一种相关酶代谢活性检测试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 一种相关酶代谢活性检测试剂盒及其应用 (Kit for detecting metabolic activity of related enzyme and application thereof ) 是由 乔海灵 方艳 于 2019-04-12 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种相关酶代谢活性检测试剂盒,包括所述相关酶对应的特异性探针,所述试剂盒用于检测相关酶代谢活性、检测至少两种相关酶代谢活性的比值中的至少一种。该试剂盒为肝癌高危人群的筛查及预测肝癌患者的预后提供了新的更准确、更灵敏的标准,对肝癌高危人群的筛查及肝癌防治具有重大的意义。本申请还提供了基于上述试剂盒的相关酶代谢活性及活性比值检测方法及该方法在筛查肝癌易感性和/或高危人群、肝癌患者预后评估中的应用,该应用准确性高、灵敏度优异,且易于操作,便于推广应用。(The application discloses a kit for detecting metabolic activity of related enzymes, which comprises specific probes corresponding to the related enzymes, and is used for detecting the metabolic activity of the related enzymes and at least one of the ratios of at least two related enzymes. The kit provides a new more accurate and sensitive standard for screening of high risk group of liver cancer and prediction of prognosis of liver cancer patient, and has great significance for screening of high risk group of liver cancer and prevention and treatment of liver cancer. The application also provides a detection method of the metabolic activity and the activity ratio of related enzymes based on the kit and application of the method in screening prognosis evaluation of liver cancer susceptibility and/or high risk groups and liver cancer patients, and the application has the advantages of high accuracy, excellent sensitivity, easy operation and convenient popularization and application.)
技术领域
本申请涉及一种相关酶代谢活性检测试剂盒、基于其提供的相关酶代谢活性检测方法，及其在筛查肝癌易感性和/或高危人群、肝癌患者预后评估中的应用，属于检测、医疗健康领域。
背景技术
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是严重危害人类生命安全的疾病，它具有恶性度高、进展快、侵袭性强、预后差和死亡率高等特点。新近数据显示，世界范围内肝癌在恶性肿瘤导致的死亡中位居第三。我国每年新增肝癌患者13.5万人，死亡约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。
目前治疗肝癌的方法主要包括手术切除、化疗、放疗等。由于临床上发现肝癌时大多在中晚期，上述治疗方法虽已取得很大进展，但因肝癌患者就诊时已错过最佳治疗时机，目前的治疗手段预后较差。因此，早期筛查、早期诊断及治疗是降低肝癌发病率、提高肝癌患者存活率的关键。另外，多数肝癌患者均经历了从慢性肝炎到肝硬化，最终发展为肝癌的病理演变过程。因此，在高危人群中筛查、发现早期肝癌，对于降低社会成本和医疗成本均具有重要意义。
