9,1.5Hz,1H),7.59(ddd,J＝8.1,6.8,1.3Hz,1H),4.29(s,2H),2.70–2.57(m,4H),2.23(s,3H),1.98–1.46(m,4H)。

药代动力学研究

实例44-经过纯化的EGFR激酶结构域与干扰素之间的相互作用

从SF9昆虫细胞表达并纯化了WT-EGFR激酶结构域(aa696-1022，活性激酶)。将100ng纯EGFR与结合生物素的干扰素一起孵育，并在用柠檬酸缓冲液洗涤后，使用CaptAvidin珠捕获结合的EGFR。通过与越来越多的非生物素化干扰素共孵育该反应，可以确认这种相互作用的特异性。在Laemmli缓冲液中释放结合的EGFR蛋白质，并通过SDS页面解析。使用ImageJ软件对结合干扰素的EGFR进行定量，并显示在印迹下方。冷干扰素对干扰素-EGFR结合的竞争性抑制表明干扰素直接与EGFR结合(参见图2B)。

实例45-干扰素处理对NCI-H1975细胞中EGF诱导的二聚化的影响

将NCI-H1975细胞用10μM干扰素处理1小时，再用EGF(30ng/ml)处理30分钟，再用辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS，150μM)处理30分钟，以使相互作用的蛋白质交联。制备裂解物并用抗EGFR抗体进行免疫印迹。(参见图3A)。

实例46-干扰素对其在NCI-H1975异种移植物中的靶EGFR的影响

在第1天和第2天，向携带NCI-H1975异种移植物的小鼠注射干扰素(10mg/kg，腹膜内)。在第3天，取出肿瘤并准备进行免疫印迹(参见图3B)。在连续两天(星期一到星期二)用干扰素(10mg/kg，腹膜内)注射进行处理后，评估干扰素对NCI-H1975异种移植物的影响。绘制每种处理条件的肿瘤体积。将乱序肽用作对照(参见图3C)。通过在处理2周后对肿瘤进行免疫染色，评估了处理对肿瘤组织学、EGFR表达和有丝***指数的长期影响(通过Ki-67评分测量)(参见图3D)。

实例47-化合物8C的开发和生物学活性的确认

已证明干扰素对TKI(厄洛替尼)耐药性NCI-H1975异种移植物模型有效(参见图3A-D)(14)。然而，由于不良的PK和肽药物开发中的其它挑战，因此进行了一项药物发现计划，以开发一种具有相似作用机制但药代动力学更好的小分子(参见图4A-D)。基于活性EGFR二聚体界面，使用虚拟屏幕、商业库获取和定制合成，开发了一系列新分子，其包含先导化合物95(C95)和67(C67)(参见图4A-D)。这两种先导分子均在体内对厄洛替尼耐药性NCI-H1975异种移植物模型具有活性。为了测试EGFR二聚体抑制作用的体内活性，使用了TKI耐药性NCI-H1975 EGFR报告子。这些肿瘤异种移植物在失去EGFR活性后显示出生物发光的诱导(47)。单次注射100mg/kg的C95导致EGFR报告子的2.5倍诱导，所述诱导持续48小时。(参见图9)。证实了C95处理对EGFR水平降低的影响与生物发光的变化相关。这些数据表明，可诱导EGFR降解的药物可以对TKI耐药性肿瘤有效。

在小鼠和人类的肝微粒体中，化合物8C比其先导(C95)稳定约20倍。化合物8C在UMSCC74B(一种由EGFR驱动的头颈部侵袭性肿瘤模型)中的功效测试。每天(星期一到星期五)以30mg/kg的剂量处理荷瘤小鼠，持续一周。基于单剂量PK曲线选择该剂量(参见图8A)。这种处理是安全的，并且产生显著的肿瘤生长延迟(参见图10)。

裸鼠中的奥希替尼耐药性Ba/F3细胞介导的腹水(通过腹膜内注射细胞)和实体瘤模型(通过皮下注射细胞)也用于功效研究。在腹水模型中进行了初步研究，并将化合物8C的影响与等剂量的奥希替尼(30mg/kg)的影响进行了比较。尽管仅在肿瘤负荷变高后才开始处理，但与奥希替尼处理组相比，单个30mg/kg剂量的化合物8C延长了这些小鼠的寿命(p＝0.072，数据未示出)。在处理前、处理后18小时和处理后24小时，在从同一只小鼠收集的细胞中证实了处理对EGFR的影响(参见图11)。

