阅读说明：本技术 一种基于Trinder反应的检测试剂盒及其应用 (Trinder reaction-based detection kit and application thereof ) 是由 梁艳 赵畅 龚婷 吴年芬 凡速朋 舒芹 张雪娇 赵愿安 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于Trinder反应的检测试剂盒及其应用,属于临床化学检测技术领域,由R1试剂和R2试剂组成,R1和R2试剂中包含催化待测物生成过氧化氢的酶,R1试剂中还含有缓冲液、防腐剂、过氧化物酶,R2试剂中含有缓冲液、防腐剂、过氧化物和色原底物,所述R1试剂中过氧化物酶的浓度为100～150KU/L,且R1试剂中还含有浓度为0.5～1g/L的4-氨基安替比林。其中R1试剂中的过氧化物酶和4-氨基安替比林可在Trinder反应前,去除待测物中可参与Trinder反应的临床药物,使得测定结果更加准确。本发明不需要在反应体系中额外加入其它物质,不会引入其它杂质；该方法简单高效,可广泛用于多种临床化学检测,避免临床药物的干扰,增强检测结果的准确性,同时还提高了试剂盒的功能灵敏度。(The invention discloses a Trinder reaction-based detection kit and application thereof, belonging to the technical field of clinical chemistry detection and comprising an R1 reagent and an R2 reagent, wherein the R1 reagent and the R2 reagent contain enzymes for catalyzing a substance to be detected to generate hydrogen peroxide, the R1 reagent also contains a buffer solution, a preservative and peroxidase, the R2 reagent contains a buffer solution, a preservative, peroxide and a chromogen substrate, the concentration of the peroxidase in the R1 reagent is 100-150 KU/L, and the R1 reagent also contains 4-aminoantipyrine with the concentration of 0.5-1 g/L. Wherein, the peroxidase and the 4-aminoantipyrine in the R1 reagent can remove clinical drugs which can participate in the Trinder reaction in a substance to be tested before the Trinder reaction, so that the determination result is more accurate. According to the invention, other substances are not required to be additionally added into the reaction system, and other impurities are not introduced; the method is simple and efficient, can be widely used for various clinical chemical detections, avoids the interference of clinical drugs, enhances the accuracy of detection results, and simultaneously improves the functional sensitivity of the kit.)

一种基于Trinder反应的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于临床化学检测技术领域，具体涉及一种基于Trinder反应的检测试剂盒及其应用。

背景技术

Trinder反应又称“偶联终点比色法”，其原理为被测物质通过酶作用产生的过氧化氢(H₂O₂)在4-氨基安替比林(4-AAP)、过氧化物酶(POD)的存在下，可生成红色醌亚胺化合物，通过测定反应前后的吸光度差值，即可计算得到待测物的浓度。临床生化许多检测项目都应用了Trinder反应，如葡萄糖、甘油三脂、胆固醇、尿酸、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、游离脂肪酸等。如中国专利CN106191213B公开了一种游离脂肪酸测定试剂盒及其制备方法，其反应原理是人血清中游离脂肪酸和辅酶A在乙酰辅酶A合成酶的作用下反应生成脂酰辅酶A，脂酰辅酶A在乙酰辅酶A氧化酶的作用下生成H₂O₂，随后通过Trinder反应在过氧化物酶(POD)的作用下生成有色物质以测定游离脂肪酸含量。

