阅读说明：本技术 一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法 (Method for creating new allelic variation through rice micro-effect gene cloning ) 是由 朱玉君 庄杰云 张振华 樊叶杨 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法。具体地,从水稻品种珍汕97和密阳46衍生的次级群体中克隆微效粒长QTL qGL1-34.3,粒长在珍汕97和密阳46等位基因间的差异约为0.021mm。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对qGL1-34.3进行定向编辑,获得的新等位基因与野生型之间的粒长差异约为0.095mm,成功在微效基因座位上创建具有较大效应的等位变异。本发明为新等位变异创建提供新方法,有助于拓宽栽培稻的遗传变异,进而为水稻品种改良提供技术基础。(The invention discloses a method for creating new allelic variation through rice micro-effect gene cloning. Specifically, micro-effect particle length QTL qGL1-34.3 is cloned from a secondary population derived from rice variety Zhenshan 97 and Miyang 46, and the difference of the particle length between Zhenshan 97 and Miyang 46 alleles is about 0.021 mm. The method adopts CRISPR/Cas9 gene editing technology to carry out directional editing on qGL1-34.3, the grain length difference between the obtained new allele and the wild type is about 0.095mm, and the allele variation with larger effect is successfully created on the micro-effect gene locus. The invention provides a new method for creating new allelic variation, is beneficial to widening the genetic variation of the cultivated rice and further provides a technical basis for improving rice varieties.)

一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及到一种通过微效基因克隆创建新等位变异的方法，即水稻粒长微效基因qGL1-34.3的克隆以及应用基因编辑技术创建该微效基因的新等位变异。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一，全球有近一半以上的人口以水稻为主食。我国是水稻生产和消费大国，培育优良的水稻新品种是保证国家粮食安全的重要基础。

水稻品种的改良基于遗传变异，但在水稻长期驯化和品种改良过程中，无论是从野生稻到栽培稻，还是从地方品种到现代改良品种，由于人工选择，遗传多样性持续下降，仅保留了小部分遗传变异。该现象可能正是近年来水稻产量提高遇到瓶颈的原因之一。因此，拓宽遗传变异对水稻品种改良具有重要意义，它包含两种基本途径：外源基因导入和新等位变异创制。对于栽培稻，导入野生稻中的有利等位基因可有效拓宽其遗传变异。在抗病虫等质量性状改良中已取得显著成效，但在产量性状的改良过程中，由于野生稻本身表现不佳以及数量性状由多基因控制的原因进展缓慢。

传统的新等位变异创制主要是指诱变育种，即通过物理、化学或生物学手段诱发生物体发生突变，通过筛选有利变异获得新的品种资源，它在新种质创制和新品种选育中都取得显著成效。但传统的诱变方法引起的突变存在随机性，有利变异需在大规模的群体中筛选，效率较低。

新兴的基因编辑技术可以定向编辑目的基因，改良目标性状，为新等位变异创制提供了一种有效手段。应用基因编辑技术，首先要明确控制目标性状的目的基因。目前，应用数量性状基因(Quantitative Trait Locus，QTL)定位方法已在水稻中克隆31个与产量相关的QTL，其中，控制粒重和粒型的最多，共有17个。这些QTL都呈现出主效作用，但从基因组分布、以及初定位区间看占比太低，限制了基因组编辑技术在拓宽栽培稻遗传变异中的应用。相比主效QTL，微效QTL同样在水稻重要农艺性状调控中扮演着重要角色，无论是机理剖析、还是育种应用，这类QTL都不容忽视。而且，前人研究表明微效QTL在基因组中的比重远超主效QTL。因此，如能成功克隆微效QTL，并应用基因编辑技术创制新的等位变异将对拓宽栽培稻遗传变异大有裨益。

基于此背景，发明人建立了一种通过微效基因克隆创建新等位变异的技术途径。

发明内容

本发明提供了一种通过微效基因克隆创建新等位变异的方法，具体表现为水稻粒长微效QTL qGL1-34.3的克隆，以及在功能验证的同时创建新的等位变异。

通过微效基因克隆创建新等位变异的方法，其特征在于：(1)应用剩余杂合体策略构建近等基因系群体；(2)精细定位微效基因至仅包少数几个候选基因的区间内；(3)应用基因编辑技术定向突变候选基因，功能验证的同时获得新的等位变异。

