一种仿刺参肠道中芽孢杆菌cqn-2相对定量检测方法
阅读说明：本技术 一种仿刺参肠道中芽孢杆菌cqn-2相对定量检测方法 (Relative quantitative detection method for bacillus CQN-2 in stichopus japonicus intestinal tract ) 是由 杨求华 周宸 陆振 黄瑞芳 林琪 杨福元 叶坤 李忠琴 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法,过程包括芽孢杆菌CQN-2特异性检测引物筛选；荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作；仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量计算,利用芽孢杆菌CQN-2的gyrA-4基因与仿刺参的单拷贝基因β-actin分别设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量反应体系和PCR技术的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2含量的相对定量检测方法。(The invention provides a relative quantitative detection method of bacillus CQN-2 in an apostichopus japonicus intestinal tract, which comprises the steps of screening bacillus CQN-2 specific detection primers; constructing a fluorescent quantitative PCR system and making a standard curve; calculating the relative bacterial carrying quantity of bacillus CQN-2 in the stichopus japonicus intestinal tract, respectively designing specific primers by utilizing gyrA-4 gene of bacillus CQN-2 and single copy gene beta-actin of the stichopus japonicus, and establishing a relative quantitative detection method for the bacillus CQN-2 content in the stichopus japonicus intestinal tract based on SYBR Green I fluorescent quantitative reaction system and PCR technology.)
技术领域
本发明涉及杆菌检测的技术领域，尤其是涉及一种仿刺参肠道中芽孢杆菌 CQN-2相对定量检测方法。
背景技术
芽孢杆菌CQN-2为解淀粉芽孢杆菌，是健康仿刺参肠道中分离得到的益生菌之一，通过饲料添加芽孢杆菌CQN-2投喂仿刺参后，可显著提高仿刺参的增重率和特定生长率，同时可有效提高仿刺参抵御病原菌感染的抗病力。然而，对于投喂后仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2的定植情况如何，一直未能找到有效的检测方法。
基于上述一系列的问题，遂有以下技术方案的产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，利用芽孢杆菌CQN-2的gyrA-4基因与仿刺参的单拷贝基因β-actin分别设计特异性引物，建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量反应体系和PCR技术的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2含量的相对定量检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1、芽孢杆菌CQN-2特异性检测引物筛选；
S2、荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作；
S3、仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量计算。
进一步的，所述步骤S1具体包括
S11、选取实验所用菌株并提取细菌中的DNA；
S12、将已经测得的芽孢杆菌CQN-2全基因序列设计特异引物与菌株基因序列进行比对分析；
S13、通过PCR扩增筛选出对芽孢杆菌CQN-2具有特异性扩增的引物序列。
进一步的，所述步骤S2具体包括
S21、PCR扩增引物纯化；
S22、将纯化后的PCR扩增引物进行荧光定量PCR体系构建并根据公式1 计算出对应的DNA分子拷贝数，其中公式1为；
其中6.022×1023(molecules/mole)为阿伏伽德罗常数，660daltons为单碱基对的平均分子量；
S23、最后以倍比稀释后的DNA分子拷贝数对数值为横坐标，以荧光定量 PCR的CT值为纵坐标，构建DNA拷贝数与CT值之间的标准曲线，其中标准曲线方程公式为 CT＝K×log DNA拷贝数+C
其中E为引物扩增效率。
进一步的，所述步骤S3具体包括以仿刺参肠道组织中提取的总DNA为模板，以仿刺参β-actin为内参基因，以芽孢杆菌CQN-2的gyrA为目的基因，其中，
