阅读说明：本技术 化合物an-329对抑制汉坦病毒释放扩散的应用 (Application of compound AN-329 in inhibiting hantavirus release diffusion ) 是由 吴兴安 应旗康 王芳 张晓晓 刘梓谕 董宇航 刘蓉蓉 于 2020-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了化合物AN-329对抑制汉坦病毒释放扩散的应用,化合物AN-329能抑制汉坦病毒Gn蛋白与宿主ESCRT的相互作用；为研究汉坦病毒生活周期及病毒与宿主相互作用机制奠定了一定的基础,并为研制抗汉坦病毒药物提供思路。通过实验证明：加入AN-329后细胞,经由上清二次感染的细胞内HTNV抗原量明显减少；经由上清二次感染的细胞内HTNV的核酸水平明显较低,小分子化合物AN-329有效抑制了汉坦病毒的释放和扩散。(The invention discloses application of a compound AN-329 to inhibition of hantavirus release and diffusion, wherein the compound AN-329 can inhibit the interaction of hantavirus Gn protein and a host ESCRT; lays a certain foundation for researching the life cycle of the hantavirus and the interaction mechanism of the hantavirus and the host, and provides a thought for developing anti-hantavirus medicaments. Experiments prove that: after AN-329 is added, the amount of HTNV antigen in the cells secondarily infected by the supernatant is obviously reduced; the nucleic acid level of HTNV in cells secondarily infected by the supernatant is obviously lower, and the small molecule compound AN-329 effectively inhibits the release and diffusion of hantavirus.)

化合物AN-329对抑制汉坦病毒释放扩散的应用

技术领域

本发明属于微生物免疫技术领域，具体涉及化合物AN-329对抑制汉坦病毒释放扩散的应用。

背景技术

HTNV隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、汉坦病毒属(Hantavirus)，。1976年，韩国学者李镐汪于该国疫区汉滩河流域黑线姬鼠的肺组织中首次成功分离该病毒。将汉滩病毒HTNV作为汉坦病毒的典型进行研究，目前对HTNV的入胞及胞内复制过程有了一定的认识和研究，HTNV生活周期分为吸附、穿入、释放基因组、复制及翻译、出芽释放五个阶段。在病毒感染早期，其出芽释放非常旺盛，是其扩大感染范围的关键，但对该病毒如何释放子代病毒，还未有定论。

汉坦病毒引起的肾综合征出血热发病急，症状严重，死亡率高，且缺乏特异有效的治疗药物。目前国内外的研究认为，汉坦病毒可能是以两种方式出胞，一是经内质网—高尔基体的分泌途径，病毒mRNA在内质网上翻译其包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)的前体GPC，经剪切后形成Gn蛋白和Gc蛋白两个部分(保留GPC的N端的为Gn，保留C端的为Gc)后经高尔基体分泌释放到胞外；另一是病毒的Gn蛋白和Gc蛋白表达后定位于细胞膜表面，劫持宿主ESCRT直接从细胞质膜出芽。但不论是哪种方式，都需要有宿主ESCRT的辅助。近年来，国内外研究表明将HTNV Gn胞质尾区突变后，可干扰病毒的释放，且申请人前期研究发现宿主ESCRT中的部分关键分子与Gn相互作用是完成病毒释放的关键。

发明内容

本发明的目的是提供化合物AN-329对抑制汉坦病毒释放扩散的应用，能够有效抑制汉坦病毒的释放和扩散。

本发明所采用的第一个技术方案是，化合物AN-329对抑制汉坦病毒释放扩散的应用。

本发明特征还在于，

化合物AN-329的结构为AN-329/43450194：

具体涉及化合物AN-329对抑制汉滩病毒释放扩散的应用。

化合物AN-329能抑制汉坦病毒Gn蛋白与宿主ESCRT的相互作用。

本发明所采用的第二个技术方案是，化合物AN-329抑制汉坦病毒释放扩散在制备抗汉坦病毒药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明证实了汉坦病毒的释放是由于汉坦病毒Gn胞质尾区与宿主ESCRT的相互作用，小分子化合物AN-329能够对汉坦病毒Gn胞质尾区与宿主ESCRT的相互作用产生干扰，抑制汉坦病毒的释放和扩散；为研究汉坦病毒生活周期及病毒与宿主相互作用机制奠定了一定的基础，并为研制抗汉坦病毒药物提供思路。