然而随着医学的迅猛发展，越来越多的药物及检验项目运用于临床，有研究表明，当患者服用1种药物时，受药物干扰的实验所占百分比为7％，服用2种药物时，占16.7％，服用三种或四种药物时，百分比为66.7％，服用5种药物时，受干扰的试验占比达100％。药物对检测结果的影响，不仅导致对检测结果的错误解释、误诊，而且增加了一些不必要的检查，所以解决检测中的药物干扰问题显得尤为重要。临床上常见药物如：羟苯磺酸钙(用于治疗微血管疾病等)、酚磺乙胺(止血药物)、甲基多巴(抗高血压药物)、左旋多巴(用于治疗帕金森综合征)、多巴胺(神经传导物质)等，由于具有强还原性或与Trinder反应中的色原底物结构类似，因此会在Trinder反应时消耗过氧化氢，导致待测物的测量值偏低。并且这些药物结构稳定、不易被破坏或降解，因此会对基于Trinder反应的临床化学检测产生干扰，影响测定结果。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种基于Trinder反应的检测试剂盒，该试剂盒通过在R1试剂中提前加入过氧化物酶和4-氨基安替比林，去除待测物中参与Trinder反应的临床药物，从而避免了化学检测过程中多种临床药物对Trinder反应检测的干扰，将该试剂盒用于临床化学检测，可使得测定结果更准确、抗干扰能力更强。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于Trinder反应的检测试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成，R1和R2试剂中包含催化待测物生成过氧化氢的酶，R1试剂中还含有缓冲液、防腐剂、过氧化物酶，R2试剂中含有缓冲液、防腐剂、过氧化物和色原底物，其中所述R1试剂中过氧化物酶的浓度为100～150KU/L，同时R1试剂中还含有浓度为0.5～1g/L的4-氨基安替比林；

所述检测试剂盒可提高抗临床药物干扰的能力，所述临床药物包括：羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、甲基多巴、左旋多巴、多巴胺中的一种或多种。

本发明的技术方案还提供了一种提高Trinder反应检测抗干扰能力的方法，包括以下步骤：

S1、在所述Trinder反应前加入过氧化物酶至终浓度为100～150KU/L，同时加入4-氨基安替比林至终浓度为0.5～1g/L，以去除待测物中的临床药物，其中所述临床药物可参与Trinder反应；

S2、在所述Trinder反应时加入可催化待测物生成过氧化氢的酶，同时加入过氧化物酶和苯胺类衍生物至终浓度分别为25～30KU/L和1g/L，以进行Trinder反应，生成显色物质；

S3、测定Trinder反应前后的吸光度以检测待测物浓度。

本发明的技术方案还提供了基于Trinder反应的检测试剂盒在临床化学检测中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：在R1试剂中，即Trinder反应前加入过氧化物酶和4-氨基安替比林以消耗待测物中的临床药物，从而避免了临床药物对Trinder反应检测的干扰，使得测定结果更加准确，过量的过氧化物酶和4-氨基安替比林可直接用于后续Trinder反应，并且本发明不需要在反应体系中额外加入其它物质，避免引入其它杂质。该方法简单高效，可广泛用于多种临床化学检测并制备相应的临床化学检测试剂盒，增强检测结果的准确性，避免药物干扰。

具体实施方式

本发明提供了一种基于Trinder反应的检测试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成，R1和R2试剂中包含催化待测物生成过氧化氢的酶，R1试剂中还含有缓冲液、防腐剂、过氧化物酶，R2试剂中含有缓冲液、防腐剂、过氧化物和色原底物，其中所述R1试剂中过氧化物酶的浓度为100～150KU/L，且R1试剂中还含有浓度为0.5～1g/L的4-氨基安替比林；

所述检测试剂盒可提高临床药物的抗干扰能力，所述临床药物包括：羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、甲基多巴、左旋多巴、多巴胺中的一种或多种。

针对不同的待测物，检测试剂盒中所使用的催化酶不同，并且仅在R1和R2试剂混合后才可开始催化反应，以逐步催化待测物生成过氧化氢。

该检测试剂盒通过在R1试剂中加入过氧化物酶和4-氨基安替比林，以去除待测物中参与Trinder反应的临床药物。部分临床药物由于具有强还原性或与Trinder反应中的色原底物结构类似，因此会参与Trinder反应并竞争消耗待测物产生的过氧化氢，导致最终待测物的测定值偏低。本发明为避免临床药物对测定结果的影响，在Trinder反应前，即R1试剂中加入过量的过氧化物酶和4-氨基安替比林对血清样本进行处理，使临床药物与血清中的过氧化氢、R1试剂中的过氧化物酶及4-氨基安替比发生反应，提前将临床药物消耗掉，从而使测定结果更加准确，避免了临床药物对Trinder反应检测的干扰。

优选地，所述R1试剂和R2试剂中的缓冲液为磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、Good’s缓冲液、MOPSP缓冲液、BICINE缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任意一种。