实例48-EGFR激酶结构域与化合物8C之间的直接相互作用

为了确定化合物8C是否竞争EGFR上的相同结合位点，在存在或不存在化合物8C的情况下，将生物素-干扰素-亲和素偶联的珠子与经过纯化的EGFR一起在37℃下孵育15分钟。将琼脂糖珠子旋转，然后通过在柠檬酸盐缓冲液中洗涤除去非特异性蛋白质。在Laemmli缓冲液中释放结合的蛋白质，并通过SDS页面解析。化合物8C对干扰素-EGFR结合的竞争性抑制表明该分子具有类似的作用机制(参见图5A)。

通过热稳定性测定证实了化合物8C对经过纯化的EGFR的热稳定性的影响。将100ng经过纯化的EGFR与DMSO或化合物8C(10μM)一起在4℃下孵育30分钟。使样品经受热灭活(20到44℃)，持续3分钟。通过在4℃下以13,000RPM离心10分钟将可溶性级分与骨料分离。在4-12％bis-tris凝胶上分离出约20ng可溶性蛋白质，并用抗EGFR抗体印迹。通过ImageJ软件量化并绘制的EGFR谱带强度(参见图5B)。在存在0到10μM化合物8C的情况下，确定化合物8C浓度对EGFR在44℃时的热稳定性的影响。如上所述对EGFR的可溶性级分进行定量和绘图(参见图5C)。

初步数据显示，化合物8C可能与干扰素结合在EGFR分子上的相同位点(参见图5A)，并且可以热稳定野生型以及奥希替尼耐药性(C797S)EGFR。如图5B和5C所示，将化合物8C与经过纯化的野生型EGFR激酶结构域一起孵育会改变解链曲线，这表明EGFR与化合物8C之间存在相互作用。为了确定化合物8C对奥希替尼耐药性EGFR突变体的影响，使用了基于细胞的测定法。将奥希替尼或化合物8C与由Ba/F3(C797S-EGFR)细胞制备的全细胞裂解液一起孵育。在存在DMSO、10μM奥希替尼或化合物8C的情况下，将等分试样加热至不同温度。冷却后，将样品离心，收集可溶性蛋白质级分，并使用抗EGFR抗体进行免疫印迹(参见图6A)。奥希替尼可有效改变经过纯化的WT-EGFR的解链温度(参见图5B)，但对C797S突变的EGFR蛋白质影响最小(参见图6A)。如所预期的，化合物8C有效地改变了奥希替尼耐药性EGFR的解链温度。这些数据表明，即使在EGFR-C797S中，化合物8C与EGFR之间也可能存在相互作用。

基于这些数据，假设化合物8C在由于C797S突变而对奥希替尼具有抗性的细胞中将保持有效。通过使用这些同基因的6-Ba/F3细胞类型(包含TKI敏感性细胞和耐药性细胞，表I)，证明了化合物8C在每种细胞系的纳摩尔范围内均保持活性。从这类药物中可以预期到这一点，因为所述药物的作用与EGFR激酶突变无关。在所有这些细胞中也证实了化合物8C对EGF诱导的EGFR二聚化和蛋白质表达的抑制作用。示出的数据来自具有C797S突变的奥希替尼耐药性Ba/F3细胞(参见图6B-6E)。

实例49-化合物8C在肺癌细胞系中的选择性活性的验证

为了测试化合物8C的选择性，用不同浓度处理奥希替尼耐药性肺癌细胞系(PC9-AZR和HCC827-AZR)以及正常的肺成纤维细胞(MRC5)，并使用克隆形成存活测定法确定细胞存活率(参见下面的图7A和表3)。这些初步数据表明，化合物8C选择性杀死由EGFR驱动的癌细胞。确定对化合物8C的反应是否与对EGF诱导的二聚化和EGFR降解的抑制作用相关。为此，将PC9-AZR细胞用1μM化合物8C处理1小时，再用EGF(30ng/ml)处理30分钟，再用辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS，150μM)处理30分钟，以使相互作用的蛋白质交联。制备裂解物并用抗EGFR抗体进行免疫印迹。图7B显示，1μM化合物8C可抑制EGFR二聚化并诱导EGFR降解。总体而言，这些结果证实了Ba/F3细胞的发现。

