阅读说明：本技术 一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵及其制备方法 (Crosslinked collagen sponge capable of slowly releasing ibuprofen and metronidazole and preparation method thereof ) 是由 叶鹏 魏泰 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵及其制备方法,其解决了现有口腔材料不能快速止血、杀菌和止疼的技术问题,其含有甲硝唑18～33μg/mm<Sup>3</Sup>,布洛芬97～118μg/mm<Sup>3</Sup>,所述胶原蛋白海绵呈交联状态；所述甲硝唑的释放时间5～11天；所述布洛芬的缓释时间5～11天。本发明还提供了其制备方法。本发明可广泛用于口腔材料的制备领域。(The invention relates to a crosslinked collagen sponge for slowly releasing ibuprofen and metronidazole and a preparation method thereof, which solve the technical problem that the existing oral cavity material cannot quickly stop bleeding, sterilize and relieve pain, and contain 18-33 mug of metronidazolemm 3 97-118 mu g/mm ibuprofen 3 The collagen sponge is in a cross-linked state; the release time of the metronidazole is 5-11 days; the sustained release time of the ibuprofen is 5-11 days. The invention also provides a preparation method of the composition. The invention can be widely applied to the field of preparation of oral materials.)

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种口腔医用材料及其制备方法，具体说是一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵及其制备方法。

背景技术

阻生齿是因邻牙、骨或软组织的阻碍只能部分萌出或完全不能萌出的牙齿。由于阻生齿位置特殊，伴有不同程度软硬组织阻挡，手术难度大，术中需去除部分牙槽骨，术后骨髓腔暴露，甚至骨壁内小血管开放，创口出血明显，若处理不当，术后可能发生严重的出血。

胶原蛋白作为一种生物相容性优异且可降解的天然活性材料，具有良好的止血效果。其止血机制包括：(1)胶原分子具有良好的亲水性，可通过接触伤口吸附创面渗血，促进血痂形成，阻塞断裂的血管；(2)胶原对血液中的血小板具有聚集作用，且胶原可刺激血小板进一步释放凝血因子，激活机体的内源性凝血机制，达到止血效果。胶原蛋白虽然止血效果良好，但其本身不具备抗炎及缓解疼痛的作用。

口腔是一个持续存在细菌的环境，阻生齿拔除术后口腔定植细菌可进入创口内繁殖引起感染。多数患者阻生齿拔除术后会出现面颊部肿胀、疼痛，感染症状可能被肿痛症状掩盖，无法及时发现。同时，感染的出现会加剧患者疼痛，延缓创面愈合，甚至发展为邻近软组织间隙感染，继发更加严重的功能障碍，甚至危及生命。研究发现导致阻生齿术后感染的病原菌多为厌氧菌(如梭杆菌、普氏菌及消化链球菌等)，这提示患者在阻生智齿拔除术后可针对厌氧菌合理使用抗生素，以降低术后感染率。若口服或静脉输注抗生素，部分患者可能出现恶心、呕吐、腹泻、肝肾功能损伤或肠道菌群失调等不良反应；另外全身用药时，药物因首过效应，到达拔牙创口局部的血药浓度过低而无法完全发挥作用。

阻生齿因同时存在软、硬组织阻挡，拔除术中需切开牙龈组织，并去除部分牙槽骨，术后疼痛明显(通常持续5～10天)，影响患者正常生活，引发患者焦虑，降低患者对后续治疗的依从性；同时术后疼痛还可能诱发机体不良反应，比如消化道溃疡、心动过速、血压升高等严重应激反应。阻生齿拔除术所导致的疼痛分两个阶段：阶段一是创伤性刺激，比如切割牙龈、去骨等；阶段二是术后炎症反应，在此阶段，受到创伤的组织释放各种化学物质，其中之一叫花生四烯酸，经环氧合酶合成***素，可以降低伤害性感受器兴奋阈值而导致疼痛。非甾体类抗炎药主要作用机制是通过抑制环氧合酶，阻止花生四烯酸转化为***素而达到镇痛作用。布洛芬是临床最常用非甾体类解热镇痛药物。阻生齿拔除术后患者几乎都需要口服布洛芬镇痛。但口服布洛芬，部分患者可能出现皮疹、烧心、肠胃不适、消化道溃疡甚至出血等严重药物不良反应；同时布洛芬入血后，经过肝脏代谢，药物半衰期仅为2小时左右，药物作用时间较短；为维持药效，需重复多次给药，进一步增大了不良反应发生率。