该方法的详细步骤如下：

(1)筛选杂合区间覆盖目标基因所在区间的剩余杂合体单株，自交后发展F₂群体；

(2)从F₂群体中筛选杂合区间呈连续交叠排列的、新的剩余杂合体单株，分别自交发展F₂群体；

(3)从各F₂群体中筛选杂合区间内分别呈双亲纯合型单株，自交后获得分离区间呈连续交叠排列的近等基因系群体；

(4)首先分析各近等基因系群体的分离区间是否存在基因分离，然后比较各群体分离区间，缩小基因所在区间；

(5)重复步骤(1)至步骤(4)，直至将基因所在区间界定至仅包含少数几个候选基因的大小；

(6)应用基因编辑技术定向编辑候选基因获得突变体，通过分析突变体与野生型之间的表型差异，验证候选基因功能；

(7)在目标基因座位上发生突变、性状发生变异的突变体所携带的等位基因即为新的等位变异。

本发明克隆的粒长微效基因为qGL1-34.3，其片段如SEQ ID NO：1–3所示，或者相当于SEQ ID NO：4–6所示的同源序列，具体信息如下：

SEQ ID NO：1所示的是来源于珍汕97的qGL1-34.3等位基因的全基因组序列。

SEQ ID NO：2所示的是来源于珍汕97的qGL1-34.3等位基因的cDNA序列。

SEQ ID NO：3所示的是来源于珍汕97的qGL1-34.3等位基因编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4所示的是来源于密阳46的qGL1-34.3等位基因的全基因组序列。

SEQ ID NO：5所示的是来源于密阳46的qGL1-34.3等位基因的cDNA序列。

SEQ ID NO：6所示的是来源于密阳46的qGL1-34.3等位基因编码的氨基酸序列。

附图说明

图1表示近等基因系群体的构建过程。

图2表示qGL1-34.3的定位过程：(A)qTGW1.2b被界定在371.5kb区间；(B)qTGW1.2b被界定在108.6kb区间；(C)qGL1-34.3被界定在44.0kb区间；(D)qGL1-34.3所在区间包含6个注释基因。

图3表示珍汕97型近等基因系与密阳46型近等基因系之间的粒长差异。

图4表示野生型日本晴与敲除突变体间的粒长差异。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步解释，不用于限定本发明的范围。实施例中涉及的实验方法，无特殊说明均为分子生物学常规方法；涉及的实验试剂和耗材，无特殊说明均为常规生化试剂。

实施例1 qGL1-34.3的精细定位

1.近等基因系群体构建

申请人应用珍汕97///珍汕97//珍汕97/密阳46衍生的BC₂F_9:10近等基因系(Nearisogenic line，NIL)群体，在水稻第1染色体长臂RM11730-RM11885区间分解出3个控制水稻千粒重的QTL，分别为qTGW1.2a、qTGW1.2b和qTGW1.2c(Wang et al 2015)。本发明以位于RM11781-RM11800区间约418.8kb的qTGW1.2b为目标进行图位克隆。针对该区间发明人共构建了2套群体，分别包含4个和3个NIL群体，构建过程如图1所示。

首先，从BC₂F₉群体挑选1个杂合区间为RM212-RM11787且包含qTGW1.2b的剩余杂合体单株。该单株自交2代，且经4个新发展的InDel标记检测，获得1个杂合区间为Wn33304-RM11787的BC₂F₁₁群体。在该群体中，筛选到4个杂合区间呈连续交叠排列的剩余杂合体单株，自交生成4个BC₂F₁₂ NIL-F₂群体，通过基因型检测，各群体挑选非重组单株，自交后生成4个BC₂F_12:13 NIL群体，分别为L1、L2、L3和L4。

然后，根据上述4个BC₂F_12:13 NIL群体的定位结果，在BC₂F₁₂群体中筛选到1个杂合区间为Wn34293-RM11787的剩余杂合体单株，自交后生成BC₂F₁₃群体，同时，新设计4个InDel标记，经基因型检测杂合区间更新为Wn34286-RM11787，从该BC₂F₁₃群体中，筛选到3个剩余杂合体单株，自交生成3个BC₂F₁₄ NIL-F₂群体，通过基因型检测，各群体挑选非重组单株，自交后生成3个BC₂F_14:15 NIL群体，分别为W1、W2和W3。