优选地，所述缓冲液的浓度为20-100mmol/L。

优选地，所述R1试剂和R2试剂中的防腐剂为叠氮化钠、二氯乙酰氨、咪唑烷基脲、硫柳汞、庆大霉素、异噻唑啉酮类、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金酯、Proclin系列、KroVin系列中的一种或多种。

优选地，所述防腐剂的浓度为0.1-10g/L。

优选地，所述R1试剂中还包括金属离子螯合剂和表面活性剂，用于保持过氧化物酶的稳定性。

优选地，所述R2试剂中，过氧化物酶的浓度为25～30KU/L。

优选地，所述色原底物为苯胺类衍生物，所述苯胺类衍生物的浓度为1g/L，以苯胺类衍生物作为色原底物，相比于传统的酚类物质，生色基团的稳定性和溶解度以及产物的灵敏度和色泽的稳定度均有所提高。

优选地，所述苯胺类衍生物为DHBS、TOOS、HDAOS、F-DAOS、DHBA、TOPS、ADOS、ADPS、ALPS、DAOS、MADB、MAOS、TODB中的一种或多种。其中DHBS为3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，TOOS为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，HDAOS为N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠盐，F-DAOS为N-乙基-N-(2-羟-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-4-氟苯胺，DHBA为3,4-二羟基苄胺氢溴酸盐，TOPS为N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲苯胺钠盐，ADOS为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，ADPS为N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，ALPS为N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，DAOS为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，MADB为N,N-二(4-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐，MAOS为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐，TODB为N,N-二(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐，且DHBS的显色效果更优。

优选地，所述试剂盒包括：肌酐检测试剂盒(酶法)、甘油三酯检测试剂盒(GPO-PAP法)、总胆固醇检测试剂盒(COD-PAP法)、游离脂肪酸检测试剂盒(酶法)、糖化白蛋白检测试剂盒(酶法)、高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒、尿酸检测试剂盒(酶法)、葡萄糖检测试剂盒(GPO-PAP法)、腺苷脱氨酶检测试剂盒、脂肪酶检测试剂盒、5’-核苷酸酶检测试剂盒等。

本发明还提供了一种基于Trinder反应的检测试剂盒用于提高Trinder反应检测抗干扰能力的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、在所述Trinder反应前加入过氧化物酶至终浓度为100～150KU/L，同时加入4-氨基安替比林至终浓度为0.5～1g/L，以去除待测物中的临床药物，其中所述临床药物可参与Trinder反应；

S2、在所述Trinder反应时加入可催化待测物生成过氧化氢的酶，同时加入过氧化物酶和苯胺类衍生物至终浓度分别为25～30KU/L和1g/L，以进行Trinder反应，生成显色物质；

S3、测定Trinder反应前后的吸光度以检测待测物浓度。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中对各试剂盒的性能评价方法具体如下：

(1)精密度：采用各试剂盒重复测定同一样本10次，计算变异系数(CV，％)并记作精密度，其中精密度≤5％视作满足要求；

(2)线性范围：采用各试剂盒测定一定浓度范围的样本，并计算线性相关系数r，其中r≥0.99视作满足要求；

(3)准确度：用各试剂盒测定第三方质控品，计算各试剂盒测定值与第三方质控品靶值的偏差，其偏差≤10％算满足要求；

(4)功能灵敏度：采用各试剂盒测定低浓度样本，测定并计算各试剂盒的日间变异系数，其中日间变异系数为20％时对应的检测样本的平均浓度，记作功能灵敏度；

(5)稳定性：将各试剂盒于37℃度放置7天，再评价上述指标：精密度、线性范围、准确度、功能灵敏度；

(6)干扰评价：用超纯水梯度稀释干扰物质，并将各浓度的干扰物质按照1:9的比例分别添加到空白对照血清(即不含有干扰物质的正常人混合血清)中，各干扰物的终浓度如实施例中表格所示。用各试剂盒分别测定空白血清和加入不同浓度干扰物质的血清的吸光度值，每份血清样本测定3次得到均值，并计算均值与空白对照血清测量值的偏差((均值-空白对照)/空白对照*100％)，即为干扰度。若干扰度的绝对值小于10％，记作抗干扰，否则记作不抗干扰。其中干扰药物包括羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、甲基多巴、左旋多巴和多巴胺；血清中的一般干扰物质为抗坏血酸、胆红素、血红蛋白和甘油三酯。