gyrA基因的拷贝数：
β-actin基因的拷贝数：
相对带菌量＝NP/NL
根据制作的标准曲线和荧光定量PCR检测结果，计算出每个样品中芽孢杆菌CQN-2gyrA基因和仿刺参β-actin基因的拷贝数，利用同一样品中测定的 CQN-2gyrA基因拷贝数除以对应的仿刺参β-actin基因拷贝数，得到的比值即为相对带菌量，它相当于同样数量的仿刺参肠道组织细胞中检出的芽孢杆菌 CQN-2相对数量。
进一步的，所述荧光体系PCR体系构建包括反应体系和反应程序，
所述反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μl，gyrAF4/R4或β-actin F/R上下游引物(10μM)各0.5μl，DNA模板4.0μl，ddH2O 5.0 μl；
所述反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，61℃退火30s，共45 个循环；95℃变性10s，65℃退火60s，95℃持续1s；37℃冷却30s。
进一步的，所述步骤S13中所述PCR扩增包括反应体系、初始反应程序以及优化反应程序，
所述反应体系为：DNA模板：2μL；PCR mix：25μL；引物F：2μL；引物 R：2μL；ddH2O 19μL，共50μL；
所述初始反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃复性30s， 72℃延伸90s，35个循环，最后72℃温育7min，4℃保存；
所述优化反应程序为：筛选出适宜的引物对后，在其他程序相同的情况下，分别将复性退火温度设置为51℃、53℃、57℃、59℃、61℃和63℃进行PCR 扩增。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
1、本发明利用芽孢杆菌CQN-2的gyrA-4基因与仿刺参的单拷贝基因β-actin分别设计特异性引物，建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量反应体系和PCR 技术的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2含量的相对定量检测方法；
2、通过运用本发明提及的测量方法可以有效了解仿刺参肠道中芽孢杆菌 CQN-2的定植情况。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明优选实施例所涉及菌株的基本信息；
图2是本发明优选实施例所涉及的引物基因信息及序列；
图3是本发明优选实施例实验验证中不同引物扩增12株不同种属细菌PCR 检测结果；
图4是本发明优选实施例实验验证中以gyrA F4/R4为扩增引物在不同退火温度下PCR扩增检测结果；
图5是本发明优选实施例实验验证中胶回收纯化后DNA不同倍比稀释后定量PCR检测对应基因的拷贝数；
图6是本发明优选实施例引物gyrA F4/R4和β-actin F/R实时荧光定量扩增效果检测；
图7是引物gyrA F4/R4扩增的标准曲线；
图8是β-actin F/R扩增的标准曲线；
图9是本发明优选实施例实验验证中不同实验组仿刺参肠道中CQN-2相对带菌量；
图10是本发明检测方法的流程图，
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明提供了一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法。下面将结合图1～图10对本发明提供的技术方案进行更为详细的阐述。
如图1～图10所示，为了解决投喂后仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2的定植情况的研究，本发明提出仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，本方法的检测原理是利用芽孢杆菌CQN-2的gyrA-4基因与仿刺参的单拷贝基因β-actin分别设计特异性引物，建立基于SYBR Green Ⅰ荧光定量反应体系和PCR 技术的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2含量的相对定量检测方法。
本发明的流程包括：
S1、芽孢杆菌CQN-2特异性检测引物筛选；
S2、荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作；
S3、仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量计算。
本发明的检测过程优选采用实验对比以及实验验证的方法，具体包括如下内容：
1、芽孢杆菌CQN-2特异性检测引物筛选
1)实验所用菌株
本方法所用的菌株基本信息如图1所示，共计12株，包括9株芽孢杆菌和 3株弧菌，其中5株芽孢杆菌分离自健康仿刺参肠道，4株芽孢杆菌分离自正常海水，2株弧菌分离自患病仿刺参病灶组织，1株弧菌分离自患病海马病灶组织。
2)DNA的提取
按照上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 说明书进行，具体步骤如下：
①将适量的指数生长期细菌(最多5×108)，8,000rpm，离心1分钟，彻底弃净培养基。
②加入200μl TE悬浮细菌，加入1μl 400μg/ml的Lysozyme溶解3-5分钟，用吸头混匀。而后加入4μl RNase A混匀，再加入4μl Proteinase K，加入 200μl Lysis Solution70℃保温10分钟。