2.DNA提取

QTL定位群体的DNA提取按以下步骤：

(1)剪取1-2cm水稻幼苗叶片，装入2.0ml灭菌离心管中。

(2)加入300ul DNA提取液和1颗直径为2.0mm的小钢珠，用组织研磨仪将叶片碾碎。

(3)加入300ul氯仿萃取液，颠倒混匀。

(4)12,000rpm离心2min后，吸取250ul上清液至1.5ml灭菌离心管。

(5)加入500ul预冷无水乙醇，颠倒混匀。

(6)12,000rpm离心3min后，弃上清液，用70％乙醇洗涤离心管壁和沉淀。

(7)将离心管倒扣于纸上，DNA沉淀自然干燥后，加入100ul 1/10×TE缓冲液进行溶解。

(8)取1ul DNA作为模板进行PCR扩增反应。

3.InDel标记开发

根据qTGW1.2b所在区间标记RM11781和RM11800在粳稻品种日本晴的基因组位置，从RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search)下载RM11781-RM11800区间内日本晴序列。通过比较珍汕97和密阳46的全基因组重测序结果，在目标区间内查找双亲间序列发生***缺失的位置，参考日本晴基因组，应用软件Oligo 7.0(Lasergene公司)设计上下游引物序列。所设引物首先扩增珍汕97和密阳46的DNA，确定双亲等位基因存在多态时，该引物用于分离群体检测。本发明共设计InDel标记8对，上下游引物序列如表1所示。

表1本发明开发的8对InDel标记信息

4.PCR扩增及产物检测

PCR反应体系(10μl)：80mM(NH₄)₂SO₄；335mM Tris-HCL；0.05％TWEEN-20；0.9mMMgCl；0.2mM dNTPs；3.3ng/μl上游引物；3.3ng/μl下游引物；0.5单位TaqDNA聚合酶；1μLDNA。PCR反应在PCR仪(ETC811,东胜龙，中国)进行。PCR反应条件：94℃2min；94℃45s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃8min；10℃10min。PCR反应结束后，加入5μl加样缓冲液，混匀后取2μl产物在浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据产物片段大小，控制电泳时间，电泳结束后采用银染显色。

5.田间试验和表型鉴定

所有NIL群体种植于中国水稻研究所试验基地(浙江省富阳区)，试验采用随机区组设计，各株系种1行12株，株距16.7cm，行距26.7cm，设2个重复，常规田间管理。

成熟后，除去保护株，在各株系中取5个正常单株混收，晒干后脱粒。各株系取约35g种子，经3.5mol/L的NaCl溶液浸泡，除去空粒和瘪粒，剩余种子用小网袋收集后放入37℃烘箱，16h后取出至室温放置4h。将饱粒平均分成2份，采用SC-G型种子分析仪(万深)测定千粒重、粒长、粒宽和长宽比。2份种子的测量误差超过2.0％，则该株系重新挑选饱粒后测量。

6.数据分析

各分离群体中，珍汕97型和密阳46型株系间的表型差异采用方差分析进行比较，分析过程应用SAS软件的GLM程序。当不同基因型株系间存在显著差异时(P<0.05)，计算加性效应(A)和贡献率(R²)。

QTL定位区间界定：首先，分析各个分离群体中不同亲本纯合型株系间的表型差异是否显著，如存在显著性差异，则表明QTL在该群体所包含的分离区间内分离，反之亦然；然后，比较各分离群体所包含的分离区间，最终界定QTL区间。

7.精细定位结果

首先，应用4个BC₂F_12:13 NIL群体，发明人将qTGW1.2b所在区间缩小至371.5kb。数据分析结果如表2所示：L1群体中，千粒重在两种亲本型株系中无显著差异，粒长和粒宽均呈显著差异，但是增效等位基因来自不同亲本；其余3个群体中，千粒重和粒长均表现出显著差异，且增效等位基因均来自父本密阳46，说明该区间可能存在2个控制粒重和粒形的QTL。如图2A所示，L1和L4的分离区间不交叠，因此，L1群体的分离区间存在1个控制粒形的QTL，而qTGW1.2b位于L2、L3和L4的共有区间，即RM11781-Wn34526区间。