目前，临床上常见的与肝癌早期诊断及预后相关的指标主要包括：甲胎蛋白(AFP)、谷草转氨酶(AST)、凝血酶原时间(PT)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)等。但以上指标在肝炎、肝硬化、肝癌患者中均可能有所改变，无法将慢性肝病和肝癌进行特异性地区分。如临床上广泛应用的AFP，其特异性约80％。但大量临床研究发现，3％～40％的肝癌患者直到发展为肝癌晚期，其血清中AFP水平并未显著升高；而部分肝硬化患者也会出现血清AFP水平高达1000U以上，但多次定期检查并未罹患肝癌。因此，目前诊断肝癌的方法缺乏较高的敏感度和特异性，已成为肝癌早期筛查、诊断及治疗的瓶颈。
发明人在长期研究中发现，要想早期筛查肝癌高危人群、做到预防性诊治肝癌，需要突破常规的比较癌组织与癌旁组织的一贯性研究思路，转而筛查正常人肝组织及肝癌患者肝纤维化组织间的差异，用以寻找和开发癌症发生土壤(环境)中的特异性蛋白及其功能。
目前尚未有通过测定人体内相关酶活性以筛查肝癌高危人群的应用；而肝癌早期筛查、早期诊断及治疗是降低肝癌发病率、提高肝癌患者存活率的关键，发明人拟通过测定人肝细胞色素P450酶CYP2E1和CYP2C8以筛查肝癌易感性和/或高危人群、肝癌患者预后评估中的应用，以期达到肝癌的早发现、早诊断和早治疗。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了一种相关酶代谢活性检测试剂盒，该试剂盒在相关酶代谢活性检测方面具有较高的灵敏度和特异性，易于操作，便于推广应用。
所述相关酶代谢活性检测试剂盒，其特征在于，包括所述相关酶对应的特异性探针；
所述试剂盒用于检测相关酶代谢活性、检测至少两种相关酶代谢活性的比值中的至少一种。
可选地，所述试剂盒中包含用于检测相关酶代谢活性、检测至少两种相关酶代谢活性的比值中的至少一种的试剂。
可选地，所述试剂盒中包含用于检测CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的试剂。
可选地，所述相关酶为人肝脏细胞色素P450酶。
可选地，所述相关酶包括CYP2E1、CYP2C8中的至少一种；
所述CYP2E1为细胞色素P450酶2E1，所述CYP2C8为细胞色素P450酶2C8。
可选地，所述CYP2E1包括肝微粒体CYP2E1、人体CYP2E1中的至少一种。
可选地，所述CYP2C8包括肝微粒体CYP2C8、人体CYP2C8中的至少一种。
可选地，所述至少两种相关酶代谢活性的比值包括：肝微粒体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值、人体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值中的至少一种。
可选地，所述特异性探针包括CYP2E1参与代谢/转化的物质、CYP2C8参与代谢/转化的物质中的至少一种。
可选地，所述特异性探针包括氯唑沙宗、4-硝基酚、苯胺、二乙基亚硝胺、紫杉醇、瑞格列奈、阿莫地喹、孟鲁司特、罗格列酮、吡格列酮中的至少一种。
CYP2E1可以代谢或转化许多药物、化学试剂及内源性物质，如：氯唑沙宗、对乙酰氨基酚、氟西汀、茶碱、磺胺嘧啶、乙醇、4-硝基酚、1，3-丁二烯、苯、甲苯、氯仿、氯乙烯、二甲基亚硝胺、二乙基亚硝胺、丙酮、花生四烯酸。
CYP2C8可参与许多药物及内源性物质的代谢转化，如：紫杉醇、阿莫地喹、瑞格列奈、孟鲁司特、吡格列酮、罗格列酮、西立伐他汀、布洛芬、环氧二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸。
作为一种具体的实施方式，所述CYP2E1的特异性探针包括氯唑沙宗、二乙基亚硝胺、4-硝基酚、苯胺中的至少一种，所述CYP2C8的特异性探针包括紫杉醇、瑞格列奈、阿莫地喹、孟鲁司特、罗格列酮、吡格列酮中的至少一种。
作为一种具体的实施方式，所述CYP2E1的特异性探针为氯唑沙宗，
所述CYP2C8的特异性探针为瑞格列奈。
可选地，所述试剂盒包括：
孵育体系；
其中，所述孵育体系包括所述相关酶对应的特异性探针；或
所述试剂盒包括125～1200mg氯唑沙宗、0.1～16mg瑞格列奈、2～10mg孟鲁司特钠、2～8mg罗格列酮、7.5～45mg吡格列酮中的至少一种。
可选地，所述试剂盒包括氯唑沙宗片600mg和瑞格列奈4mg。
可选地，所述孵育体系包括相关酶对应的特异性探针和缓冲液；
所述缓冲液选自50～100mM磷酸盐缓冲液、50～100mM Tris-HCL缓冲液中的一种；
所述缓冲液的pH值为4.4～10.4。
可选地，所述缓冲液的浓度为50～100mM。
可选地，所述缓冲液的浓度为100mM。
可选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液中的一种。
可选地，所述缓冲液的pH值为7.4。
