阅读说明：本技术 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法 (Double-signal amplification AuNPs-DNA walker based on hairpin structure transformation and preparation method thereof ) 是由 陈宪 许珂 于 2020-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供的是基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法,通过发卡结构的变换,引发AuNPs-DNA步行器的渐进与行走,实现信号的一次放大；并且置换出的DNA链又能够再次将靶标置换出来,参与下一个循环,实现信号的进一步放大。通过该检测策略,能够实现对靶标信号的双重放大。通过该检测策略,能够实现对靶标信号的双重放大,极大地提高了检测的灵敏度；该体系的放大策略都是基于发卡结构的转换,传感器的检测体系比较简单,易于操作。(The invention provides a dual signal amplification AuNPs-DNA walker based on hairpin structure transformation and a preparation method thereof, wherein the transformation of the hairpin structure triggers the progression and walking of the AuNPs-DNA walker to realize the one-time amplification of signals; and the displaced DNA chain can displace the target again to participate in the next cycle, so that the further amplification of the signal is realized. By means of the detection strategy, double amplification of the target signal can be achieved. By the detection strategy, the target signal can be amplified doubly, so that the detection sensitivity is greatly improved; the amplification strategy of the system is based on the conversion of the hairpin structure, and the detection system of the sensor is simpler and easy to operate.)

基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法。

背景技术

近年来，基于金属纳米颗粒，尤其是基于金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）的方法已经被广泛用于构建DNA功能化的生物传感器。构建DNA功能化的AuNPs生物传感器的方式多种多样。为了提高灵敏度，可以在AuNPs表面构建三维DNA轨道以及AuNPs-DNA步行器（DNA Walker），通过目标或外在条件的驱动，由AuNPs-DNA步行器来实现信号的放大与目标检测。驱动这种三维轨道运动的动力主要有辅助DNAzymes切割底物的金属离子、核酸杂交、ATP和光活化等。这些DNA Walker纳米机器采用了不同的驱动方式，都能够在生物传感中实现信号放大。但是，这些纳米机器对目标的信号只是单次放大，只能有限地提高灵敏度。并且往往需要外加不同的酶或辅助探针才能实现信号放大，检测体系往往也比较复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法，用于胞内mRNA检测及成像。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明基于发卡结构的转换，设计了一种新型的AuNPs-DNA步行器。通过发卡结构的变换，引发AuNPs-DNA步行器的渐进与行走，实现信号的一次放大；并且置换出的DNA链又能够再次将靶标置换出来，参与下一个循环，实现信号的进一步放大。通过该检测策略，能够实现对靶标信号的双重放大。此外该双重放大的检测体系比较简单。

所述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器，包括AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA序列，Cu²⁺。

所述AuNPs-DNA步行器，包括：AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B。

所述的靶标mRNA序列、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B，其序列分别是：

靶标mRNA序列：5'- AAGTATGCCAAAGACACTCGC -3'；

步行链DNA链W：

5'-HS-(T)₂₀GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG -3'，

轨道链DNA链T：

5'-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS -3'，

封闭链DNA链B：

5'-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT -3'。

上述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备；

（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备；

（3）靶标与AuNPs-DNA步行器反应；

（4）荧光检测。

所述的步骤（1）制备方法如下：首先，将实验室所有用到的玻璃仪器浸泡在王水（新鲜配制，V_HCl:V _HNO3=3:1）中12小时，再用大量的超纯水将玻璃仪器冲洗干净，放置于烘箱中烘干。然后，将50 mL、0.25 mM的氯金酸加入一个洗净并烘干过的圆底烧瓶，高速搅拌下，150 ºC油浴加热沸腾15 min。接着，将1 mL、质量分数1%新鲜配制的柠檬酸三钠快速地加入到沸腾的氯金酸溶液中。继续加热搅拌30 min，使柠檬酸钠反应完全。该过程可观察到溶液颜色逐渐由黄色变为黑色，紫色，最后变为酒红色。最后，移除加热装置，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器下持续搅拌使溶液冷却至室温，之后置于4 ºC冰箱中保存备用。金纳米粒子浓度，根据文献报道的朗姆比尔定律：C=A450/ε450（其中ε450 = 5.41 × 108 M^-1 cm^-1）进行计算。