接着，发明人在区间RM11781-Wn34526之间新增3个InDel标记，分别为Wn34529、Wn34286和Wn34367，将qTGW1.2b所在区间进一步缩小至标记Wn34259-Wn34367之间约108.6kb(图2B)。

然后，发明人又应用3个BC₂F_14:15 NIL将qTGW1.2b精细定位至44.0kb。数据分析结果如表2所示：在3个群体中，千粒重在不同亲本型株系间存在显著差异，加性效应的范围为0.12-0.18g,贡献率的范围为5.96％-7.86％，增效等位基因来自密阳46。粒长和千粒重一样，在3个群体中均表现出极显著差异，加性效应的范围为0.021-0.036mm，贡献率的范围为17.49％-32.70％，明显大于千粒重的贡献率。如图2C所示，qTGW1.2b应位于3个群体的共有区间，即Wn34323-Wn34367之间约44.0kb。由于该QTL以控制粒长为主，且位于第1染色体34.3Mb处，将其更名为qGL1-34.3。

表2：2套近等基因系群体的QTL分析结果

TGW：千粒重(g)；GL：粒长(mm)；GW：粒宽(mm)

8.候选基因分析

参考日本晴基因组注释(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，在qGL1-34.3所在的44.0kb区间内，共包含6个注释基因(图2D，表3)。其中LOC_Os01g59370、LOC_Os01g59390、LOC_Os01g59400和LOC_Os01g59420为功能未知的表达蛋白，LOC_Os01g59360和LOC_Os01g59410为功能已知的蛋白。发明人对这2个已注释功能的基因进行序列分析。

表3：目标区间内的6个注释基因

根据日本晴基因组序列设计引物，具体信息如下：

(1)LOC_Os01g59360的基因组序列由2对引物扩增后拼接：

第一对引物：

上游引物：5'-CCGTACACCACCCGACGAA-3'，

下游引物：5'-GGGGAAACAAAATCACAGACCCT-3'；

第二对引物：

上游引物：5'-TCATGAACAGGCTCAAGCAG-3'，

下游引物：5'-GCTGACATCAACACGATACCTT-3'。

(2)扩增LOC_Os01g59410的引物信息为：

上游引物：5'-CCCAAGTCCCACAGCGAAC-3'，

下游引物：5'-TCCGTCCACAGTACCATACACA-3'。

以珍汕97和密阳46的DNA为模板，扩增这2个注释基因。扩增产物经浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，参考分子量标记估计扩增片段大小，符合预期后将扩增产物送杭州擎科梓熙生物技术公司测序。序列比对结果显示：LOC_Os01g59360在珍汕97和密阳46编码区无序列差异；LOC_Os01g59410在珍汕97和密阳46编码区检测到3处SNP和1处***缺失，以珍汕97序列为参照，3处SNP分别为G259A、A306C和C528T，其中G259A导致氨基酸发生变化，第86位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸，其余2处SNP为同义突变；另外，密阳46在第468位碱基处***GAC，导致编码区***1个天冬氨酸。因此，LOC_Os01g59410最有可能是qGL1-34.3的候选基因。

参考文献：Wang L-L,Chen Y-Y,Guo L,Zhang H-W,Fan Y-Y,Zhuang J-Y.Dissection of qTGW1.2 to three QTLs for grain weight and grain size in rice(Oryza sativa L.)

实施例2应用CRISPR/Cas9基因编辑技术验证候选基因功能并创建新的等位变异

1.敲除载体构建和遗传转化

针对LOC_Os01g59410，发明人共构建2个敲除载体，以粳稻品种日本晴为受体进行遗传转化。CRISPR/Cas9基因编辑载体骨架BGK03购买于百格基因科技有限公司，具体实施步骤如下：

(1)sgRNA靶点序列选择。打开CRISPRdirect数据库(crispr.dbcls.jp)，输入全基因组序列，根据所提供的靶点序列在基因组的位置、特异性、GC含量等指标，在LOC_Os01g59410基因组中挑选2个靶点，分别命名为410-1和410-2。