可选地，所述孵育体系包括100mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液以及2.5～80μM的紫杉醇、0.78～100μM的二乙基亚硝胺、7.8～1000μM的氯唑沙宗、0.022～20μM的瑞格列奈、5～2000μM的4-硝基酚、5～6000μM的苯胺、0.1～200μM的阿莫地喹、0.025～50μM的孟鲁司特、0.25～1000μM的罗格列酮、2.06～5272μM的吡格列酮中的至少一种。
可选地，所述孵育体系还包括还原型辅酶中的至少一种。
可选地，所述孵育体系包括浓度为1mM NADPH或NADPH再生系统中的一种；
其中NADPH再生系统包含1.3mM NADP+,3.3mM 6-磷酸葡萄糖，0.4U/ml葡萄糖脱氢酶，3.3mM氯化镁
可选地，所述试剂盒还包括：
终止体系。
所述终止体系包括乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、甲醇、高氯酸中的至少一种。
可选地，所述终止体系包括1mL乙酸乙酯、1mL二氯甲烷，100μL乙腈，100μL甲醇，10μL高氯酸中的至少一种。
可选地，所述终止体系包括1mL乙酸乙酯、1mL二氯甲烷中、100μL乙腈中的至少一种。
可选地，所述试剂盒包括：
(a)2.5～80μM的紫杉醇、0.78～100μM的二乙基亚硝胺、7.8～1000μM的氯唑沙宗、0.022～20μM的瑞格列奈、5～2000μM的4-硝基酚、5～6000μM的苯胺、0.1～200μM的阿莫地喹、0.025～50μM的孟鲁司特、0.25～1000μM的罗格列酮、2.06～5272μM的吡格列酮中的至少一种；
(b)50mM磷酸盐缓冲液、100mM的磷酸盐缓冲液、50mM Tris-HCL缓冲液、100mMTris-HCL缓冲液中的至少一种；
(c)1mM NADPH或NADPH再生系统中的至少一种；
(d)1mL乙酸乙酯、1mL二氯甲烷或100μL乙腈中的至少一种。
可选地，所述试剂盒用于检测相关酶代谢活性、检测至少两种相关酶代谢活性的比值中的至少一种。
根据本申请的另一个方面，提供了一种相关酶代谢活性检测方法，该方法具有较高的灵敏度和特异性，易于操作，便于推广应用。该方法为肝癌高危人群的筛查及预测肝癌患者的预后提供了新的更准确、更灵敏的标准，对肝癌高危人群的筛查及肝癌防治具有重大的意义。
所述相关酶代谢活性检测方法，包括：测定相关酶对所述相关酶对应的特异性探针的代谢活性；
所述方法采用上述任一试剂盒中的至少一种。
可选地，所述代谢活性包括米氏常数、最大转化速率、清除率、药峰浓度、达峰时间、末端消除速率、半衰期、药时曲线下面积、清除率、表观分布容积、平均驻留时间的至少一种。
作为一种具体的实施方式，肝微粒体CYP2E1和CYP2C8的代谢活性包括米氏常数(Km)、最大转化速率(Vmax)、清除率(CLint)。
作为一种具体的实施方式，人体CYP2E1和CYP2C8的代谢活性，包括药峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、末端消除速率(Ke)、半衰期(T1/2)、药时曲线下面积(AUC)、清除率(CL)、表观分布容积(Vd)、平均驻留时间(MRT)。
可选地，所述方法包括：
将含有相关酶的体系、所述相关酶对应的特异性探针中的至少一种以及缓冲液混合，预孵育，然后加入还原型辅酶，孵育，反应结束后，终止反应，分析获得的有机相，得到所述相关酶的代谢活性；
所述相关酶包括CYP2E1、CYP2C8中的至少一种。
可选地，所述含有相关酶的体系包括肝微粒体或人体。
可选地，所述分析的方法包括：通过色谱法测定代谢产物的生成量，通过非线性回归分析方法计算相关酶的代谢活性。
可选地，根据所述方法分别获得至少两种相关酶的代谢活性，通过计算得到不同相关酶的代谢活性比值。
可选地，通过所述方法获得CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值。
作为一种具体的实施方式，所述人肝细胞色素P450酶代谢活性的检测方法，通过测定所述人肝细胞色素P450酶对其特异性探针的代谢活性，并进行比值确定。
作为一种具体的实施方式，所述人肝细胞色素P450酶比值为CYP2E1与CYP2C8的代谢活性比值。
根据本申请中的另一方面，提供了检测相关酶代谢活性和/或检测至少两种相关酶代谢活性的比值的试剂在制备筛查肝癌易感性和/或高危人群、肝癌患者预后评估用试剂中的应用。
可选地，所述试剂用于检测CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值。
可选地，所述试剂用于检测肝微粒体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值、人体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值中的至少一种。
