阅读说明：本技术 一种小麦穗分枝基因dna序列扩增方法、分枝基因及应用 (Wheat ear branch gene DNA sequence amplification method, branch gene and application ) 是由 蔡华 赵荣 赵维萍 于 2020-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法、分枝基因及应用,以分枝小麦、未分枝小麦、中国春、小白芒四个品种的小麦叶片为试验材料,采用同源克隆的方法,在四种小麦中分别扩增出tb1基因全长。而对四种小麦tb1基因分析得知,该基因编码区全长1059bp,共编码352个氨基酸,通过验证确为分枝基因,该基因参与了小麦穗分枝的调控。本发明为培育出更多优良的小麦品种,丰富育种资源,进而培育出具有优良的农艺性状、高产抗倒伏的作物新品种提供基础,同时为作物分子遗传育种和性状改良、种质创新提供较好的科学基础。(The invention discloses a method for amplifying a DNA sequence of a wheat ear branch gene, a branch gene and application thereof, wherein the full length of a tb1 gene is amplified in four kinds of wheat respectively by taking wheat leaves of four kinds of wheat, namely branched wheat, non-branched wheat, Chinese spring and awn as test materials and adopting a homologous cloning method. The analysis of four wheat tb1 genes shows that the total length of the coding region of the gene is 1059bp, 352 amino acids are coded, the gene is confirmed to be a branched gene by verification, and the gene participates in the regulation and control of wheat ear branching. The method provides a foundation for cultivating more excellent wheat varieties and enriching breeding resources, further cultivating new crop varieties with excellent agronomic characters and high yield and lodging resistance, and simultaneously provides a better scientific foundation for molecular genetic breeding, character improvement and germplasm innovation of crops.)

一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法、分枝基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法、分枝基因及应用。

背景技术

目前为止，小麦是世界上绝大多数地区种植比较广泛的一类粮食作物，为全人类提供大部分的能量消耗基础，因此提高小麦的产量，是稳定全球经济的基础，同样也是国民经济持续健康发展的重要目标。小麦的产量与小麦的结实部位息息相关。研究表明，小麦产量构成的三要素中，小麦穗数起着主要作用，因此对于小麦穗形态发育的研究，不仅有利于人们对小麦穗发育的理论认识，还有利于小麦的丰产育种。

小麦穗在小麦发育和分枝性状的形成中起到了重要的作用。穗分枝小麦通过主穗轴节上形成枝穗轴来增加小麦的穗粒数，穗大粒多从而提高小麦的产量。有关控制小麦穗分枝性状的基因目前尚无明确的定位。克隆出控制小麦分枝的相关基因并将其定位，不仅可以弄清控制小麦分枝发育的理论基础，还可以应用于小麦的高产育种。

穗分枝小麦的穗分枝在其发育和形成过程中，可能有涉及到关于小麦穗部侧枝的形成和发育，而探讨调控小麦侧枝形成的关键基因的调控机制，对分枝小麦控制穗分枝的基因进行定位研究及克隆分析具有十分重要的理论意义和实际意义，对进一步了解穗分枝小麦的分枝穗形成至关重要，同时也为众多小麦育种学者打开一扇通往绿色革命道路的大门。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法及应用，对分枝小麦控制穗分枝的基因进行定位研究及克隆分析，为培育出更多优良的小麦品种，丰富育种资源，进而培育出具有优良的农艺性状、高产抗倒伏的作物新品种提供基础，为作物分子的遗传育种和性状改良、种质创新提供较好的科学基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法，包括以下步骤：

(1)取多种不同品种的小麦进行基因组DNA及总RNA提取，根据GenBank已公开的禾本科植物中bd1基因与tb1基因，设计基因特异性引物；

(2)根据已提取的基因组DNA和cDNA为模板，采用bd1基因和tb1分枝基因引物进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增结果克隆测序，将测序结果进行同源性比对或根据已扩增出的分支基因为模板设计基因特异性引物进行RT-PCR反应，电泳检测后测序，分析步骤(2)中PCR扩增所得到基因是否为小麦穗分枝基因。