发明内容

本发明就是为了解决现有口腔材料不能快速止血、杀菌和止疼的技术问题，提供一种可快速止血，并具有杀菌和止疼效果的缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵及其制备方法。

为此，本发明提供一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，其含有胶原蛋白海绵，其还含有甲硝唑18～33μg/mm³，布洛芬97～118μg/mm³，所述胶原蛋白海绵呈交联状态；所述甲硝唑的释放时间5～11天；所述布洛芬的缓释时间5～11天。

优选的，所述缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵含有甲硝唑23～33μg/mm³、布洛芬104～118μg/mm³；所述甲硝唑的释放时间9～11天；所述布洛芬的缓释时间9～11天。

优选的，含甲硝唑28μg/mm³、布洛芬111μg/mm³；所述甲硝唑的释放时间11天；所述布洛芬的缓释时间11天。

本发明同时提供一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵的制备方法，其使用超临界溶液浸渍法将布洛芬和甲硝唑加载到交联胶原蛋白海绵中，制得缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵。

优选的，本发明提供的缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵制备方法，包括以下步骤：(1)取新鲜牛腱，去除筋膜及脂肪杂质，洗净后切成碎末，水浴循环脱脂，灭菌，加入胃蛋白酶，提取得到胶原粗溶液，经灭酶后，高效液相色谱纯化得到纯化胶原蛋白溶胀液；(2)将所述步骤(1)得到的纯化胶原蛋白溶胀液浇注进无菌培养皿，置于冷冻干燥机，抽真空，冻干，得到胶原蛋白海绵；(3)在所述步骤(2)获得的胶原蛋白海绵中加入戊二醛，常温交联，交联后漂洗，再次冻干，得到交联完成的胶原蛋白海绵；(4)将所述步骤(3)得到的交联胶原蛋白海绵裁剪成长方体形状；(5)采用超临界流体装置，通过超临界溶液浸渍法将布洛芬及甲硝唑负载于所述步骤(4)得到的交联胶原蛋白海绵上。

优选的，所述步骤(3)中，所述戊二醛的浓度为0.1～0.4％g/ml；交联时间为30～90min。

优选的，所述步骤(3)中，所述戊二醛的浓度为0.2％g/ml；交联时间为60min。

优选的，所述步骤(5)中，将布洛芬及甲硝唑研磨成粉，混合后包裹于滤纸中并固定在高压釜的顶部，将交联胶原蛋白海绵置于高压釜底部；布洛芬、甲硝唑与交联胶原蛋白海绵无直接接触；然后，CO₂经钢瓶流出，经过冷却槽冷却成为液体，经高压泵加压，预热，进入压力高压釜中浸渍胶原蛋白海绵；然后关闭钢瓶、高压泵，打开泄压阀卸去高压，得到负载布洛芬及甲硝唑的交联胶原蛋白海绵。