③冷却到室温，加入200μl无水乙醇，混匀。如有沉淀出现，用1ml枪头充分打匀，不影响提取。
④将全部液体移入GenClean柱，8,000rpm室温离心1分钟，去下GenClean 柱，弃去收集管中的废液。
⑤将GenClean柱放回收集管中，加入500μl AW1 Solution，8,000rpm室温离心1分钟。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。
⑥将GenClean柱放回收集管中，加入500μl AW2 Solution，8,000rpm室温离心1分钟。取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。并重复一次。
⑦将GenClean柱放回收集管中，12,000rpm室温离心1分钟，以去除残留的AW2Solution。
⑧将GenClean柱放入新的洁净的1.5ml离心管中，在GenClean柱中央加入50-100μl AE Beffer，室温或37℃放置2分钟。12,000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为基因组DNA。4℃或者-20℃保存。
3)引物设计与验证
根据已经测得的芽孢杆菌CQN-2全基因序列设计特异引物，与其他菌株(表 1)基因序列进行比对分析，选择16S、23S、gyrA、gyrB四个基因的序列片段共设计21对引物进行PCR反应，以筛选验证引物的特异性。选择仿刺参基因组中单拷贝基因β-actin作为内参基因，将方法所需的引物共22对由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行合成，引物序列如图2所示。
合成的引物首先分别用芽孢杆菌CQN-2为模板，通过PCR扩增检验引物的扩增效果及特异性，并将获得的PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序验证。
4)PCR扩增体系及扩增条件设计
反应体系：DNA模板：2μL；PCR mix：25μL；引物F：2μL；引物R：2μL； ddH2O 19μL，共50μL。
初始反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃温育7min，4℃保存。
优化反应程序：筛选出适宜的引物对后，在其他程序相同的情况下，分别将复性退火温度设置为51℃、53℃、57℃、59℃、61℃和63℃进行PCR扩增。
以本方法选取的12株不同种属细菌菌株(表1)的DNA为模板，通过PCR 扩增，并用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出对芽孢杆菌CQN-2具有特异性扩增的引物序列。
2、荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作
1)PCR扩增产物纯化
以芽孢杆菌CQN-2DNA和仿刺参体璧组织DNA为模板，分别用最筛选得到的最优特异性引物进行PCR扩增，按照上海捷瑞生物工程有限公司的薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行扩增产物的回收和纯化。具体步骤如下：
①DNA吸附柱平衡处理：向吸附柱中加入200μl buffer CBS，12,000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中。
②从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的凝胶，估计重量或精准称量重量。
③每100mg琼脂糖凝胶加入100μl Binding Solution，于50-60℃水浴3-5 min，期间每2-3min间断轻微颠倒混匀，直至胶块完全融化。
④将上述混合液转移至套有2mL收集管的吸附柱GC-2u中，室温放置2 min，6,000rpm室温离心1min，取出吸附柱GC-2u，并倒掉收集管中废液。
⑤将吸附柱GC-2u重新放回收集管中，加入500μl WA Solution，于12,000 rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
⑥将吸附柱GC-2u重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，于12,000 rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
⑦重复步骤⑥一次。
⑧将吸附柱GC-2u重新放回收集管中，12,000rpm，室温离心1min，之后，打开吸附柱GC-2u的盖子，室温放置5-10min或50℃放置3-5min，以彻底去除Wash Solution。
⑨将吸附柱GC-2u放入干净的1.5mL收集管中(试剂盒中自带)，对膜中央悬空加入15-20μl Elution Buffer，盖好盖子，37℃放置2min，12,000rpm 离心1min，离心管中的液体即为包含目的DNA片段的溶液。
2)荧光定量PCR体系构建
将芽孢杆菌CQN-2gyrA基因和仿刺参β-actin基因PCR扩增产物用胶回试剂盒纯化后，用TECAN的M200 Pro酶标仪测定浓度测定，然后按103、104、 105、106、107、108、109进行10倍倍比梯度稀释，并根据公式1计算出其对应的DNA分子拷贝数。
其中6.022×1023(molecules/mole)为阿伏伽德罗常数，660daltons为单碱基对的平均分子量。