优选的是，步骤(1)中多种不同品种的小麦至少包括分枝小麦、未分枝小麦、中国春、小白芒。

上述任一方案中优选的是，步骤(1)中禾本科植物为玉米，根据玉米中bd1基因GenBank:AY178191.1与tb1基因GenBank：U94494.1，利用Primer 5.0软件在两端UTR区设计一对基因特异性引物。

上述任一方案中优选的是，所设计基因特异性引物序列见序列表中的SEQ NO.1-SEQ NO.4所示。

上述任一方案中优选的是，所设计基因特异性引物序列信息为

上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，PCR扩增时已提取的基因组DNA和cDNA为模板，bd1基因和tb1分枝基因引物，配制10uL PCR体系：1uL模板，上下游引物各0.5uL，5uLTrans 2×EasySuperMix，补加ddH₂O至10uL体系。

上述任一方案中优选的是，步骤(3)之后还包括步骤(4)，即在得到分枝基因全长之后对其最大开放阅读框进行分析，由此得出基因序列所对应的氨基酸序列，并对该氨基酸序列进行分析，得出其在进化过程之中的保守区。利用NCBI和DNAMAN软件构建其系统进化树，分析小麦中分枝基因在物种进化过程中与其他植物之间亲缘关系的远近。

本发明还提供基于小麦穗分枝基因cDNA序列全长设计的特异性PCR引物组合物，引物序列为序列表中SEQ NO.5至SEQ NO.6所示的序列。SEQ NO.5所述引物序列为TB1-F2：5’-AGGACGGCTCCAGCAGCCTCT-3’，SEQ NO.6所述引物序列为TB1-R2：5’-GTGCGGGAGTAGTTCTAATACCGT-3’，交由上海英俊生物有限公司合成。

本发明还提供分枝小麦、未分枝小麦、中国春、小白芒四种小麦的tb1基因DNA序列全长，序列号分别为KU847345、KU847346、KU847347、KU847348，基因序列见序列表中的SEQNO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO.10所示。

本发明还提供上述小麦穗分枝基因DNA序列所编码的氨基酸。

本发明还提供上述小麦穗分枝基因DNA序列在筛选小麦穗分枝分子育种、分析小麦分枝基因在物种进化过程中与其他植物之间亲缘关系的远近上的应用。

本发明还提供上述小麦穗分枝基因在制备分支基因小麦上的应用。

有益效果

分枝基因是调控小麦穗部性状发生分枝突变的关键基因。为研究小麦分枝基因的功能及其对小麦穗分枝的作用机制，本申请以分枝小麦、未分枝小麦、中国春、小白芒四个品种的小麦叶片为试验材料，采用同源克隆的方法，在四种小麦中分别扩增出bd1分枝基因片段和tb1基因全长。分析可知bd1基因与试验预期结果不符，而对四种小麦tb1基因分析得知，该基因编码区全长1059bp，共编码352个氨基酸，通过验证确为分枝基因，该基因参与了小麦穗分枝的调控。

本发明提供一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法及应用，对分枝小麦控制穗分枝的基因进行定位研究及克隆分析，为培育出更多优良的小麦品种，丰富育种资源，进而培育出具有优良的农艺性状、高产抗倒伏的作物新品种提供基础，为作物分子的遗传育种和性状改良、种质创新提供较好的科学基础。

附图说明

图1为四种不同品种的小麦穗形比较，1为分枝小麦；2为未分枝小麦；3为中国春；4为小白芒；

图2为提取的小麦基因组DNA及总RNA凝胶电泳检测结果；

图3为特异性引物扩增结果，M为2000bp Marker；1为分枝小麦；2为未分枝小麦；3为中国春小麦；4为小白芒；

图4为小麦穗分枝基因(片段)序列比对图；

图5为tb1基因特异性引物在cDNA及DNA中扩增结果，M为2000bp Marker；1为分枝小麦；2为未分枝小麦；3为中国春小麦；4为小白芒；

图6为四种小麦穗分枝tb1基因序列比对图；

图7为不同植物TB1同源蛋白的分子进化树图；

图8为分枝小麦tb1基因cDNA全长序列及编码氨基酸序列，其中标注的ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，方框内依次为该氨基酸序列的SP区、TCP区以及R区。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