优选的，步骤(5)中，预热温度为30～45℃；高压釜内压力为5～25MPa；浸渍时间为1～3h。

优选的，步骤(5)中，预热温度为40℃；高压釜内压力为15MPa；浸渍时间为2h。

胶原蛋白海绵作为一种具有良好生物相容性和可降解性的天然生物高分子材料，其本身可以作为一种良好的缓释药物载体。但天然胶原蛋白机械强度较弱，降解速度不易控制，常因降解过快、过早塌陷而造成负载药物过快释放，无法持续发挥药效。为此，本发明通过戊二醛化学交联技术对天然胶原蛋白进行改性，增强其机械强度，减缓降解速度，实现降解基本可控。不同浓度戊二醛，交联不同时间可获得不同交联度的胶原蛋白，其抗降解性能也各有差异。戊二醛浓度过低仅使胶原蛋白海绵表面发生交联反应，戊二醛浓度过高会使胶原蛋白部分变质，导致蛋白分子链分解，更容易被酶降解。交联胶后的原蛋白海绵在拔牙窝内降解时间约为1～2周，而拔牙创出现疼痛和发生感染风险的时间多在术后1～10天。所以交联胶原蛋白海绵的降解速率使其成为一种优良的缓释药物载体，能够充分满足临床需求。

甲硝唑是临床治疗和预防厌氧菌最常使用的抗生素，价格低廉，应用广泛。针对口腔常见厌氧菌，甲硝唑抑制90％细菌生长的最低药物浓度(MIC90)为0.5～4μg/ml。布洛芬是一种应用广泛的非甾体类解热镇痛药，其通过抑制环氧化酶，减少***素的合成而产生镇痛作用。布洛芬发挥镇痛作用的血药浓度为30～70μg/ml。而阻生齿拔除术后拔牙窝体积通常仅约2ml。为在拔牙窝局部维持有效的药物浓度，仅需很少量的甲硝唑及布洛芬。因此，将相应质量的甲硝唑及布洛芬加载到胶原蛋白海绵中，并缓慢释放，足以在拔牙窝较长时间维持有效的药物浓度。本发明不仅可以提高局部药物有效浓度，持续发挥抗感染及镇痛作用，明显改善患者术后生活质量，同时还降低了因全身用药导致的消化道症状及肝肾功能损害等。

本发明中使用的超临界溶液浸渍法，可以将小分子物质负载到聚合物中，主要是利用超临界流体高扩散系数、低粘度及对聚合物的溶胀作用的特性，使小分子物质扩散进入聚合物，并吸附包裹其中。超临界溶液浸渍法可用于制备缓释药物，使药物在基质中均匀吸附分布，缓慢释放。

通过超临界溶液浸渍法加载于聚合物的药物主要包括三部分：(1)溶解于流体中的药物分子通过分子间作用力广泛吸附于溶胀后的聚合物内部；(2)泄压过程中，药物分子形成晶体驻留在聚合物载体中；(3)泄压过程中，药物分子结晶吸附在聚合物载体外表面。在临床使用时，第三部分药物分子首先接触组织液，快速释放；随后，组织液渗入聚合物，溶解其中驻留的药物晶体，使其缓慢释放；最后溶解的是第一部分靠分子间作用力吸附于载体内的药物分子，其随着载体的降解而缓慢释放，作用时间最长，速度可控。所以为保证缓释药物长时间、稳定的释放，需要尽可能提高第一部分药物分子的载药量。

若以胶原蛋白海绵作为药物载体，首先，可通过戊二醛交联，对胶原蛋白海绵进行化学修饰，提高其抗降解性能，减慢药物释放速度。其次，通过调节超临界溶液浸渍过程中压力、温度及浸渍时间，可达到最高的载药量，延长药物释放时间。

超临界溶液浸渍过程中，高压釜中压力越大，药物分子在CO₂中的溶解度越高，随CO₂加载到胶原蛋白海绵中的药量就越大；但当加载药物达到饱和时，在泄压过程中，因药物与CO₂亲和力更强，药物将随CO₂排出而脱离胶原蛋白海绵，导致载药量降低。药物分子在CO₂的溶解度随着温度升高而逐渐提高，但当温度过高时，胶原蛋白海绵发生变质，影响药物吸附，反而导致载药量降低。另外，药物分子在胶原蛋白海绵中的加载量随着时间延长而增加，但当达到饱和后，便不再随时间延长而增加，甚至有所降低。通过实验发现在15MPa压力、40℃温度条件下浸渍时间2h，胶原蛋白海绵的载药量可达到最大。