实施例1肌酐检测试剂盒

本实施例提供了一种肌酐检测试剂盒中，并与常规的肌酐检测试剂盒进行对比，其中本发明所述的检测试剂盒为试验组一，常规的肌酐检测试剂盒为对照组一，配方具体如下：

其中试验组一相比于对照组一，在R1试剂组分中加入了150KU/L的过氧化物酶和1g/L的4-氨基安替比林用于消耗药物，同时由于过氧化物酶的稳定性比过氧化氢酶的稳定性差，因此试验组一还在R1试剂组分中加入了适量的金属离子螯合剂HEDTA和表面活性剂GENAPOLX-080用于保证过氧化物酶的稳定；试验组一还在R2试剂组分中加入了1g/L DHBS替代对照组一R1试剂组分中的TOOS作为色原底物。

取空白样本(超纯水)、待测样本和肌酐校准品(武汉生之源科技股份有限公司生产)各6μL，加入270μL的R1试剂，混合均匀后于37℃保温5min，以空白样本调零，使用仪器HITACHI 7180(武汉生之源科技股份有限公司)测定待测样本在546nm波长下的吸光度记作A₁，然后向各管加入90μL的R2试剂，混合均匀后于37℃保温5min，以空白样本调零，以肌酐校准品定标，使用仪器HITACHI 7180(武汉生之源科技股份有限公司)测定待测样本在546nm波长下的吸光度记作A₂，即待测样品的吸光度ΔA＝A₂-A₁。并按上述性能评价方法测定对照组一和试验组一的性能(线性范围部分，样本的浓度范围为：2.4μmol/L-8840.0μmol/L)，结果如表1-3所示。

表1药物干扰偏差数据

表2血清中一般干扰物质的干扰偏差数据

表3性能评价数据

根据表1-2的测定结果可知，对照组一和试验组一得到的肌酐检测试剂盒对血清中一般干扰物质(胆红素、血红蛋白、抗坏血酸和甘油三酯)均具有抗干扰能力(干扰度绝对值≤10％)，但是对照组一的肌酐检测试剂盒对临床常见药物(羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、甲基多巴、左旋多巴、多巴胺)不具有抗干扰能力，而按本发明所述的方法制备得到的肌酐检测试剂盒对临床常见药物均具有较强的抗干扰能力(干扰度均小于5％)。根据表3的测定结果可知，试验组一制备得到的试剂在37℃放置7天后，其精密度、线性相关系数和准确度均能满足要求，且无较大变化，变化差异均在可接受范围内，即稳定性较强，并且本发明制备得到的试剂盒的功能灵敏度显著高于对照组一，即在待测物浓度较低时，试验组一也可准确测量待测物浓度，灵敏度显著增强。即本实施例制备得到了一种对临床常见药物具有较强抗干扰能力、功能灵敏度升高且其他性能无较大变化的肌酐检测试剂盒。

实施例2游离脂肪酸检测试剂盒

本实施例提供了一种游离脂肪酸检测试剂盒，并与常规的游离脂肪酸检测试剂盒进行对比，其中本发明所述的检测试剂盒为试验组二，常规的肌酐检测试剂盒为对照组二，配方具体如下：

其中试验组二相比于对照组二，在R1试剂组分中加入了100KU/L的过氧化物酶和0.5g/L的4-氨基安替比林用于消耗药物，且R1试剂中不含有金属离子螯合剂和表面活性剂；在R2试剂组分中加入了1g/L的HAOS替代对照组一R1试剂组分中的TOOS作为色原底物。测定方法与实施例1相同，其中各样本量为5μL，加入240μL的R1试剂，60μL的R2试剂。按前述性能评价方法测定对照组二和试验组二的性能(线性范围部分，样本的浓度范围为：0.010mmol/L-3.000mmol/L)，结果如表4-6所示。