根据本申请的又一个方面，提供了上述任一试剂盒和/或上述任一检测方法在筛查肝癌易感性和/或高危人群、肝癌患者预后评估中的应用。
作为本申请的一种实施方式，通过测定CYP2E1的代谢活性用于筛查肝癌易感和高危人群及预测肝癌患者预后。
作为本申请的一种实施方式，通过测定CYP2C8的代谢活性值用于筛查肝癌易感和高危人群及预测肝癌患者预后。
作为本申请的一种实施方式，通过测定人肝细胞色素P450酶CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值用于筛查肝癌易感和高危人群及预测肝癌患者预后。
作为本申请的一种实施方式，人肝细胞色素P450酶CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值用于筛查肝癌易感和高危人群及预测肝癌患者预后。具体发现如下：
①肝癌患者肝微粒体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值显著升高；
②CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的受试者工作特征曲线(ROC)显示，CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值可非常准确的筛查肝癌高危人群，并且具有较高的灵敏度和特异性；
③CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值与肝癌患者生存期密切相关，比值高者的生存期较比值低者的生存期显著缩短，比值高者的死亡风险是比值低者的2.49倍。
作为本申请的一种实施方式，本发明的发明人发现CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值在肝癌患者肝纤维化组织中显著升高约4.8倍，
作为本申请的一种实施方式，研究了CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值与肝癌易感性及肝癌预后的关系。发现CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值与肝癌的易感性密切相关、CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的高低与肝癌患者生存期显著相关，从而为肝癌高危人群的筛查及预测肝癌患者的预后提供了新的更准确、更灵敏的标准，对肝癌高危人群的筛查及肝癌防治具有重大的意义。此外，本发明涉及的CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的检测方法易于操作，便于在医院中推广应用。
本申请中，“CYP2E1”和“CYP2C8”为人肝细胞色素P450相关酶。
本申请中，CYP2E1(细胞色素P450酶2E1)是一种主要存在于肝脏内质网的蛋白质，约占肝脏中CYP450总量的24.8％。CYP2E1主要功能是代谢作用，参与药物、前致癌物和环境毒物的生物转化，如可代谢活化85种以上外源性物质生成肝脏毒性或致癌性物质，包括致癌物亚硝胺、苯、1，3-丁二烯等，CYP2E1与亚硝胺、甲苯、氯仿、丙酮及烟草特异性致癌物NNK等的生物转化和诱发的肿瘤有关。因此，CYP2E1的代谢活化作用参与了肝癌等疾病的发生和发展。
本申请中，CYP2E1除通过代谢活化作用参与肝癌等疾病的发生和发展外，CYP2E1的致炎作用也参与了肝癌的发生和发展。CYP2E1可增强Kupffer细胞内TNF-α的释放，导致肝细胞发生炎性坏死性改变。CYP2E1敲除鼠可抵抗慢性酒精暴露诱发的炎症反应。在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的动物模型上，抑制CYP2E1活性，可通过降低TNF-α表达、恢复内皮型一氧化氮合酶活性等防治之。CYP2E1敲除鼠或CYP2E1抑制剂烯丙基硫醚可抑制IL-1β和IL-12释放，进而防治NASH。
本申请中，CYP2C8(细胞色素P450酶2C8)是一种主要存在于肝脏内质网的蛋白质，约占肝脏中CYP450总量的6.8％。CYP2C8主要功能是代谢作用，除参与药物及其他外源性物质的代谢外，还参与许多长链不饱和脂肪酸的代谢，如可将花生四烯酸(AA)代谢生成不同的二十碳三烯酸(EETs)、可将二十二碳六烯酸(DHA)代谢生成不同的环氧二十二碳五烯酸(EDPs)、可将二十碳五烯酸(EPA)代谢生成不同的环氧二十碳四烯酸(EEQs)。EETs、EDPs、EEQs除具有调节血管张力的功能外，还具有较强的缓解炎症及清除活性氧的功能。因此，CYP2C8的代谢活化作用参与了肝癌等疾病的发生和发展。