附图说明

图1为本发明超临界溶液浸渍法实验流程图，其中，1、压力阀；2、冷却槽；3、高压泵；4、预热器；5、高压釜；6、压力检测器；7、温度检测器；8、加热夹套；9、交联胶原蛋白海绵；10、布洛芬及甲硝唑；11、搅拌器。

图2A和图2B为明胶海绵拔牙创内使用示意图，图中，21、下颌骨；22、阻生齿拔除术后创口；23、负载甲硝唑和布洛芬的交联胶原蛋白海绵。

图3A和图3B为9种不同交联方式胶原蛋白海绵(1800mm³)的甲硝唑及布洛芬累积释放率比较图。其中图3A为甲硝唑累积释放率；图3B为布洛芬累积释放率。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所描述的本发明。

下面将结合本发明实施例，对本发明进行清楚、完整地描述。本发明实施例均应用于埋伏阻生齿拔除术，术中均涉及牙龈切开、牙槽骨去骨及牙龈缝合。术后记录创口出血时间、感染情况、术后第一、二、三、五、七及九天VAS疼痛评分(结果见表1)。VAS疼痛评分标准是将疼痛的程度用0～10共11个数字表示。0表示无痛，10代表最痛，病人根据自身疼痛程度在这11个数字中挑选一个数字代表疼痛程度。0分：无疼痛；3分及以下：有轻微疼痛，患者能忍受；4～6分：患者疼痛并影响睡眠，能忍受；7～10分：患者有渐强烈的疼痛，疼痛剧烈。

以下描述的实施例仅是本发明的一部分，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：300mm³交联胶原蛋白海绵、3.9mg甲硝唑及27mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法制成含13μg/mm³浓度甲硝唑及90μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。将制成的胶原蛋白海绵填塞于阻生齿拔除术后创口内，牙龈缝合。

具体步骤如下：

(1)取新鲜牛腱，去除筋膜及脂肪等杂质，洗净后切成碎末，35℃水浴循环脱脂3h，25℃水浴，灭菌，加入胃蛋白酶，在pH为1.6，粉液比(g/ml)为1：20条件下，提取24h得到胶原粗溶液，经灭酶后，高效液相色谱纯化得到纯化胶原蛋白溶胀液；

(2)将纯化胶原蛋白溶胀液浇注进无菌培养皿，置于冷冻干燥机，抽真空，冻干24h，得到胶原蛋白海绵。

(3)在获得的胶原蛋白海绵中加入0.2％戊二醛，常温交联1h。交联后的胶原海绵用PBS反复漂洗3次，然后再次冻干，得到交联完成的胶原蛋白海绵。

(4)将交联胶原蛋白海绵裁剪成10mm*10mm*3mm长方体形状；

(5)采用超临界流体装置，通过超临界溶液浸渍法将不同质量布洛芬及甲硝唑负载于相应体积大小的交联胶原蛋白海绵。具体流程如下：将布洛芬及甲硝唑研磨成粉，混合后包裹于滤纸中并固定在高压釜的顶部，将交联胶原蛋白海绵置于高压釜底部。布洛芬、甲硝唑与交联胶原蛋白海绵无直接接触。然后，CO₂经钢瓶流出，经过冷却槽冷却成为液体，经高压泵加压后，预热至40℃，进入压力为15MPa的高压釜，浸渍过程保持2h。然后，关闭钢瓶、高压泵，打开泄压阀卸去高压，得到负载布洛芬及甲硝唑的交联胶原蛋白海绵。

实施例2

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：600mm³交联胶原蛋白海绵、10.8mg甲硝唑及58.2mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法制成含18μg/mm³浓度甲硝唑及97μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。将制成的交联胶原蛋白海绵填塞于阻生齿拔除术后创口内，牙龈缝合。

其它同实施例1。

实施例3

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1200mm³交联胶原蛋白海绵、27.6mg甲硝唑及124.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法制成含23μg/mm³浓度甲硝唑及104μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。将制成的胶原蛋白海绵填塞于阻生齿拔除术后创口内，牙龈缝合。

