阅读说明：本技术 解除对tba检测干扰的方法、tc试剂盒及tg试剂盒 (Method for removing interference on TBA detection, TC kit and TG kit ) 是由 龚婷 赵畅 吴年芬 凡速朋 梁艳 舒芹 张雪娇 赵愿安 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及试剂盒技术领域,具体公开了一种解除对TBA检测干扰的方法,将对TBA检测存在干扰的试剂盒中的胆酸钠去掉,将酚类底物替换为苯胺类衍生物；并在对TBA检测存在干扰的试剂盒中加入表面活性剂。该方法能够保证试剂盒的准确性前提下,还能解除其对TBA检测的干扰,并能减少试剂的刺激性,减少对人体的伤害。(The invention relates to the technical field of kits, and particularly discloses a method for relieving interference on TBA detection, wherein sodium cholate in a kit which has interference on TBA detection is removed, and a phenol substrate is replaced by an aniline derivative; and a surfactant is added to the kit that interferes with the detection of TBA. The method can also relieve the interference of the kit on TBA detection on the premise of ensuring the accuracy of the kit, reduce the irritation of the reagent and reduce the harm to human bodies.)

解除对TBA检测干扰的方法、TC试剂盒及TG试剂盒

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种解除对TBA检测干扰的方法、TC试剂盒及TG试剂盒。

背景技术

总胆固醇(COD-CE-PAP法)测定试剂盒(TC试剂盒)和甘油三酯(GPO-PAP法)测定试剂盒(TG试剂盒)为了保证试剂测值的准确性，试剂中加有胆酸钠，但是在生化仪上检测时，试剂中的胆酸钠会因生化仪反应杯或加样针清洗不干净而导致对TBA试剂测值有干扰，可能会导致TBA测值结果的错误。生化仪多种试剂检测时，交叉污染是一个比较复杂和难解决的问题，本发明所提供的总胆固醇(COD-CE-PAP法)(TC试剂盒)和甘油三酯(GPO-PAP法)测定试剂盒(TG试剂盒)可以解除与TBA试剂同时检测时带来的干扰；同时，还可以解决市面上大部分试剂因内含有刺激性气味的酚类底物而让试剂开盖后有明显让人不愉悦的刺激性气味的问题。

发明内容

本发明提供一种解除对TBA检测干扰的方法、TC试剂盒及TG试剂盒，能够解除TC检测或TG检测对TBA检测干扰，提高TC、TG试剂的稳定性，还能减少试剂的刺激性，减少对人体的伤害。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种解除对TBA检测干扰的方法，将对TBA检测产生干扰的试剂盒中的胆酸钠去掉，将酚类底物替换为苯胺类衍生物；并在对TBA检测产生干扰的试剂盒中加入表面活性剂。

一种解除对TBA检测干扰的试剂盒，所述试剂盒的R1试剂包括保护剂、底物、表面活性剂、离子类物质和防腐剂；其中，底物为苯胺类衍生物。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

本发明提供一种解除对TBA检测干扰的方法，将对TBA检测产生干扰的试剂盒中的胆酸钠去掉，将酚类底物替换为苯胺类衍生物；并在对TBA检测产生干扰的试剂盒中加入表面活性剂。该方法能够保证干扰的试剂盒的准确度前提下，还能解除其对TBA检测的干扰，还能减少试剂的刺激性，减少对人体的伤害。同时，进一步地，本发明提供的试剂盒的R1试剂中添加蛋白类保护剂或糖类物质保护剂，能够提高试剂盒的热稳定性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的TC试剂盒未经热处理的对TBA检测的平均干扰偏差图；

图2是本发明实施例提供的TC试剂盒热处理后的对TBA检测的平均干扰偏差图；

图3是本发明实施例提供的TG试剂盒未经热处理的对TBA检测的平均干扰偏差图；

图4是本发明实施例提供的TG试剂盒热处理后的对TBA检测的平均干扰偏差图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