附图说明

图1为加入AN-329的HTNV感染细胞HTNV抗原Western blot检测结果；

图2为加入AN-329的HTNV感染细胞HTNV抗原免疫荧光检测结果；

图3为加入AN-329的HTNV感染细胞病毒核酸水平检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、影响HTNV相关Gn胞质尾区关键表位序列的筛选

(一)预测

首先运用生物信息学技术设计能够阻碍Gn与ESCRT相互作用的小分子，并从小分子化合物库中挑选其结构能够进入ESCRT活性中心的小分子化合物，共45个。

(二)筛选

将A549细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按MOI＝1感染HTNV，感染后6h按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37℃条件下CO₂细胞培养箱中培养24h，同日再将A549细胞消化后传代至一新96孔板。感染24h后将6孔板中细胞上清吸出，分别10倍梯度稀释加入96孔板。96孔板继续培养4d后收集细胞免疫荧光检测HTNV核衣壳抗原以确定病毒量。经筛选得到抑制HTNV释放效果最佳的1个：AN-329。

二、AN-329细胞水平抑制HTNV释放的鉴定

(一)Wstern blot检测

将A549细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按MOI＝1感染HTNV，感染后6h按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37℃条件下CO₂细胞培养箱中培养24h，同日再将A549细胞消化后传代至一新6孔板，继续培养4d后收集细胞。将获得的细胞样品加入上样缓冲液Western blot sample buffer，煮沸5min，待冷却后以12％SDS-PAGE,160V电泳50min，随后以100V恒压电转至PVDF膜上。PVDF膜以5％牛血清白蛋白封闭液BSA室温封闭1h后加入HTNV特异性单克隆抗体，4℃孵育过夜。TBST缓冲液将多余抗体洗去，再加入红外标记的抗小鼠二抗，室温孵育2h，TBST洗去未结合的二抗，使用奥德赛红外成像仪扫描并分析结果。结果如图1所示的阳性对照结果，加入AN-329后细胞，经由上清二次感染的细胞内HTNV抗原量明显减少。

(二)免疫荧光检测

将A549细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按MOI＝1感染HTNV，感染后6h按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37℃条件下CO₂细胞培养箱中培养24h，同日再将A549细胞消化后传代至一新6孔板，继续培养4d后收集细胞。将细胞用0.4％多聚甲醛固定后，以Triton X-100穿透。处理后的细胞加入Gn特异性的单克隆抗体，37℃孵育1h。PBST洗涤掉多余的抗体，加入Cy3标记的抗小鼠荧光二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤掉未结合的二抗。以DAPI溶液染色细胞核后，荧光显微镜下观察红色荧光的分布和强度。结果如图2所示，加入AN-329后，细胞内的荧光面积明显有所降低。

(三)qRT-PCR检测

将A549细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按MOI＝1感染HTNV，感染后6h按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37℃条件下CO2细胞培养箱中培养24h，同日再将A549细胞消化后传代至一新6孔板，继续培养3d后收集细胞，提取总RNA，并取2000ng总RNA反转录为cDNA。以SYBR green为荧光染料，HTNV S片段为目标，β-actin为内参进行qRT-PCR。结果如图3所示，图3中，经由上清二次感染的细胞内HTNV的核酸水平明显较低。

通过上述内容可知，本发明证实了汉坦病毒的释放是由于汉坦病毒Gn胞质尾区与宿主ESCRT的相互作用，筛选出了能够抑制汉坦病毒释放扩散的小分子化合物AN-329，抑制汉坦病毒的释放和扩散；有助于研究病毒生活周期，并为研制抗汉坦病毒药物提供思路。