实例50-生存力测定

根据制造商的规程，在RKO、UM10B、UM1、MCR5和UMCC92细胞中，通过

试剂评估处理后细胞的生存力。简而言之，将10,000个细胞以四倍体平板接种在96孔板中。接种后一天，用一系列浓度(0.1到30微摩尔)对细胞进行处理。处理后3天，将细胞与试剂一起孵育4小时。只有活细胞将氧化还原染料(reszurin)转化为荧光产物(resofurin)。测得的荧光发射(激发560nM)为590nM。IC₅₀值计算为抑制细胞增殖所需的化合物平均浓度，如通过590nM处的荧光所测量的，与用媒剂处理的对照相比，该平均浓度为50％。结果呈现在下面的表3和表4中。

表3

表4

实例51-化合物8C在肿瘤和血浆中的体内药代动力学

通过腹膜内注射施用药剂的短期PK研究显示，化合物8C选择性地在肿瘤中积累，尽管事实是其已从血浆中迅速清除(参见图8A和8B)。在肿瘤中达到的化合物8C的峰值浓度(≥7小时为69.7±15.68μM)远远大于杀死99％的TKI耐药性肿瘤细胞所需的浓度。PC9-AZR和HCC827-AZR的IC₅₀和IC₉₀的范围为到

(参见图7A)。有趣的是，30分钟的峰值血浆浓度为5.4±1.5μM。化合物8C的血浆半衰期为7.96小时，但是在肿瘤中的半衰期远大于24小时(参见图8A)。尽管具有快速的全身清除作用，但延长的药物在肿瘤中的积累对于治疗用途是理想的。24小时时间点的数据表明该药剂可能适合于日常施用。观察到化合物8C在经腹膜内注射的肿瘤中的选择性积累后，确定化合物8C是否可口服获得。对于口服施用，在短暂超声处理后，将化合物8C配制在含20％tween80的PBS(v/v)中。小鼠通过口服灌胃接受了100mg/kg。测定了在7小时、15小时和24小时处，肿瘤和血浆样品中化合物8C的浓度，并将其绘制在图8B中。

对于腹膜内注射，通过将pH调节至5.5，将化合物8C以10mg/mL配制在具有5％DMSO的PBS中。对于口服施用，经短暂的超声处理，在20％tween 80中制备均匀的悬浮液。最初，将单剂量100mg/kg的化合物8C通过腹膜内给予(图8A)或灌胃到携带人NCI-H1975肿瘤异种移植物(>150mm3)的裸鼠体内(图8B)。在0、30分钟、1小时、3小时、7小时、15小时和24小时处，对小鼠实施安乐死。收集肿瘤和血浆样品。在小鼠经口腔灌胃的情况下，仅在7小时、15小时和24小时处收集血浆和肿瘤样品。测定血浆和肿瘤中化合物8C的浓度，并将得到的数据以摩尔浓度绘制。

实例52-体内EGFR报告子的验证

该方法已用化合物C95验证。简而言之，一旦肿瘤达到约100mm³的大小，就对小鼠进行成像，以获取基础生物发光以及先导化合物95在不同时间点的影响(参见图9A)。定量并绘制了生物发光的变化(参见图9B)。最后，处理48小时后通过免疫印迹证实了处理对EGFR蛋白质水平的影响。

实例53-化合物8C的体内活性

用(每天30mg/kg，持续一周)或用媒剂(5％DMSO，于PBS中)处理携带UMSCC74B()的裸鼠。每组至少有5只小鼠。每周记录3-4次肿瘤体积和体重，并绘制平均肿瘤体积随时间的变化。处理期间体重的平均损失小于10％。误差条表示平均值的标准误差。