其它同实施例1。

实施例4

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(30mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法制成含28μg/mm³浓度甲硝唑及111μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。将制成的胶原蛋白海绵填塞于阻生齿拔除术后创口内，牙龈缝合。

其它同实施例1。

实施例5

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：2400mm³交联胶原蛋白海绵、79.2mg甲硝唑及283.2mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。将制成的胶原蛋白海绵填塞于阻生齿拔除术后创口内，牙龈缝合。

其它同实施例1。

为评估不同戊二醛浓度及交联时间对胶原蛋白海绵降解速率的影响。在步骤2后按戊二醛浓度0.1％，交联30min；二醛浓度0.2％，交联30min；二醛浓度0.4％，交联30min；二醛浓度0.1％，交联60min；浓度0.2％，交联60min；浓度0.4％，交联60min；浓度0.1％，交联90min；浓度0.2％、交联90min；浓度0.4％，交联90min 9种方式分别进行交联，随后按步骤5制作9块尺寸为1800mm³并含甲硝唑浓度28μg/mm³及布洛芬浓度111μg/mm³的胶原蛋白海绵。将此9块不同交联方式的胶原蛋白海绵，分别完全浸入9只装有50ml胎牛血清的无菌离心管中，放入37℃培养箱。1、2、3、5、7、9、11及13天后，从每只离心管中分别吸取0.2ml血清(0.1ml用于测定甲硝唑浓度，0.1ml用于测定布洛芬浓度)，通过高效液相色谱法测定甲硝唑及布洛芬浓度(C_甲及C_布)。随后按照以下公式进行计算：甲硝唑累积释放率＝C_甲*50/(海绵内甲硝唑浓度*海绵体积)*100％，即C_甲*50/(28*1800)*100％；布洛芬累积释放率＝C_布*50/(海绵内布洛芬浓度*海绵体积)*100％，即C_布*50/(111*1800)*100％。最终，获得各实施例各测量时间点的累积释放率(结果见表2、表3)。

实施例6

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.1％，交联时间30min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.1％戊二醛，常温交联30min外，其他同实施例1。

实施例7

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.2％，交联时间30min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.2％戊二醛，常温交联30min外，其他同实施例1。

实施例8

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.4％，交联时间30min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.4％戊二醛，常温交联30min外，其他同实施例1。

实施例9

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.1％，交联时间60min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.1％戊二醛，常温交联60min外，其他同实施例1。

实施例10

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.2％，交联时间60min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.2％戊二醛，常温交联60min外，其他同实施例1。

实施例11

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.4％，交联时间60min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.4％戊二醛，常温交联60min外，其他同实施例1。

实施例12

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.1％，交联时间90min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.1％戊二醛，常温交联90min外，其他同实施例1。

实施例13

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.2％，交联时间90min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.2％戊二醛，常温交联90min外，其他同实施例1。

实施例14

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。使用戊二醛浓度为0.4％，交联时间90min，形成交联胶原蛋白海绵，再通过超临界溶液浸渍法制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算1、2、3、5、7、9、11及13天后甲硝唑及布洛芬累积释放率。

除使用0.4％戊二醛，常温交联90min外，其他同实施例1。

为评估超临界溶液浸渍过程中，高压釜压力对胶原蛋白海绵中甲硝唑及布洛芬载药量的影响。按照步骤1～4制作5块1800mm³(40mm*20mm*3mm)的胶原蛋白海绵，随后在步骤5中分别按压力5MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h；压力10MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h；15MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h；压力20MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h；压力25MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h5种方式进行药物浸渍(原料：甲硝唑50.4mg及布洛芬199.8mg)，随后将5块胶原蛋白海绵分别称重，记为M；随后将其分别放入5个装有20ml 0.2％胶原蛋白酶生理盐水溶液的离心管中，放入37℃培养箱，72小时后胶原蛋白完全溶解。重新记录每离心管中液体体积V，随后通过高效液相色谱法测定每离心管中甲硝唑及布洛芬浓度(C_甲及C_布)。随后按照如下公式进行计算：甲硝唑载药量＝C_甲*V/(M-C_甲*V)*100％；布洛芬载药量＝C_布*V/(M-C_甲*V)*100％。最终，获得各实施例甲硝唑及布洛芬载药量。(结果见表4)。