以梯度倍比稀释后的DNA为模板，使用Roche公司的
实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件如下：
反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μl，gyrA F4/R4 或β-actin F/R上下游引物(10μM)各0.5μl，DNA模板4.0μl，ddH2O 5.0μl。
反应程序：94℃预变性3min；94℃变性10s，61℃退火30s，共45个循环； 95℃变性10s，65℃退火60s，95℃持续1s；37℃冷却30s。
3)标准曲线制作
以倍比稀释后的DNA分子拷贝数对数值(Log)为横坐标，以荧光定量PCR 的CT值为纵坐标，构建DNA拷贝数与CT值之间的标准曲线。
标准曲线方程公式如公式2所示：
CT＝K×log DNA拷贝数+C (公式2)
其中
3、仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量计算
以仿刺参肠道组织中提取的总DNA(浓度20ng/μL)为模板，以仿刺参β-actin为内参基因，以芽孢杆菌CQN-2的gyrA为目的基因，进行荧光定量PCR 检测，每个样品做3个重复，取平均值计算相对带菌量。
由公式1可知：
gyrA基因的拷贝数：
β-actin基因的拷贝数：
相对带菌量＝NP/NL (公式5)
根据制作的标准曲线和荧光定量PCR检测结果，计算出每个样品中芽孢杆菌CQN-2gyrA基因和仿刺参β-actin基因的拷贝数，利用同一样品中测定的 CQN-2gyrA基因拷贝数除以对应的仿刺参β-actin基因拷贝数，得到的比值即为相对带菌量，它相当于同样数量的仿刺参肠道组织细胞中检出的芽孢杆菌 CQN-2相对数量。
本发明对实验的结果进行如下实验验证：
1、芽孢杆菌CQN-2特异性引物筛选
以53℃为退火温度，以12株不同种属细菌DNA为模板，采用PCR扩增，并用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，结果表明，引物gyrA F4/R4、引物gyrB F3/R3、引物gyrB F5/R5针对芽孢杆菌CQN-2有较好的引物特异性(图1)。
以引物gyrA F4/R4、引物gyrB F3/R3、引物gyrB F5/R5三对引物作为候选引物，设计退火温度为51℃、53℃、57℃和59℃进行PCR扩增，结果表明，在该退火温度下PCR扩增结果不是特别理想，均未能针对芽孢杆菌CQN-2扩增出针对性的单一条带。然而以gyrA F4/R4在三对引物中效果最好，故以该引物做进一步的退火温度优化。设计61℃和63℃为退火温度，以引物gyrA F4/R4进行 PCR扩增，结果表明，以gyrA F4/R4为扩增引物、61℃或63℃为退火温度进行 PCR扩增，均可得到针对芽孢杆菌CQN-2的特异性单一条带，如图3-4所示。
每个引物组中不同列分别对应的表1中1-12编号的菌，其中第1列为芽孢杆菌CQN-2。
2、荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作
胶回收电泳条带结果显示，芽孢杆菌CQN-2gyrA基因扩增条带大小为260 bp左右，仿刺参β-actin基因扩增条带大小为270bp左右，符合预期大小，表明 PCR扩增产物胶回收纯化合格。
酶标仪测定结果显示，芽孢杆菌CQN-2gyrA基因胶回收DNA浓度大小为 52.8ng/μL，仿刺参β-actin基因胶回收DNA浓度大小为15.2ng/μL，其对应DNA 拷贝数分别为1.82×1011copies/μL和5.23×1010copies/μL。
将上述回收获得的DNA原液分别按103、104、105、106、107、108、109进行10倍倍比梯度稀释，以此为模板进行荧光定量PCR检测。根据公式1计算出不同倍比稀释后芽孢杆菌CQN-2gyrA基因和仿刺参β-actin基因的对应拷贝数如图5所示。
如图6-8所示，以DNA拷贝数的对数值作为横坐标，以荧光定量PCR结果的CT值为纵坐标构建标准曲线，图3包括分别为引物gyrA F4/R4和β-actin F/R 扩增的标准曲线；引物gyrA F4/R4和β-actin F/R的扩增曲线。根据公式1和公式2得到引物gyrA F4/R4和β-actinF/R的标准曲线方程分别为 y＝-2.4398x+26.902(R2＝0.9962)和y＝-2.9916x+30.822(R2＝0.9977)。
3、仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量
本实例所用实验组样品为有经过8周投喂芽孢杆菌CQN-2的仿刺参肠道组织；对照组为不添加CQN-2的正常饲料投喂的仿刺参肠道组织。提取组织总 DNA(浓度20ng/μL)为模板，以仿刺参β-actin为内参基因，以芽孢杆菌CQN-2 的gyrA为目的基因，进行荧光定量PCR检测，每个样品做3个重复，取平均值计算相对带菌量。
相对带菌量的计算结果如图9所示。其中纵坐标为-Log相对带菌量，比值越低表示相对带菌量越高。从图中可以看出，经过连续8周拌饲投喂芽孢杆菌 CQN-2后，仿刺参肠道中的CQN-2相对带菌量显著高于对照组，表明芽孢杆菌 CQN-2可较好的定植在仿刺参肠道中。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应当涵盖在本发明的保护范围之内。
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