410-1的序列为：5'-GGGCAATGCTACTGCAACGA-3'；

410-2的序列为：5'-AATGCTACTGCAACGAGGGG-3'。

(2)Oligo序列设计。根据所选基因编辑载体骨架和二聚体连入载体方式设计Oligo引物序列，本发明载体骨架BGK03购买于百格基因科技有限公司，只需将靶点序列输入至百格公司提供的在线工具(http://www.open-genome.cn/index/excrispr)，自动生成2对Oligo引物。

410-1对应的Oligo引物信息为：

上游引物5'-TGTGTGGGGCAATGCTACTGCAACGA-3'，

下游引物5'-AAACTCGTTGCAGTAGCATTGCCCCA-3'；

410-2的Oligo引物信息为：

上游引物5'-TGTGTGAATGCTACTGCAACGAGGGG-3'，

下游引物5'-AAACCCCCTCGTTGCAGTAGCATTCA-3'。

(3)Oligo二聚体合成。将Oligo引物稀释至10μM，分别取1μl上下游Oligo引物、18μl Buffer Aneal至200μl无菌离心管，移液枪吹打混匀。合成过程在PCR仪进行，95℃3min后，以每秒降0.2℃的速率降至20℃。

(4)Oligo二聚体连接至BGK03载体。取1μl Oligo二聚体，2μl CRISPR/cas VectorBGK03，1μl Enzyme Mix，用ddH₂O补足10μl，在冰上用移液枪吹打混匀后，20℃放置1h。将2个敲除载体分别命名为BGK03-410-1和BGK03-410-2。

(5)从-80℃超低温冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上化冻，吸取5μl待转化质粒载体溶液至感受态细胞溶液中，枪头搅拌混匀后，冰浴30min。

(6)将混合液转移至42℃水浴，30sec后置于冰上，放置2min。

(7)在混合液中加入500μl LB培养基，枪头搅拌混匀后置于37℃摇床，200r/min持续1h。

(8)将菌液均匀涂布在含有卡那霉素的LB培养基上，经37℃干燥后，倒置于37℃培养箱避光培养。

(9)挑取单克隆菌落，以其为模板进行PCR反应，鉴定阳性克隆。

(10)吸取1ml含卡那霉素的培养基至1.5mL灭菌离心管，用移液枪枪头挑取阳性单克隆菌落，置于离心管中，37℃条件下180r/min持续5h。

(11)将菌液送杭州擎科梓熙生物技术公司进行测序验证，对比无误后，分别在编号为BGK03-410-1和BGK03-410-2的菌液中吸取500μl至新的1.5ml灭菌离心管，并加入等体积浓度为50％的甘油，混匀后置于-80℃冰箱保存，剩余的2份菌液委托武汉伯远生物科技有限公司进行遗传转化实验。

2.转基因苗鉴定

(1)收到T₀代转基因苗后，来源于相同愈伤组织的转基因苗取约2cm叶片，提取DNA。

(2)用潮霉素抗性基因标记进行潮霉素抗性基因检测，筛选转基因阳性植株。

(3)PCR扩增包含靶点序列的片段，进行测序分析，引物序列为：

上游引物5'-TGGTGGTGGTGGTGGTGT-3'，

下游引物5'-CCTTGATCGGCTTCTTCCC-3'。

(4)共获得4株转基因阳性苗，其中，TB1和TB2在靶点410-1处有1个碱基(A)的***突变，TB3和TB4在靶点410-2处有1个碱基(T)的***突变，均导致移码突变。突变序列与日本晴的比对结果如下：

靶点410-1：

日本晴:GGGCAATGCTACTGCAA CGAGGGGTGG

TB1:GGGCAATGCTACTGCAAaCGAGGGGTGG

TB2:GGGCAATGCTACTGCAAaCGAGGGGTGG

靶点410-2：

日本晴:GGGCAATGCTACTGCAACGAG GGGTGG

TB3:GGGCAATGCTACTGCAACGAGtGGGTGG

TB4:GGGCAATGCTACTGCAACGAGtGGGTGG

3.功能验证及新等位变异创建

将野生型日本晴、T₁代TB1、TB2、TB3和TB4种植于中国水稻研究所试验基地(浙江省富阳区)。所有材料种植60株，设2个重复，播种时间为5月17日，移栽为6月10日。成熟后，每个重复取10株，对千粒重、粒长和粒宽进行考查。如表4所示：TB1、TB2、TB3和TB4的粒长和粒重均极显著小于野生型日本晴，说明LOC_Os01g59410就是qGL1-34.3控制粒长的基因。