由于TBA试剂盒检测时，若与其同时在同一生化仪上检测的试剂盒中含有胆酸钠，因生化仪反应杯或加样针清洗不干净而可能导致对TBA试剂测值有干扰。

为解除胆酸钠对TBA检测的干扰，需要将产生干扰的试剂盒中的胆酸钠去掉，但是仅仅去掉胆酸钠，会造成产生干扰的试剂盒本身的准确性会变差而不能达到其本身的检测目的。因而，本发明提供的解除对TBA检测干扰的方法中，在对TBA检测产生干扰的试剂盒中的酚类底物替换为苯胺类衍生物作为底物，并加入表面活性剂，以保证试剂本身的准确性前提下，还能解除其对TBA检测的干扰，还能减少试剂的刺激性，减少对人体的伤害。

基于上述原因，本发明还提供了一种解除对TBA检测干扰的试剂盒，所述试剂盒的R1试剂包括保护剂、底物、表面活性剂、离子类物质和防腐剂；其中，底物为苯胺类衍生物。

具体的实施例中，所述底物为：TOOS、MAOS、TOPS、HDAOS、HALPS或HMMPS。

具体的实施例中，所述表面活性剂为：Emullgen A90、Emulgen A60、Emulgen B66、Emullgen 209、Emulgen430、Emullgen 709、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、吐温-20、吐温-80、月桂醇聚氧乙烯醚、丙三醇、蓖麻油、Tritox-405、PVP-40、Triton-114、Triton-100、GENAPOLX-080或NP-1055。

具体的实施例中，所述离子类物质包括以下物质的其中一种或两种组合：乙二胺四乙酸二钠、硫酸锌、氯化钠、氯化钾、二氯化锰、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁、四鹏酸钠、碳酸钾、酒石酸钠。

具体的实施例中，所述防腐剂为PC-300、或叠氮钠等其它防腐剂。

TC试剂盒

一种解除对TBA检测干扰的TC试剂盒，所述TC试剂的R1试剂包括PTPES、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、保护剂、底物、表面活性剂、离子类物质和防腐剂；其中，底物为苯胺类衍生物；所述TC试剂的R2试剂包括PIPES、4-氨基安替比林、叠氮钠、蛋白类物质。

具体的，替换后的TC试剂盒(COD-CE-PAP法)使用的原理为：血清中的胆固醇酯被胆固醇酯酶(CE)水解成游离胆固醇，后者被胆固醇氧化酶(COD)氧化成4-胆甾-3-烯酮并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化4-氨基安替比林(4-AAP)与苯胺类衍生物(三者合称PAP)生成红色醌亚胺(Trinder’s反应)。在505nm波长处比色测定，其吸光度与样品中总胆固醇(TC)含量成正比。与经过同样处理的校准品进行比较，即可计算出样品中总胆固醇含量。

TC试剂盒的R1试剂中包括：

PTPES(20-50mmol/L)；胆固醇酯酶(0.1-10KU/L)；胆固醇氧化酶(0.1-9KU/L)；过氧化物酶(3-30KU/L)；均购自南京都莱生物技术有限公司；

保护剂为：天门冬氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、草氨酸、牛血清白蛋白或谷氨酸钠；均为0.01-1.0％质量百分比；均购自Bovine Serum Albumin公司；

底物为：TOOS、MAOS、TOPS、HDAOS、HALPS、HMMPS或其他苯胺衍生物；浓度范围均为0.05-1.8mmol/L；如购自美国Medchemexpress公司；

表面活性剂为：Emullgen A90、Emulgen A60、Emulgen B66、Emullgen 209、Emulgen430、Emullgen 709(日本花王化学)；聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、吐温-20、吐温-80(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；月桂醇聚氧乙烯醚、丙三醇、蓖麻油(百灵威科技有限公司)；Tritox-405、PVP-40、Triton-114、Triton-100、GENAPOLX-080、NP-1055或其他表面活性剂(Merck公司)；浓度范围均为0.05％-1.0％；

离子类物质包括以下物质的其中一种或两种组合：乙二胺四乙酸二钠、硫酸锌、氯化钠、氯化钾二氯化锰、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁、四鹏酸钠、碳酸钾、酒石酸钠(百灵威科技有限公司)；上述离子类物质的使用浓度为2-20mmol/L。