实施例15

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，高压釜压力为5MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除高压釜压力为5MPa外，其他同实施例1。

实施例16

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，高压釜压力为10MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除高压釜压力为10MPa外，其他同实施例1。

实施例17

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，高压釜压力为15MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除高压釜压力为15MPa外，其他同实施例1。

实施例18

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，高压釜压力为20MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除高压釜压力为20MPa外，其他同实施例1。

实施例19

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，高压釜压力为25MPa，浸渍温度40℃，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除高压釜压力为25MPa外，其他同实施例1。

为评估超临界溶液浸渍过程中，温度对胶原蛋白海绵中甲硝唑及布洛芬载药量的影响。按照步骤1～4制作4块1800mm³(40mm*20mm*3mm)的胶原蛋白海绵，随后在步骤5中分别按浸渍温度30℃，压力15MPa，浸渍2h；浸渍温度35℃，压力15MPa，浸渍2h；浸渍温度40℃，压力15MPa，浸渍2h；浸渍温度45℃，压力15MPa，浸渍2h 4种方式进行药物浸渍(原料：甲硝唑50.4mg及布洛芬199.8mg)，随后将4块胶原蛋白海绵分别称重，记为M；随后将其分别放入5个装有20ml 0.2％胶原蛋白酶生理盐水溶液的离心管中，放入37℃培养箱，72小时后胶原蛋白完全溶解。重新记录每离心管中液体体积V，随后通过高效液相色谱法测定每离心管中甲硝唑及布洛芬浓度(C_甲及C_布)。随后按照如下公式进行计算：甲硝唑载药量＝C_甲*V/(M-C_甲*V)*100％；布洛芬载药量＝C_布*V/(M-C_甲*V)*100％。最终，获得各实施例甲硝唑及布洛芬载药量。(结果见表5)。

实施例20

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍温度为30℃，高压釜压力15MPa，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍温度为30℃外，其他同实施例1。

实施例21

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍温度为35℃，高压釜压力15MPa，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍温度为35℃外，其他同实施例1。

实施例22

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍温度为40℃，高压釜压力15MPa，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍温度为40℃外，其他同实施例1。

实施例23

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍温度为45℃，高压釜压力15MPa，浸渍2h，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍温度为45℃外，其他同实施例1。

为评估超临界溶液浸渍过程中，浸渍时间对胶原蛋白海绵中甲硝唑及布洛芬载药量的影响。按照步骤1～4制作5块1800mm³(40mm*20mm*3mm)的胶原蛋白海绵，随后在步骤5中分别按浸渍1h，浸渍温度40℃，压力15MPa；浸渍1.5h，浸渍温度40℃，压力15MPa；浸渍2h，浸渍温度40℃，压力15MPa；浸渍2.5h，浸渍温度40℃，压力15MPa；浸渍3h，浸渍温度40℃，压力15MPa 5种方式进行药物浸渍(原料：甲硝唑50.4mg及布洛芬199.8mg)，随后将5块胶原蛋白海绵分别称重，记为M；随后将其分别放入5个装有20ml 0.2％胶原蛋白酶生理盐水溶液的离心管中，放入37℃培养箱，72小时后胶原蛋白完全溶解。重新记录每离心管中液体体积V，随后通过高效液相色谱法测定每离心管中甲硝唑及布洛芬浓度(C_甲及C_布)。随后按照如下公式进行计算：甲硝唑载药量＝C_甲*V/(M-C_甲*V)*100％；布洛芬载药量＝C_布*V/(M-C_甲*V)*100％。最终，获得各实施例甲硝唑及布洛芬载药量。(结果见表6)。