表4药物干扰偏差数据

表5血清中一般干扰物质的干扰偏差数据

表6性能评价数据

根据表4-5的测定结果可知，对照组二和试验组二得到的游离脂肪酸检测试剂盒对血清中一般干扰物质(胆红素、血红蛋白、抗坏血酸和甘油三酯)均具有抗干扰能力(干扰度绝对值≤10％)，但是对照组二的游离脂肪酸检测试剂盒对临床常见药物(羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、甲基多巴、左旋多巴、多巴胺)不具有抗干扰能力，而本发明制备得到的游离脂肪酸检测试剂盒对临床常见药物均具有较强的抗干扰能力(干扰度均小于5％)。

根据表6的测定结果可知，由于试验组二的R1试剂中不含有金属离子螯合剂和表面活性剂，因此制备得到的试剂在37℃放置7天前后，其精密度、线性相关系数和准确度的变化差异略大于实施例1的试验组一中制备得到的试剂，但仍能满足要求，即R1试剂中即使不含有金属离子螯合剂和表面活性剂物，仍能保持较强的稳定性，并且本发明制备得到的试剂的功能灵敏度显著高于对照组二。即本实施例制备得到了一种对临床常见药物具有较强抗干扰能力、功能灵敏度升高且其他性能无较大变化的游离脂肪酸检测试剂盒。

实施例3甘油三酯检测试剂盒

本实施例提供了一种甘油三酯检测试剂盒，并与常规的甘油三酯检测试剂盒进行对比，其中试验组三为本发明所述的检测试剂盒，对照组三为常规的甘油三酯检测试剂盒，配方具体如下所示：

其中试验组三相比于对照组三，在R1试剂组分中加入了4mmol/L(0.81g/L)的4-氨基安替比林，即在Trinder反应前同时加入了过氧化物酶和4-氨基安替比林，而对照组三是在R2试剂组分中加入的4-氨基安替比林用于进行Trinder反应，同时试验组三在R2试剂组分中加入了DHBS替代对照组三R1试剂组分中的对氯苯酚作为色原底物。测定方法如实施例1所示，其中各样本量为3μL，加入240μL的R1试剂，60μL的R2试剂。按上述性能评价方法测定对照组三和试验组三的性能(线性范围部分，样本的浓度范围为：0.05mmol/L-10.00mmol/L)，结果如表7-9所示。

表7药物干扰偏差数据

表8血清中一般干扰物质的干扰偏差数据

表9性能评价数据

根据表7-8的测定结果可知，对照组三和试验组三得到的甘油三酯检测试剂盒对血清中一般干扰物质(胆红素、血红蛋白和抗坏血酸)均具有抗干扰能力(干扰度绝对值≤10％)，但是对照组三的甘油三酯检测试剂盒对临床常见药物(羟苯磺酸钙、酚磺乙胺、甲基多巴、左旋多巴、多巴胺)不具有抗干扰能力，而按本发明制备得到的甘油三酯检测试剂盒对临床常见药物均具有较强的抗干扰能力(干扰度均小于5％)，即仅有在R1试剂中同时存在过氧化物酶和4-氨基安替比林时(Trinder反应前同时加入过氧化物酶和4-氨基安替比林时)，可达到消耗药物，避免药物干扰Trinder反应检测的效果，而仅加入过氧化物酶，无法达到消耗药物的作用。根据表9的测定结果可知，试验组三制备得到的试剂在37℃放置7天后，其精密度、线性相关系数和准确度均能满足要求，且无较大变化，变化差异均在可接受范围内，即稳定性较强，并且本发明制备得到的试剂的功能灵敏度显著高于对照组三。即本实施例制备得到了一种对临床常见药物具有较强抗干扰能力、功能灵敏度升高且其他性能无较大变化的甘油三酯检测试剂盒。

由于R1试剂中的过氧化物酶和4-氨基安替比林可与待测血清中的具有强还原性或与Trinder反应中的色原底物结构类似的多种临床常见药物发生反应，以提高试剂盒的抗干扰能力，因此该方法可广泛用于制备多种基于Trinder反应的检测试剂盒。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。