本申请能产生的有益效果包括但不限于：
1)本申请所提供的相关酶代谢活性检测试剂盒，在相关酶代谢活性检测方面具有较高的灵敏度和特异性，易于操作，便于推广应用。
2)本申请所提供的关酶代谢活性检测方法，为肝癌高危人群的筛查及预测肝癌患者的预后提供了新的更准确、更灵敏的标准，对肝癌高危人群的筛查及肝癌防治具有重大的意义。
3)采用本申请所提供的检测方法测定相关酶代谢活性及其比值，特别是人肝细胞色素P450相关酶代谢活性及其比值，对肝癌高危人群的筛查及肝癌患者的预后评估具有重要的指导意义，尤其是CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值与肝癌患者生存期密切相关，比值高者的生存期较比值低者的生存期显著缩短，比值高者的死亡风险是比值低者的2.49倍。
附图说明
图1为本申请实施例3中肝癌患者肝纤维化肝(HCC group,n＝101)和正常人肝(Control group,n＝95)CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的比较。
图2为本申请实施例3中CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值及其他临床常见的与肝癌早期诊断及预后相关的指标的ROC曲线；
图中，V2E1/V2C8：CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；AFP：甲胎蛋白；PT：凝血酶原时间。
图3为本申请实施例4中具有不同CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的肝癌患者的生存曲线(n＝87)。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料和试剂均通过商业途径购买。
实施例中，通过GraphPad Prism 5.04(GraphPad Inc.,La Jolla,CA,U.S.A.)中的非线性回归分析方法计算肝微粒体CYP2E1和CYP2C8的代谢活性。
实施例1试剂盒
本实施例中所述试剂盒包括：
(a)2.5～80μM的紫杉醇、0.78～100μM的二乙基亚硝胺、7.8～1000μM的氯唑沙宗、0.022～20μM的瑞格列奈、5～2000μM的4-硝基酚、5～6000μM的苯胺、0.1～200μM的阿莫地喹、0.025～50μM的孟鲁司特、0.25～1000μM的罗格列酮、2.06～5272μM的吡格列酮中的至少一种；
(b)50mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液、100mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液、50mMpH 7.4的Tris-HCL缓冲液、100mM pH 7.4的Tris-HCL缓冲液中的至少一种；
(c)1mM NADPH、NADPH再生系统中的至少一种；
(d)1mL乙酸乙酯、1mL二氯甲烷、100μL乙腈中的至少一种。
具体如表1所示。
表1
试剂盒159#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈2mg。
试剂盒160#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈2mg。
试剂盒161#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈2mg。
试剂盒162#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈4mg。
试剂盒163#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈4mg。
试剂盒163#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈4mg。
试剂盒164#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈0.25mg。
试剂盒165#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈0.25mg。
试剂盒166#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈0.25mg。
试剂盒167#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈1mg。