另外，我们发现NIL之间的粒长差异(图3)远小于野生型与敲除突变体之间的差异(图4)，该结果说明在微效基因qGL1-34.3座位上，我们创造出了具有较大效应的等位变异。

所以，本发明提供的这种通过克隆微效基因创建新等位变异的方法是可行的，它有助于拓宽栽培稻的遗传变异，为水稻品种改良提供技术基础。

表4千粒重、粒长和粒宽在敲除突变株系与日本晴之间的差异比较

TGW：千粒重(g)；GL：粒长(mm)；GW：粒宽(mm)

大写字母和小写字母的显著性水平分别为P<0.01和P<0.05，相同字母代表组间无显著差异。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 811

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

tacgccacat ccatccgtgg cttccgtccc ccgagtttac tactgctcca cgacgccccg 60

ctcccatcca cacccgcaac cacctcgctc gctaaaaatc cccacgattt gtcctcacat 120

ggccacgccc agaacggccg gaactagccc tcgctctcgt cgtcctactc cagattgccg 180

ctgctcgacg gagccagatc gtcggtaggg aggaggagga ggaggaggtg gtggtggtgg 240

tggtggtgtg ggggtgatgg atcggcagag gcagcagagc tccaggggca atgctactgc 300

aacgaggggt ggtgggtcgt cggggaaggg tggtggtggt ggtgtcggga aggcggcggg 360

gaagaagccg atcaaggtgg tgtacatctc caaccccatg cgggtcaaga ccagcgccgc 420

cgggttccgc gccctcgtgc aggagctcac cggccgcaac gccgaccctt ccaagtacag 480

cccccgcgcc tccgccgacg acgacgacgg cggcggcggc ggcggcggcg gcgagctggc 540

cgccgccagt gacggcgcgg gagagcccgg gcccggcgcc gccgcggcct cgcccgacac 600

cggcgccgca gccgccagcg acgccgccga cgccctcgtg gcggcgggtc atccggcggc 660

ggcgacgttc gacgacgaag gcggcggtgg cggcggggga tactacgacg acgacgacga 720

cgacatcttc aggtcgcagc tgctggacac cagctactcg gtgttctcgc cgccgacgct 780

gctctacgac cacccgcaca gcaaggtgta g 811

<210> 2

<211> 555

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggatcggc agaggcagca gagctccagg ggcaatgcta ctgcaacgag gggtggtggg 60

tcgtcgggga agggtggtgg tggtggtgtc gggaaggcgg cggggaagaa gccgatcaag 120

gtggtgtaca tctccaaccc catgcgggtc aagaccagcg ccgccgggtt ccgcgccctc 180

gtgcaggagc tcaccggccg caacgccgac ccttccaagt acagcccccg cgcctccgcc 240

gacgacgacg acggcggcgg cggcggcggc ggcggcgagc tggccgccgc cagtgacggc 300

gcgggagagc ccgggcccgg cgccgccgcg gcctcgcccg acaccggcgc cgcagccgcc 360

agcgacgccg ccgacgccct cgtggcggcg ggtcatccgg cggcggcgac gttcgacgac 420

gaaggcggcg gtggcggcgg gggatactac gacgacgacg acgacgacat cttcaggtcg 480

cagctgctgg acaccagcta ctcggtgttc tcgccgccga cgctgctcta cgaccacccg 540

cacagcaagg tgtag 555

<210> 3

<211> 184

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Asp Arg Gln Arg Gln Gln Ser Ser Arg Gly Asn Ala Thr Ala Thr

1 5 10 15

Arg Gly Gly Gly Ser Ser Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Lys

20 25 30

Ala Ala Gly Lys Lys Pro Ile Lys Val Val Tyr Ile Ser Asn Pro Met

35 40 45

Arg Val Lys Thr Ser Ala Ala Gly Phe Arg Ala Leu Val Gln Glu Leu

50 55 60

Thr Gly Arg Asn Ala Asp Pro Ser Lys Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Ala

65 70 75 80

Asp Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Gly Glu Pro Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ser