防腐剂为：PC-300或叠氮钠(北京索莱宝科技有限公司)，浓度范围均为1ml/L。

TC试剂盒的R2试剂中包括：

PIPES(20-50mmol/L)(Merck公司)；4-氨基安替比林(0.5mmol/L-8mmol/L)(Merck公司)；叠氮钠(0.1％质量百分比)(Merck公司)；蛋白类物质(浓度范围均为0.05-1.00％质量百分比)(均购自Bovine Serum Albumin公司)：为牛血清白蛋白、甘氨酸、L-丝氨酸、草氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸钠。

下面根据上述对TC试剂盒的阐述，对其组分的实施例和对比例进行列表，如表1。

表1

TG试剂盒

一种解除对TBA检测干扰的TG试剂盒，所述TG试剂盒的R1试剂包括HEPES、胆蛋白脂肪酶、过氧化物酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶、保护剂、底物、表面活性剂、离子类物质和防腐剂；其中，底物为苯胺类衍生物；所述TG试剂盒的R2试剂包括PIPES、4-氨基安替比林、叠氮钠、蛋白类物质。

具体的，替换后的TG试剂盒(GPO-PAP法)的使用原理为：用高效的微生物脂蛋白脂肪酶(LPL)使血清中TG水解成甘油与脂肪酸，将生成的甘油用甘油激酶(GK)及三磷酸腺苷(ATP)磷酸化，以磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化3-磷酸甘油(G-3-P)，然后以过氧化物酶(POD)、4-氨基比林(4-AAP)与苯胺类衍生物(三者合称PAP)显色。在505nm波长下，通过检测所生成的醌亚胺，即可得到甘油三酯含量。

TG试剂盒的R1试剂中包括：

HEPES：20-50mmol/L；脂蛋白脂肪酶(LPL)：18KU/L-40KU/L；过氧化物酶(POD)：18KU/L-40KU/L；甘油激酶(GK)：18KU/L-40KU/L；磷酸甘油氧化酶(GPO):浓度范围为18KU/L-40KU/L；均购自南京都莱生物技术有限公司；

保护剂为：蔗糖、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、乳糖醇或山梨醇，浓度范围均为0.01％-30％的质量百分比；均购自Sigma公司；

底物为：TOOS、MAOS、TOPS、HDAOS、HALPS、HMMPS或其他苯胺衍生物；浓度范围均在0.05-1.8mmol/L，均购自美国Medchemexpress公司；

表面活性剂为：Emullgen A90、Emulgen A60、Emulgen B66、Emullgen 209、Emulgen430、Emullgen 709(日本花王化学)；聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、吐温-20、吐温-80(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；月桂醇聚氧乙烯醚、丙三醇、蓖麻油(百灵威科技有限公司)；Tritox-405、PVP-40、Triton-114、Triton-100、GENAPOLX-080、NP-1055或其他表面活性剂(Merck公司)；

离子类物质包含以下物质的其中一种或两种组合：乙二胺四乙酸二钠、硫酸锌、氯化钠、氯化钾二氯化锰、氯化钙、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁、四鹏酸钠、碳酸钾、酒石酸钠(百灵威科技有限公司)；使用浓度均为2-20mmol/L；

防腐剂为：PC-300或叠氮钠(北京索莱宝科技有限公司)，浓度范围均为1ml/L。

TG试剂盒的R2试剂中包括：

HEPES(20-50mmol/L)(Merck公司)；4-氨基安替比林(0.5mmol/L-8mmol/L)(Merck公司)；叠氮钠(0.1％)(Merck公司)；三磷酸腺苷(ATP)(浓度范围为0.1mmol/L-9mmol/L)(Bovine Serum Albumin公司)；蛋白类物质(Bovine Serum Albumin公司)：牛血清白蛋白、甘氨酸、L-丝氨酸、草氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸钠，浓度范围为0.01％-1％质量百分比。

下面根据上述对TG试剂盒的阐述，对其组分的实施例和对比例进行列表，如表2。

表2

TC试剂盒和TG试剂盒的性能评价、及TC测试或TG测试对TBA检测的干扰评价

1、材料、仪器与方法

实验仪器：HITACHI7180/7100

实验参数：

方法：终点法 温度：37℃

主波长：505nm 副波长：700nm

样本量：3μL R1：240μL

R2：60μL 反应方向：正向

反应时间：10min 定标方式：两点定标

干扰性能评价方法：

分别对以上实施例1-20和对比例1-4进行如下检测：

(1)精密度：重复测定同一样本10次，计算CV(％)，CV≤3％算满足要求；

(2)TC线性范围：测定0.05-12.90mmol/L范围样本，计算相关系数，r≧0.99算满足要求；TG线性范围：测定0.05mmol/L-10.00mmol/L范围样本，计算相关系数，r≧0.99算满足要求。