实施例24

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍时间为1h，浸渍温度40℃，高压釜压力15MPa，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍时间为1h，其他同实施例1。

实施例25

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍时间为1.5h，浸渍温度40℃，高压釜压力15MPa，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍时间为1.5h，其他同实施例1。

实施例26

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍时间为2h，浸渍温度40℃，高压釜压力15MPa，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍时间为2h，其他同实施例1。

实施例27

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍时间为2.5h，浸渍温度40℃，高压釜压力15MPa，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍时间为2.5h，其他同实施例1。

实施例28

一种缓释布洛芬和甲硝唑的交联胶原蛋白海绵，包括以下原料：1800mm³(40mm*20mm*3mm)交联胶原蛋白海绵、50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬。通过超临界溶液浸渍法，浸渍时间为3h，浸渍温度40℃，高压釜压力15MPa，制成含33μg/mm³浓度甲硝唑及118μg/mm³浓度布洛芬的交联胶原蛋白海绵。随后计算甲硝唑及布洛芬载药量。

除浸渍时间为3h，其他同实施例1。

对比例1

与实施例4相比，不含有交联胶原蛋白海绵，其他与实施例4相同。将50.4mg甲硝唑及199.8mg布洛芬粉末混合后放入拔牙创内，牙龈缝合。

对比例2

与实施例10相比，胶原蛋白海绵不进行戊二醛交联，其他与实施例10相同。计算甲硝唑及布洛芬载药量。

表1实施例及对比例术后出血时间、感染及VAS疼痛评分对比结果。

从表1结果可以看出，本发明制备的交联胶原蛋白海绵直接作用于拔牙窝内，止血、镇痛及抗炎效果良好，药效持续时间较长。因阻生齿拔牙窝体积多为2ml左右，实施例5的胶原蛋白海绵体积为2.4ml，吸附血液后体积进一步增大，填塞进拔牙窝后，胶原蛋白海绵会突出拔牙窝骨壁外，无法完全发挥镇痛及抗炎作用，同时因其体积膨胀压迫骨壁，术后早期局部疼痛会有所加重。综合对比，实施例4(1800mm³胶原蛋白海绵，含28μg/mm³甲硝唑及111μg/mm³布洛芬)是最佳配方。

表2不同交联方式的胶原蛋白海绵中甲硝唑累积释放率比较。

表3不同交联方式的胶原蛋白海绵中布洛芬累积释放率比较。

从表2和表3中结果可以看出，采用0.2％g/ml浓度戊二醛，交联60分钟的胶原蛋白海绵释放甲硝唑及布洛芬的速度最慢，持续时间最长(可达11天)，而其他交联方法在5～7天时药物已基本释放完毕，无法完全满足临床抗炎及镇痛时长需求，因此实施例10是最佳技术方案。

表4不同浸渍压力处理的胶原蛋白海绵中甲硝唑及布洛芬载药量比较。

从表4结果可以看出，超临界溶液浸渍过程中，在40℃，浸渍2h条件下，压力为15MPa时甲硝唑及布洛芬的载药量最大。所以经对比，实例17是最佳技术方案。

表5不同浸渍温度处理的胶原蛋白海绵中甲硝唑及布洛芬载药量比较。

从表5结果可以看出，超临界溶液浸渍过程中，在压力15MPa、浸渍2h条件下，温度为40℃时甲硝唑及布洛芬的载药量最大。所以经对比，实例22是最佳技术方案。

表6不同浸渍时间处理的胶原蛋白海绵中甲硝唑及布洛芬载药量比较。

从表6结果可以看出，超临界溶液浸渍过程中，在温度40℃、压力15MPa条件下，浸渍2h时甲硝唑及布洛芬的载药量最大。所以经对比，实例26是最佳技术方案。

对于本领域技术人员而言，本发明不限于上述示范性实施例的细节；以上实施例均是示范性，非限制性的；本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。