所述的步骤（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备具体步骤：

（1）向1.5 mL的离心管中加入80 μL（10 nM）AuNPs溶液和28 μL的超纯水， 并加入12 μL的1% SDS以提高AuNPs的分散性，室温孵育15 min。

（2）向另一个1.5 mL的离心管中加入4 μL（10 μM）步行链DNA链W、4 μL（100 μM）轨道链DNA链T和46 μL 超纯水混合，并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链，室温孵育15 min。

（3）将上述两个离心管对应的体系混合，再将40 μL（100 mM，10×，pH 7.4）PBS和180 μL超纯水加入到体系中，孵育15 min。之后将400 μL（2 M）NaCl溶液 加入到混合液中，为防纳米金发生聚集，需要一边逐滴加入NaCl溶液，一边剧烈震荡混合液。之后将混合液孵育过夜。用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。最后回溶到400 μL 含有0.01 %吐温-20的1×PBS中。加入1 μL100 μM的MCH，用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点，并室温孵育60 min。之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，去上清液，取沉淀漂洗3次，去除多余的MCH。最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中。向体系中加入100 μL（25mM）MgCl₂，100 μL（500 mM）NaCl，60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水，并加入5 μL（10 μM）封闭链DNA链B混合，以确保步行链DNA链W被完全封闭，然后室温中避光孵育过夜。用含有0.01%吐温-20的1×PBS，12000 rpm， 15 min，去上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。将AuNPs-DNA步行器分为两个部分，一部分回溶到含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞外实验；另一部分回溶到不含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞内实验。置于4 ºC冰箱中保存备用。

所述靶标与AuNPs-DNA步行器反应方法为：将不同浓度的靶标mRNA、终浓度1 nMAuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu²⁺置于0.01%吐温-20的1×PBS中，反应80 min。

构建流程示意图原理图详述：如图1所示，在AuNP表面修饰一定数量的DNA链T和DNA链W。其中DNA链T（track）作为轨道链，其靠近AuNP表面的5’末端修饰了荧光基团Cy5，因此Cy5能够被AuNP高效淬灭。DNA链W（walker）作为步行链，用DNA链B（block）封闭。DNA链W与DNA链T部分序列杂交形成活性的Cu2+依赖性DNAzyme结构。当向AuNPs - DNA步行器中加入靶标mRNA（TK1）时，DNA链B的末端与靶标结合，DNA链B的发卡结构翻转（虚线框部分），进而被置换出来，生成DNA链B*。DNA链B离开DNA链W之后，DNA链W与DNA链T部分序列杂交，从而形成对Cu²⁺敏感的DNAzyme结构。在Cu²⁺存在的条件下，该结构的作用位点被切割。DNA链T中含有Cy5的DNA链R（release）被释放，因此Cy5的荧光恢复。与此同时，DNA链R能够与置换下来的DNA链B*再次杂交，置换出mRNA（TK1）。靶标mRNA继续参与下一个循环。一方面靶标结合DNA链B，DNA链B发卡结构翻转使得DNA链W沿着特定的轨道（DNA链T）逐步切割、释放DNA链R。这实现了对靶标的放大；另一方面释放的DNA链R能够与DNA链B*杂交，进而置换出mRNA（TK1）参与下一个循环。这实现对靶标的进一步放大。如此沿着特定的轨道逐步切割，释放，置换，循环。从而实现对mRNA的荧光信号双重放大检测。

本发明的优点在于：

（1）通过该检测策略，能够实现对靶标信号的双重放大，极大地提高了检测的灵敏度。

（2）该体系的放大策略都是基于发卡结构的转换，传感器的检测体系比较简单，易于操作。

附图说明

图1为本发明的构建流程示意图。

图2为实施例1中不同浓度目标物的荧光图。

图3为实施例2中不同目标物的荧光选择性图。

图4为本方法胞内肿瘤细胞和正常细胞TK1成像的结果，其中：MCF-7细胞中显示的强红色荧光信号，MCF-10A细胞显示微弱的荧光信号。

具体实施方式

所述基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器，包括AuNPs-DNA步行器、靶标mRNA（TK1）序列，Cu²⁺。