试剂盒168#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈1mg。
试剂盒169#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈1mg。
试剂盒170#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈0.5mg。
试剂盒171#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈0.5mg。
试剂盒172#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈0.5mg。
试剂盒173#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈8mg。
试剂盒174#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈8mg。
试剂盒175#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈8mg。
试剂盒176#：氯唑沙宗片1200mg，瑞格列奈16mg。
试剂盒177#：氯唑沙宗片300mg，瑞格列奈16mg。
试剂盒178#：氯唑沙宗片600mg，瑞格列奈16mg。
试剂盒179#：氯唑沙宗片300mg，罗格列酮2mg。
试剂盒180#：氯唑沙宗片600mg，罗格列酮2mg。
试剂盒181#：氯唑沙宗片1200mg、罗格列酮2mg。
试剂盒182#：氯唑沙宗片300mg，罗格列酮4mg。
试剂盒183#：氯唑沙宗片600mg，罗格列酮4mg。
试剂盒184#：氯唑沙宗片1200mg，罗格列酮4mg。
试剂盒185#：氯唑沙宗片300mg，罗格列酮8mg。
试剂盒186#：氯唑沙宗片600mg，罗格列酮8mg。
试剂盒187#：氯唑沙宗片1200mg，罗格列酮8mg。
试剂盒188#：氯唑沙宗片300mg，吡格列酮7.5mg。
试剂盒189#：氯唑沙宗片600mg，吡格列酮7.5mg。
试剂盒190#：氯唑沙宗片1200mg，吡格列酮7.5mg。
试剂盒191#：氯唑沙宗片300mg，吡格列酮15mg。
试剂盒192#：氯唑沙宗片600mg，吡格列酮15mg。
试剂盒193#：氯唑沙宗片1200mg，吡格列酮15mg。
试剂盒194#：氯唑沙宗片300mg，吡格列酮30mg。
试剂盒195#：氯唑沙宗片600mg，吡格列酮30mg。
试剂盒196#：氯唑沙宗片1200mg，吡格列酮30mg。
试剂盒197#：氯唑沙宗片300mg，吡格列酮45mg。
试剂盒198#：氯唑沙宗片600mg，吡格列酮45mg。
试剂盒199#：氯唑沙宗片1200mg，吡格列酮45mg。
试剂盒200#：氯唑沙宗片300mg，孟鲁司特2mg。
试剂盒201#：氯唑沙宗片600mg，孟鲁司特2mg。
试剂盒202#：氯唑沙宗片1200mg，孟鲁司特2mg。
试剂盒203#：氯唑沙宗片300mg，孟鲁司特4mg。
试剂盒204#：氯唑沙宗片600mg，孟鲁司特4mg。
试剂盒205#：氯唑沙宗片1200mg，孟鲁司特4mg。
试剂盒206#：氯唑沙宗片300mg，孟鲁司特6mg。
试剂盒207#：氯唑沙宗片600mg，孟鲁司特6mg。
试剂盒208#：氯唑沙宗片1200mg，孟鲁司特6mg。
试剂盒209#：氯唑沙宗片300mg，孟鲁司特8mg。
试剂盒210#：氯唑沙宗片600mg，孟鲁司特8mg。
试剂盒211#：氯唑沙宗片1200mg，孟鲁司特8mg。
试剂盒212#：氯唑沙宗片300mg，孟鲁司特10mg。
试剂盒213#：氯唑沙宗片600mg，孟鲁司特10mg。
试剂盒214#：氯唑沙宗片1200mg，孟鲁司特10mg。
实施例2人肝微粒体制备
采用差速离心法，肝标本取出解冻，称重。按1:4(W/V)比例加入50mMTris-HCl(pH＝7.0)缓冲液(含150mM KCl，2mM EDTA)，用玻璃匀浆器研磨制成肝匀浆。于4℃下9000×g离心20min，取上清液于4℃下100000×g离心60min，所得沉淀重悬于4mL的0.15M Tris-HCl(Ph＝7.6)缓冲液中，于4℃下100000×g再离心60min；取沉淀按1:2(W/V)比例加入0.25M蔗糖重悬液，最终每克肝组织制备2mL微粒体混悬液，分装后先保存于液氮中过夜，次日转移至-80℃长期保存备用。
以上所有操作均在冰浴中进行。用Bradford方法测定微粒体蛋白含量为1.31～15.27mg/mL。
实施例3人CYP2E1和CYP2C8代谢活性及其比值的测定
人肝微粒体CYP2E1和CYP2C8代谢活性及其比值的测定