实施例1

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法:详细方法如下：1材料

(1.1)试验材料

普通小麦品种“中国春”、“小白芒”，均选自中国小麦微核心种质；“分枝麦”、“未分枝麦”为“郑麦9023”的大穗形突变体、“分枝小麦”为“郑麦9023”的分枝穗突变体，试验材料均种植于滁州学院花山小麦试验基地。每年四月初分别采取四个小麦品种刚抽穗时的幼嫩叶片和幼嫩穗部组织，四种小麦穗形比较如图1所示，提取各品种叶片DNA和穗部组织总RNA，并将提取的基因组DNA和总RNA分别保存于﹣20℃和﹣80℃环境中。

(1.2)试验试剂

DNA和RNA提取：RNAiso Plus，反转录试剂，C₂H₅OH，EasyPure Plant Genomic DNAKit试剂盒；引物，Trans 2×Easy

SuperMix，灭菌超纯水；琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、Marker，核酸染液；胶回收试剂盒等。

(1.3)试验仪器

冷冻高速离心机(安徽嘉文)，超低温冰箱(赛默飞)，洁净操作台(苏州)，微量移液枪及大中小枪头，PCR反应仪，凝胶电泳紫外分析仪，金属浴，手掌低速离心机，分析天平，高压蒸汽灭菌锅等。

2试验方法

(2.1)基因组DNA及总RNA提取

参考Transgene公司生产的EasyPure Plant Genomic DNA Kit试剂盒说明书操作，取四种不同品种小麦幼嫩叶片于事先高温灭菌后的研钵中，加入液氮后快速研磨至粉末状，将粉末转移到灭菌冷冻后的1.5mL离心管中，按试剂盒操作步骤进行基因组DNA提取，提取的DNA样品保存于﹣20℃冰箱中备用。

基因组总RNA的提取参照TaKaRa公司生产的RNA提取裂解液提取步骤进行，提取的四种小麦穗部组织基因组总RNA保存于﹣80℃冰箱中备用。提取的分枝小麦、未分枝小麦、中国春、小白芒小麦的叶片基因组DNA和穗部组织总RNA，进行凝胶电泳检测，结果如图2所示。

(2.2)基因组总RNA的反转录

根据天根生物有限公司生产的反转录试剂盒操作步骤，进行操作：在已灭菌的PCR管中依次加入5ug基因组总RNA，2μL oligo(dT)Primer(50pmol/L)引物，用RNase-freeWater补齐至14.5μL；70℃条件下加热5min，反应结束后立即冰上冷却后离心30s。在冰上依次加入4uL 5×First-Strand Buffer(含DTT)，0.5uL RNasin，1uL(200U)TRANScript M-MLV，用移液枪混匀，25℃反应10min。42℃反应50min；95℃反应5min终止反应。将产物稀释10倍后，用内参基因检测反转录质量，进行后续PCR扩增试验。

(2.3)分枝基因特异引物设计

查阅相关文献得知玉米中的bd1基因与tb1基因都属于调控玉米分枝的一类关键基因，对玉米分枝的形成也起着重要的调控作用。目前对该基因的克隆主要集中在禾本科植物中，有关小麦bd1基因与tb1同源基因的克隆尚无研究。因此根据玉米中bd1基因(GenBank:AY178191.1)与tb1基因(GenBank：U94494.1)的保守性，利用Primer 5.0软件在两端UTR区设计一对基因特异性引物，通过长片段PCR扩增其整个编码区。所设计引物序列信息如下表1，所有引物均交由上海英俊生物科技公司合成。

表1引物名称及序列

Table 1 the name and sequence of the primer

(2.4)目的基因PCR扩增

根据已提取的基因组DNA和cDNA为模板，bd1基因和tb1分枝基因引物，配制10uLPCR体系：1uL模板，上下游引物各0.5uL，5uL Trans 2×Easy

SuperMix，补加ddH₂O至10uL体系。以bd1基因为引物的一组PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min共35个循环；72℃10min；以tb1基因为引物的一组PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min共35循环；72℃10min结束反应。(2.4.1)小麦bd1基因特异性引物PCR扩增