所述AuNPs-DNA步行器，包括：AuNPs、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B。

所述的靶标mRNA（TK1）序列、步行链DNA链W、轨道链DNA链T、封闭链DNA链B，其序列分别是：

靶标mRNA（TK1）序列：5'- AAGTATGCCAAAGACACTCGC -3'；

步行链DNA链W：5'-HS-(T)20GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAACGTCAAGG -3'，

轨道链DNA链T：

5'-Cy5AAGTATGCCAAAGACACTCGCTTTTTCTTTCTAATACGGCTTACCTATCGGCATACTTTTTT-HS -3'，

封闭链DNA链B：

5'-AAAGCGAGTGTCTTTGGCATAAAAAGTCAAGGAAGTATGCCAAAGATTTCCTTGACGTTCTTTCT -3'。

实施例1

一种检测不同浓度靶标mRNA（TK1）的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备

（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备

（3）不同浓度靶标mRNA（TK1）与AuNPs-DNA步行器反应。

（4）荧光检测。

步骤（1）的具体方法为：首先，将实验室所有用到的玻璃仪器浸泡在王水（新鲜配制，V_HCl:V _HNO3=3:1）中12小时，再用大量的超纯水将玻璃仪器冲洗干净，放置于烘箱中烘干。然后，将50 mL、0.25 mM的氯金酸加入一个洗净并烘干过的圆底烧瓶，高速搅拌下，150℃油浴加热沸腾15 min。接着，将1 mL、质量分数1%新鲜配制的柠檬酸三钠快速地加入到沸腾的氯金酸溶液中。继续加热搅拌30 min，使柠檬酸钠反应完全。该过程可观察到溶液颜色逐渐由黄色变为黑色，紫色，最后变为酒红色。最后，移除加热装置，将圆底烧瓶置于磁力搅拌器下持续搅拌使溶液冷却至室温，之后置于4 ℃冰箱中保存备用。金纳米粒子浓度，根据文献报道的朗姆比尔定律：C=A450/ε450（其中ε450 = 5.41×10⁸ M^-1 cm^-1）进行计算。

步骤（2）的具体方法为：向1.5 mL的离心管中加入80 μL（10 nM）AuNPs溶液和28 μL的超纯水， 并加入12 μL的1% SDS以提高AuNPs的分散性，室温孵育15 min。向另一个1.5mL的离心管中加入4 μL（10 μM）DNA链W、4 μL（100 μM）DNA链T和46 μL 超纯水混合，并加入6 μL 50mM TCEP以活化DNA链，室温孵育15 min。将上述两个离心管对应的体系混合，再将40 μL（100 mM，10×，pH 7.4）PBS和180 μL超纯水加入到体系中，孵育15 min。之后将400 μL（2 M）NaCl溶液加入到混合液中，为防纳米金发生聚集，需要一边逐滴加入NaCl溶液，一边剧烈震荡混合液。之后将混合液孵育过夜。用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。最后回溶到400 μL 含有0.01%吐温-20的1×PBS中。加入1 μL 100 μM的MCH，用于封闭金纳米粒子表面上的非特异性结合位点，并室温孵育60 min。之后再用含有0.01 %吐温-20的1×PBS，12000 rpm离心15min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除多余的MCH。最后回溶到400 μL不含0.01 %吐温-20的1×PBS中。向体系中加入100 μL（25 mM）MgCl₂，100 μL（500 mM）NaCl，60 μL 10×PBS和335 μL 超纯水，并加入5 μL（10 μM）DNA链B以确保DNA链W被完全封闭，然后室温中避光孵育过夜。用含有0.01%吐温-20的1×PBS，12000 rpm，15 min，吸弃上清液，取沉淀漂洗3次，去除未结合的核酸链。获得AuNPs-DNA步行器，将AuNPs-DNA步行器分为两个部分，一部分回溶到含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞外实验；另一部分回溶到不含0.01 %吐温-20的1×PBS，应用于胞内实验。置于4℃冰箱中保存备用。