100 105 110

Pro Asp Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Val

115 120 125

Ala Ala Gly His Pro Ala Ala Ala Thr Phe Asp Asp Glu Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ile Phe Arg Ser

145 150 155 160

Gln Leu Leu Asp Thr Ser Tyr Ser Val Phe Ser Pro Pro Thr Leu Leu

165 170 175

Tyr Asp His Pro His Ser Lys Val

180

<210> 4

<211> 814

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

tacgccacat ccatccgtgg cttccgtccc ccgagtttac tactgctcca cgacgccccg 60

ctcccatcca cacccgcaac cacctcgctc gctaaaaatc cccacgattt gtccttacat 120

ggccacgccc agaacggccg gaactagccc tcgctctcgt cgtcctactc cagattgccg 180

ctgctcgacg gagccagatc gtcggtaggg aggaggagga ggaggtggtg gtggtggtgg 240

tggtggtgtg ggggtgatgg atcggcagag gcagcagagc tccaggggca atgctactgc 300

aacgaggggt ggtgggtcgt cggggaaggg tggtggtggt ggtgtcggga aggcggcggg 360

gaagaagccg atcaaggtgg tgtacatctc caaccccatg cgggtcaaga ccagcgccgc 420

cgggttccgc gccctcgtgc aggagctcac cggccgcaac gccgaccctt ccaagtacag 480

cccccgcgcc tccgccgacg acgacgacgg cggcagcggc ggcggcggcg gcgagctggc 540

cgccgccagt gacggcgcgg gcgagcccgg gcccggcgcc gccgcggcct cgcccgacac 600

cggcgccgca gccgccagcg acgccgccga cgccctcgtg gcggcgggtc atccggcggc 660

ggcgacgttc gacgacgaag gcggcggtgg cggcggggga tactacgacg acgacgacga 720

cgacgacatc ttcaggtcgc agctgctgga caccagctac tcggtgttct cgccgccgac 780

gctgctttac gaccacccgc acagcaaggt gtag 814

<210> 5

<211> 558

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

atggatcggc agaggcagca gagctccagg ggcaatgcta ctgcaacgag gggtggtggg 60

tcgtcgggga agggtggtgg tggtggtgtc gggaaggcgg cggggaagaa gccgatcaag 120

gtggtgtaca tctccaaccc catgcgggtc aagaccagcg ccgccgggtt ccgcgccctc 180

gtgcaggagc tcaccggccg caacgccgac ccttccaagt acagcccccg cgcctccgcc 240

gacgacgacg acggcggcag cggcggcggc ggcggcgagc tggccgccgc cagtgacggc 300

gcgggcgagc ccgggcccgg cgccgccgcg gcctcgcccg acaccggcgc cgcagccgcc 360

agcgacgccg ccgacgccct cgtggcggcg ggtcatccgg cggcggcgac gttcgacgac 420

gaaggcggcg gtggcggcgg gggatactac gacgacgacg acgacgacga catcttcagg 480

tcgcagctgc tggacaccag ctactcggtg ttctcgccgc cgacgctgct ttacgaccac 540

ccgcacagca aggtgtag 558

<210> 7

<211> 185

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

Met Asp Arg Gln Arg Gln Gln Ser Ser Arg Gly Asn Ala Thr Ala Thr

1 5 10 15

Arg Gly Gly Gly Ser Ser Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Lys

20 25 30

Ala Ala Gly Lys Lys Pro Ile Lys Val Val Tyr Ile Ser Asn Pro Met

35 40 45

Arg Val Lys Thr Ser Ala Ala Gly Phe Arg Ala Leu Val Gln Glu Leu

50 55 60

Thr Gly Arg Asn Ala Asp Pro Ser Lys Tyr Ser Pro Arg Ala Ser Ala

65 70 75 80

Asp Asp Asp Asp Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Glu Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Ala Gly Glu Pro Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ser

100 105 110

Pro Asp Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Val

115 120 125

Ala Ala Gly His Pro Ala Ala Ala Thr Phe Asp Asp Glu Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Tyr Tyr Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ile Phe Arg

145 150 155 160

Ser Gln Leu Leu Asp Thr Ser Tyr Ser Val Phe Ser Pro Pro Thr Leu

165 170 175

Leu Tyr Asp His Pro His Ser Lys Val

180 185