(3)准确度：测第三方质控品(朗道生化质控品)，计算测定平均值与靶值的偏差，≤5％算满足要求；

(4)稳定性：将试剂在37度放置7天，再评价以上指标：精密度、线性范围、准确度；

(5)干扰评价：

①清洗生化仪后，先用TBA试剂盒单独检测10个不同浓度的样本，测定完成之后，清洗生化仪至无干扰；

②将对比例TC试剂盒(对比例1-2)与TBA试剂盒同时检测同样的10个样本，测定完成之后，清洗生化仪至无干扰；再用实施例1-11分别与TBA试剂盒同时检测，清洗生化仪至无干扰；如此，将TC试剂盒与TBA试剂盒同时检测的共11组。

③将TBA试剂盒与TC试剂盒同时检测的11组与TBA试剂盒单独检测的测值进行比较，计算干扰偏差，并针对10个样本计算平均干扰偏差；平均干扰偏差值≤10％算满足要求；

TG试剂盒对TBA试剂盒的干扰评价方法同TC，如下：

①清洗生化仪后，先用TBA试剂盒单独检测10个不同浓度的样本，测定完成之后，清洗生化仪至无干扰；

②将对比例TG试剂盒(对比例3-4)与TBA试剂盒同时检测同样的10个样本，测定完成之后，清洗生化仪至无干扰；再用实施例12-20分别与TBA试剂盒同时检测，清洗生化仪至无干扰；如此，将TG试剂盒与TBA试剂盒同时检测的共9组。

③将TG试剂盒与TBA试剂盒同时检测的9组与TBA试剂盒单独检测的测值进行比较，计算干扰偏差，并针对10个样本计算平均干扰偏差，平均干扰偏差值≤10％算满足要求。

2、实验结果和结论

表3和图1均表示的是未经热处理的TC试剂盒对TBA试剂盒测值干扰偏差结果。对比例1和2的TC试剂中的底物均为苯酚，对比例1的TC试剂中还使用了胆酸钠。而实施例1-11的试剂中，不含胆酸钠，底物选自上述的苯胺类衍生物。从表3和图1的结果可以看出，对比例1的干扰偏差均值最大，远超规定标准范围，说明对比例1的TC试剂盒对TBA试剂盒检测值的干扰严重。相对于对比例1的干扰偏差均值，实施例1-11和对比例2的TC试剂盒干扰偏差值均显著下降，达到规定的标准范围以内；这说明实施例1-11和对比例2的TC试剂盒在不使用胆酸钠的情况下，均能够显著降低对TBA试剂盒检测值的干扰偏差，在与TBA同时检测时，解除了对TBA检测的影响。

表3 TC试剂盒对TBA试剂盒测值干扰偏差结果(未经热处理)

而表4和图2列出了对于TC试剂盒和TBA试剂盒同时检测时，经过热处理前后的TC试剂盒检测值的精密度、线性相关性、准确度和对TBA检测平均干扰偏差。对比例1的TC试剂，在热处理前后，对TBA检测均有严重干扰。在热处理前，对比例2的TC试剂盒解除了对TBA检测干扰；而在热处理后，对比例2的TC试剂盒对TBA检测的平均干扰偏差有所升高，超出了标准规定的范围；说明对比例2的TC试剂盒热稳定性不佳。而且热处理前后，对比例2的TC试剂盒的精密度和准确度均高于实施例1-11和对比例1，说明仅仅去掉TC试剂盒中的胆酸钠，虽然能够解除对TBA测试的干扰，但是其TC试剂盒本身的检测大受影响。