选用氯唑沙宗、紫杉醇作为底物，分别检测95例正常人肝微粒体及101例肝癌患者肝纤维化肝微粒体的CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值。
测定CYP2E1活性的预孵育体系包含0.5mg/mL的肝微粒体、7.8～1000μM(分别为7.8μM、15.6μM、31.2μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μM)的氯唑沙宗、100mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，混匀后，预孵育(37℃水浴)5min，加入1mM NADPH启动反应，孵育(37℃水浴)20min，加入1mL乙酸乙酯终止反应。
测定CYP2C8活性的预孵育体系包含0.5mg/mL的肝微粒体、2.5～80μM(分别为2.5μM、5.0μM、10μM、20μM、40μM、80μM)的紫杉醇、100mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，混匀后，预孵育(37℃水浴)5min，加入1mM NADPH启动反应，孵育(37℃水浴)45min，加入1mL乙酸乙酯终止反应。
加入1mL乙酸乙酯终止反应后，涡旋混合3min，4500rpm离心10min，吸取下层有机相0.8mL，于40℃氮气吹干，100μL流动相复溶，取10μL进样。高效液相色谱法测定代谢产物的生成量，通过GraphPad Prism 5.04(GraphPad Inc.,La Jolla,CA,U.S.A.)中的非线性回归分析方法计算肝微粒体CYP2E1和CYP2C8的代谢活性。
通过CYP2E1和CYP2C8的代谢活性，确定CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值。
分析肝癌患者肝纤维化肝微粒体CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的改变，如图1所示，结果表明，肝癌患者肝纤维化肝微粒体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值(51.2)显著高于正常人肝微粒体(6.43)，增高约7.96倍。
人体CYP2E1和CYP2C8代谢活性及其比值的测定
采用体外-体内推法推算CYP2E1和CYP2C8整体水平的清除率，获得人体CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值。
结果发现，肝癌患者体内CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值(17.89)显著高于正常人体(2.27)，增高约7.88倍。
实施例4临床指标、随访及相关分析
分别记录95例正常人及87例肝癌患者的谷草转氨酶水平、甲胎蛋白水平、凝血酶原时间。采用以电话随访为主、登门随访为辅的方式对87例肝癌患者进行随访。自切除术后，每隔6个月随访一次，随访历时42～54个月。
通过同时绘制CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值及其他临床常见的与肝癌早期诊断及预后相关的指标(谷草转氨酶、甲胎蛋白、凝血酶原时间)的ROC曲线，如图2所示，结果发现，CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值、甲胎蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、凝血酶原时间的曲线下面积分别为0.931、0.895、0.895、0.825、0.738。
由此表明，CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值为93.0％，可非常准确的筛查肝癌高危人群，并且灵敏度为84.3％，特异性为94.5％，具有较高的灵敏度和特异性。
进一步地，根据CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值的高低对肝癌患者进行分组，绘制得到肝癌患者的生存曲线，如图3所示，结果发现，CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值高者的中位生存期显著较CYP2E1和CYP2C8代谢活性比值低者的短(291天vs 729天)。由此表明，CYP2E1和CYP2C8代谢活性的比值可用于预测肝癌患者的预后。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。