BD-R1，BD-F1作为特异性引物，分别以模板DNA和cDNA进行PCR扩增，结果在以cDNA为模版的体系中未检测到结果，表明bd1基因在小麦抽穗期的穗部组织中不表达。DNA中扩增结果如图3所示；将扩增得到的目的条带进行纯化后送到上海生工生物有限公司进行测序，得到一段248bp的序列。

bd1基因扩增序列比对分析

NCBI中blast比对结果显示此四段序列与小麦染色体3B染色体上一段序列(GenBank：HG670306.1)的同源度最高为94％，DNAMAN比对发现，分枝小麦中扩增出的序列与未分枝小麦种扩增出的序列存在差异，如图4所示，比对序列依次为分枝小麦、未分枝小麦和玉米bd1序列，比对结果同源度为56.55％。从穗分枝bd1基因的248bp比较结果看，不符合试验预期结果。

(2.4.2)小麦tb1基因特异性引物PCR扩增

以TB1-R1，TB1-F1为一对基因特异性引物，分别以cDNA和DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳检测结果如下图5所示；根据所扩增的电泳结果可知在以DNA和以cDNA为模板时所扩增长度均为1000bp左右，将所扩增得到的目的条带进行TA克隆，并送样至上海华津生物有限公司测序测序。分别在分枝小麦、未分枝小麦、中国春以及小白芒中得到1199bp、1165bp、1186bp、1191bp的cDNA序列以及1119bp、1122bp、1124bp、1115bp的DNA序列。

小麦tb1基因序列比对分析

经过PCR反应——送样测序——结果比对分析，四种小麦中tb1基因的DNA测序长度分别是1119bp、1122bp、1124bp、1115bp、经DNAMAN序列比对后发现相似性为88.64％。比对结果如下图6所示：其中，WF为未分枝小麦、FZ为分枝小麦、CS为中国春、BM为小白芒，*为相同序列。经NCBI进行blast比对之后发现其与禾本科黑麦草tb1基因相似度达83％，与水稻中tb1基因相似性高达80％，与玉米tb1基因相似度为70％，则可基本确定所扩增的基因为小麦中的tb1基因。将此四条序列提交NCBI注册，获得分枝小麦、未分枝小麦、中国春、小白芒四种小麦的tb1基因序列的序列号分别为KU847345、KU847346、KU847347、KU847348且分枝小麦与未分枝小麦之间存在个别碱基差异，由此可以推测出tb1基因可能是导致小麦穗分枝的关键基因，由于分枝基因的个别碱基发生突变而使得原本表现分枝性状的小麦突变为不分枝的性状。

(2.5)tb1基因与其他禾本科植物TB1同源基因的系统进化关系

为进一步明确tb1基因的功能，了解它与其他禾本科植物TB1同源基因的系统进化关系，我们根据分枝基因在NCBI中比对情况，选择了水稻(GenBank：AY286002.1)、非洲粟(GenBank：AY631857.1)、早竹(GenBank：DQ842223.1)、黑麦草(GenBank：GU987123.1)、玉米(GenBank：U94494.1)等几种禾本科植物TB1蛋白序列与所扩增得到四种小麦的TB1蛋白质序列进行比对分析，比对结果表明他们的保守区内的氨基酸序列基本一致，总体相似度为67.7％，且分为三个保守进化区，分别为SP区、TCP区、R区，都属于禾本科TCP家族转录因子。

不同植物TB1同源蛋白的分子进化树分析，如图7所示。其中分枝小麦tb1基因cDNA全长序列及编码氨基酸序列如图8所示，四种小麦的tb1基因的氨基酸序列在NCBI中blastp进行氨基酸序列比对，结果显示四种小麦的tb1基因编码的氨基酸序列与小麦中TCP结构域蛋白的序列相似度最高达87％，与TCP转录因子蛋白和TB1蛋白质序列相似度分别为87％和86％。根据相关文献表述，禾本科植物玉米与水稻之中的tb1基因具有一些共同的调控元件，如TCP转录因子。由此可知，在四种小麦之中扩增出的序列确为tb1基因，且与玉米和水稻等禾本科植物同属一个蛋白质家族，参与小麦穗部发生分枝性状的过程中起调控作用。(2.5.1)PCR扩增结果克隆测序