在热处理前后，实施例1、3、5-11的TC试剂盒的准确度和平均干扰偏差均低于对比例1-2，并达到规定的标准范围，说明实施例1、3、5-11的TC试剂盒的准确度高，能够解除对TBA检测的干扰；并且在热处理后，其平均干扰偏差和准确度变化小，说明实施例实施例1、3、5-11的TC试剂盒的热稳定性优良。

而对于实施例2和实施例4的TC试剂，其热处理前，TC试剂的精密度、线性相关性、准确度和平均干扰偏差，均达到规定的标准，解除了对TBA的干扰。而在热处理后，由于实施例2和4的TC试剂盒中R1试剂未添加有蛋白类物质作为保护剂，其精密度、线性相关性、准确度均受到了影响，超出了规定的范围，这说明在TC试剂盒的R1试剂中添加蛋白类保护剂，能够提高其热稳定性。

表4 TC试剂盒性能及对TBA试剂盒检测干扰评价结果汇总表

表5和图3均表示的是未经热处理的TG试剂盒对TBA试剂盒测值干扰偏差结果。对比例3和4的TG试剂中的底物均为对氯苯酚，对比例3的TG试剂中还使用了胆酸钠。而实施例12-20的试剂中，不含胆酸钠，底物选自上述的苯胺类衍生物。从表5和图3的结果可以看出，对比例3的干扰偏差均值最大，远超规定标准范围，说明对比例3的TG试剂盒对TBA试剂盒检测值的干扰严重。相对于对比例3的干扰偏差均值，实施例12-20和对比例4的TG试剂盒干扰偏差值均显著下降，达到规定的标准范围以内；这说明实施例12-20和对比例4的TG试剂盒在不使用胆酸钠的情况下，均能够显著减低对TBA试剂盒检测值的干扰偏差，在与TBA同时检测时，解除了对TBA检测的影响。

表5 TG试剂盒对TBA试剂盒测值干扰偏差结果(未经热处理)

而表6和图4列出了对于TG试剂盒和TBA试剂盒同时检测时，经过热处理前后的TBA试剂盒检测值的精密度、线性相关性、准确度和平均干扰偏差。对比例3的TG试剂，在热处理前后，对TBA检测均有严重干扰。在热处理前，对比例4的TG试剂盒解除了对TBA检测干扰；而在热处理后，对比例4的TG试剂盒对TBA检测的平均干扰偏差有所升高，超出了标准规定的范围；说明对比例4的TG试剂盒热稳定性不佳。而且热处理前后，对比例4的TG试剂盒的精密度和准确度均高于实施例12-20和对比例3，说明仅仅去掉TG试剂盒中的胆酸钠，虽然能够解除对TBA测试的干扰，但是其TG试剂盒本身的检测大受影响。

在热处理前后，实施例12、15-20的TG试剂的准确度和平均干扰偏差均低于对比例3-4，并达到规定的标准范围，说明实施例12、15-20的TG试剂的准确度高，能够解除对TBA检测的干扰；并且在热处理后，其平均干扰偏差和准确度变化小，说明实施例12、15-20的TG试剂的热稳定性优良。

而对于实施例13和14的TG试剂，其热处理前，TG试剂的精密度、线性相关性、准确度和平均干扰偏差，均达到规定的标准，解除了对TBA的干扰。而在热处理后，由于实施例13和14的TG试剂盒中R1试剂未添加有糖类物质作为保护剂，其精密度、线性相关性、准确度均受到了影响，超出了规定的范围，这说明在TG试剂盒的R1试剂中添加糖类保护剂，能够提高其热稳定性。

表6 TG试剂盒性能及对TBA试剂盒检测干扰评价结果汇总表

综上所述，本发明提供一种解除对TBA检测干扰的方法，将对TBA检测产生干扰的试剂盒中的胆酸钠去掉，将酚类底物替换为苯胺类衍生物；并在对TBA检测产生干扰的试剂盒中加入表面活性剂。本发明提供的解除对TBA检测产生干扰的试剂盒，在保证其本身检测的准确度的前提下，在试剂盒与TBA试剂盒同时检测时，均能够解除对TBA检测的干扰。具体的，在TC试剂盒的R1试剂中添加蛋白类保护剂，或在TG试剂盒的R1试剂中加入糖类物质保护剂，能够提高TC试剂盒的热稳定性和TG试剂盒的热稳定性。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。