对于化合物8C处理组，将第0天定义为处理的第一天。在媒剂对照小鼠中，将第0天定义为化合物8C处理组中肿瘤体积最接近处理开始当天的平均肿瘤体积的一天。为了评估肿瘤体积增长率是否因处理而异，将混合效应模型与小鼠水平上的随机截距项拟合，以说明一段时间内肿瘤内以及小鼠内2个肿瘤之间的相关结果。单一给药一周后，单药治疗显著降低了肿瘤的生长速度(参见图10)。与时间匹配对照组(p＝0.013)和整体对照组(p<0.001)相比，化合物8C处理组的肿瘤生长速率明显更低。

实例54-化合物8C在奥希替尼耐药性肿瘤模型中的影响。

为了测试化合物8C对奥希替尼耐药性EGFR驱动的肿瘤的活性，使用如先前报告的Ba/F3-AZR细胞(L858R+T790M+C797S-EGFR)开发了腹水肿瘤模型(65)。通过腹膜内注射将500万个BA/F3-AZR细胞注射到6周龄的雌性裸鼠中。小鼠发展出腹水肿瘤，观察到平均生存时间为20天。为了测试化合物8C与奥希替尼相比的功效，向经注射的15只小鼠注射Ba/F3-AZR细胞。注射肿瘤细胞后18天，将小鼠随机分为三组。用媒剂、单次口服剂量的30mg/kg奥希替尼或30mg/kg化合物8C通过腹膜内注射处理小鼠。监测小鼠的健康，并根据ULAM终期指南对小鼠实施安乐死。尽管在肿瘤负荷变高后才开始处理，但与奥希替尼处理组相比，单个30mg/kg剂量的化合物8C延长了这些小鼠的寿命。媒剂对照和奥希替尼处理组之间没有差异。使用对数秩检验(p＝0.072)计算奥希替尼与化合物8C之间的差异。为了测试处理对靶标的影响，在处理前、处理后18小时和处理后24小时从一只小鼠收集肿瘤细胞。用PBS洗涤细胞并按照图3所述进行处理，图11给出了免疫印迹结果，该结果显示了处理对EGFR、pEGFR和其它分子的影响。

实例55-化合物8C在小鼠模型中的初步安全性测试。

使用C57BL6小鼠进行了持续一周每日30mg/kg剂量的初步安全性测试。在处理期间监测一组6只小鼠的总体健康状况和体重。在处理一周后观察到体重有3.5±2.4％的适度下降，但是在停止处理后2天小鼠完全恢复了体重。

实例56：NCI 60细胞系筛选

使用标准的NCI 60筛选方案，在国立癌症研究所测试了化合物8C对60种不同的人类肿瘤细胞系的活性。下表5给出了表现最佳的细胞系的生长抑制百分比。

表5

组	细胞系	生长百分比
			黑色素瘤	SK-MEL-5	-96.2
结肠癌	HCT-116	-90.7
			黑色素瘤	M14	-83.8
肾癌	786-0	-81.7
			黑色素瘤	UACC-62	-78.9
黑色素瘤	LOXIMVI	-78.5
			结肠癌	COLO205	-76.2
黑色素瘤	MALME-3M	-75.5
			黑色素瘤	SK-MEL-28	-70.1
结肠癌	HT29	-67.1
			白血病	K-562	-61.5
黑色素瘤	UACC-257	-61.2
			结肠癌	HCC-2998	-51.3
乳腺癌	MDA-MB-468	-43.8
			乳腺癌	MCF7	-42.7
白血病	HL-60(TB)	-40.7
			乳腺癌	MDA-MB-231/ATCC	-40.5

实例57：化合物8C在胰腺肿瘤模型中的影响

通过口服灌胃用化合物8C处理6周龄的KC小鼠(每天30mg/kg体重)。与未接受化合物8C的对照小鼠相比，观察到了对PanIn水平的最终影响。经化合物8C处理的小鼠胰显示出显著降低的发展为PanIn(胰腺上皮内瘤变)(一种胰腺导管病变)的倾向，如图13所示。

实例58：化合物8C在头颈部肿瘤模型中的影响

通过口服灌胃用化合物8C处理UMSCC74B(头颈部肿瘤细胞系)的小鼠异种移植物(30mg/kg体重，每周两次)。与未接受化合物8C的对照小鼠和接受了西妥昔单抗的对照小鼠相比，观察到了对肿瘤体积的最终影响。与两个对照相比，经化合物8C处理的小鼠显示出明显减小的肿瘤体积，如图14所示。

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