将PCR扩增之后的产物进行切胶纯化并将纯化之后的样品送样到生工生物(上海)有限公司进行测序。

(2.5.2)测序结果的生物信息学分析

利用DNAMAN软件的Alignment多重序列比对将测序结果进行同源性比对，并在NCBI上进行BLAST分析，分析PCR扩增所得到基因是否为小麦穗分枝基因。在得到分枝基因全长之后对其最大开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)进行分析，由此导出基因序列所对应的氨基酸序列，并对该氨基酸序列进行分析，得出其在进化过程之中的保守区。利用NCBI和DNAMAN软件构建其系统进化树，分析小麦中分枝基因在物种进化过程中与其他植物之间亲缘关系的远近。

根据已扩增出的分枝小麦中tb1基因为模板设计一对基因特异性引物进行RT-PCR反应，经电泳检测后纯化送样测序，测序结果表明在不同品种小麦中扩增出573bp cDNA片段，通过测序——序列比对分析表明所扩增cDNA片段确为tb1基因。研究调控小麦穗部性状发生分枝的关键基因，对于今后利用分子育种的手段来精准提高小麦的产量和优良品种都具有重要的意义。本申请克隆出调控小麦穗部发生分枝的关键基因，初步分析该分枝基因的表达调控情况，了解分枝基因的作用机制，为育种工作者提供基本信息。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 滁州学院

<120> 一种小麦穗分枝基因DNA序列扩增方法、分枝基因及应用

<130>001

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 1

gcggcgtgcg tgtagacgaa gt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 2

gcggcaggaa cgaccagacc at 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 3

ggagtcccat cagtaaagc 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 4

gtgcgggagt agttctaata ccgt 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 5

aggacggctc cagcagcctc t 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 6

gtgcgggagt agttctaata ccgt 24

<210> 7

<211> 1097

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 7

tttgattcgc tagaccatgg acttgcccct ttaccaacag ctgcagatca gccctccctc 60

gccaaaggcg ccggatcacc aatccttgct ctactatcat tcctcccctg catttgccgc 120

cgacgccttc caccacagct acctctgtgc cggtgccgcg acgccgcccc ctgccgagat 180

cgacatccac ccgccgccgg agctgcagct gatggtgatg gatccggctc cggcgccaaa 240

gggagatgga actgcaaccg gcctgcgcct gggtggaggc ctaggcctcg acagcgccgc 300

cgccgccacg aaaaacaaac accgcaacat atgcatatgc ggcgggatga gggacaggcg 360

gatgcggatg tccctctacc tcgacctcaa cttcttcttc ttccaggaca tggacatgct 420

cgacttcgac aaggccaccg tgaaatggct ccggctcccc tctaaggccg ccgtcgccat 480

cgtcaaggtt gtgactgagt cctcctcctg cgactgcgac gactacggct ccctctccct 540

ctccgacggc aaccgcaagc agccaccgac agagactgaa gctgatgatg gtgatcaggc 600

aagaagaaaa agccagtgcc aacggcaacg gcaacggccc ccccaaaccg cagccgaaat 660

tgacattggc ccacgcgatc cccatccccg actcgaggac gaggacccgg gcgcgggaga 720

gggagaggga gcggactaag aaccagatgc ggatgctgac gctgacgctc gcgtctacca 780

ttaacatcgg cagccaccgc catgggcatg gcgagggcga ggcgagtacg actcgatccc 840

gaagcctttg atttttctct cctcgtcctc gtccatgtcc acagctgaat ctgaattggg 900

aggtgctcgt gctcgtcgtc cgatgcgaag cgatcatgat ctgtgctctc ggctacggca 960

ggtgtacgga tagcagaagg caacggacta ctactactca gcatggagct agcagcggca 1020

tgtcgagcct caggtggtgt ttacgttctc ccaactcccc tactccataa ctgcagaaga 1080

cgtcgacttg cgtatgt 1097

<210> 8

<211> 1116

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 8

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cgccaaaggc gccggatcac caatccttgc tctactatca ttcctcccct gcatttgccg 120

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tcgacatcga ccacccgccg gagctggagc tgatgctgat ggatccggct ccggggccaa 240

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<210> 9

<211> 1114

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 9

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<210> 10

<211> 1076

<212> DNA

<213> Triticum durum

<400> 10

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