步骤（3）的具体方法为：将一系列不同浓度（0、 0.02 nM、0.05 nM、0.1 nM、0.2nM、0.5 nM、1 nM、2 nm、5 nm、10 nM、20 nM、100 nM）的靶标mRNA（TK1）、终浓度1 nM的AuNPs-DNA步行器以及终浓度0.5 μM Cu²⁺置于0.01 %吐温-20的1×PBS中，反应80 min。

步骤（4）的具体方法为：将反应后的混合液用滴管转移至荧光比色皿中，用荧光仪检测。Cy5激发波长640 nm、发射波长664 nm。作对应的荧光光谱，所有实验至少重复三次。

读取荧光信号变化，测定结果如图2所示。随着目标浓度的增加，Cy5的荧光信号增加，该方法的检测下限为49.5 pM。

实施例2

一种检测靶标mRNA（TK1）的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备

（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备

（3）不同靶标mRNA（TK1）与AuNPs-DNA步行器反应。

（4）荧光检测。

步骤（1）、（2）、（4）同实施例1。

所述的步骤（3）的反应过程的主要步骤如下：分别将10 nM的靶标mRNA（TK1）、三个干扰靶标（c-myc，survivin和c-raf-1）以及空白样品加入到含有1 nM的AuNPs-DNA步行器以及0.5 μM的Cu²⁺置于0.01 %吐温-20的1×PBS中，反应80 min。干扰靶标c-myc序列：5'-CCTCAACGTTAGCTTCACCAA -3'。干扰靶标survivin序列：5'- CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG -3'。干扰靶标c-raf-1序列：5'- AATGCATGTCACAGGCGGGA -3'

读取荧光信号变化，每组数据平行测定三次，测定结果如图3所示。与空白样品的荧光信号值相比，当只有干扰靶标存在的时候，检测结果无明显变化。而对靶标mRNA（TK1）进行检测的时候，可以获得显著增加的荧光信号值。这些结果证明AuNPs-DNA步行器能够特异性地识别靶标，展现了其良好的选择性。

实施例3

一种胞内靶标mRNA（TK1）成像的双重信号放大AuNPs-DNA步行器的制备方法，包括以下步骤：

（1）金纳米粒子（AuNPs）的制备

（2）DNA功能化的金纳米粒子（AuNPs-DNA步行器）的制备

（3）细胞与AuNPs-DNA步行器共孵育。

（4）共聚焦成像。

步骤（1）、（2）同实施例1。

所述的步骤（3）的反应过程的主要步骤如下：将MCF-7细胞和MCF-10A细胞分别接种于荧光板上，使得每个荧光板的细胞数目约为4×10⁴，用1640培养液（含1640培养基、10%FBS、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素）培养，然后将荧光板置于含有5% CO₂和95%空气的37 ℃恒温培养箱中孵育。24 h后。弃去旧的培养液，将细胞与5 μM的Cu ²⁺（10 μL）在新的培养液（90 μL）中于37 ℃、5％CO₂条件下孵育60 min，然后加入新的培养液（90 μL）和10 nMAuNPs-DNA步行器（10 μL），继续孵育4小时后，弃去旧的培养液，用PBS洗涤3次，加入1 mL饥饿液（无血清培养基）。

所述的步骤（4）的反应过程的主要步骤如下：使用荧光共聚焦显微镜在40×的物镜下，对荧光板进行共聚焦成像。

测定结果如图4所示。从MCF-7细胞中观察到了Cy5的强红色荧光信号，而MCF-10A细胞在相同条件下均显示出微弱的荧光信号。这表明该AuNPs-DNA步行器可用于定性分析不同细胞中的TK1表达水平，区别肿瘤细胞和正常细胞。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 基于发卡结构变换的双重信号放大AuNPs-DNA步行器及制备方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tttttttttt tttttttttt ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaacgtcaa 60

gg 62

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagtatgcca aagacactcg ctttttcttt ctaatacggc ttacctatcg gcatactttt 60

tt 62

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<212> DNA

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