阅读说明：本技术 自组装诊断阵列平台 (Self-assembling diagnostic array platform ) 是由 R·博汉农 M·斯图尔特 D·罗布森 E·法雷尔 L·亨德森 N·麦克欧文 S·博汉农 于 2018-12-19 设计创作，主要内容包括：本公开文本涉及用于使用通用阵列平台检测样品中的核酸或抗原的方法和试剂盒。例如,可以通过以下方式检测核酸：使用引物对扩增来自样品的核酸的至少一部分,所述引物对包括第一引物和第二引物,所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列,所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分的第一链杂交,所述第二引物包含第二寡核苷酸序列,所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分的第二链杂交；使存在时的所述扩增子与各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列接触；将胶体检测试剂施加至所述固体支持物；用洗涤溶液洗涤所述固体支持物；以及检测所述胶体检测试剂。本公开文本进一步涉及特异性捕获寡核苷酸序列和系链寡核苷酸序列。(The present disclosure relates to methods and kits for detecting nucleic acids or antigens in a sample using a universal array platform. For example, nucleic acids can be detected by: amplifying at least a portion of a nucleic acid from a sample using a primer pair, the primer pair comprising a first primer and a second primer, the first primer comprising a label and a first oligonucleotide sequence, the first oligonucleotide sequence hybridizing to a first strand of the portion of the nucleic acid, the second primer comprising a second oligonucleotide sequence, the second oligonucleotide sequence hybridizing to a second strand of the portion of the nucleic acid; contacting the amplicons, when present, with a plurality of single-stranded oligonucleotide capture sequences, each attached to a solid support; applying a colloidal detection reagent to the solid support; washing the solid support with a wash solution; and detecting the colloidal detection reagent. The disclosure further relates to specific capture oligonucleotide sequences and tethering oligonucleotide sequences.)

自组装诊断阵列平台

相关申请的交叉引用

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技术领域

本公开本文涉及用于使用通用阵列平台检测样品中的核酸、抗原、或两者的方法和试剂盒，并且涉及用于扩增核酸的设备、和扩增核酸的方法，所述设备和方法包括至少三个恒定温度区。

发明背景

微阵列技术已经适于广泛的核酸、蛋白质和其他抗原的检测，特别是在核酸测试(NAT)领域中的检测。现有的微阵列形式需要在活化的载玻片上印刷针对靶标的不同捕获试剂(例如，抗体或单链寡核苷酸)(通常是一式两份或一式三份)，以及对照斑点。当测试样品中是否存在目的抗原时，使样品与阵列反应，由此捕获靶标，洗掉样品，使用经标记的抗体检测捕获的靶标，并且使用扩增/检测方法使反应可视化，并且使用读取器记录。该多步骤过程花费时间，并且当测试多种面板时，印刷许多不同的捕获斑点的成本大大增加。此外，必须制造所创建的每个阵列并针对每个靶标组和每种靶标类型(例如，抗体、抗原、核酸等)进行质量检查，从而需要多种阵列类型的制造和库存，这迫使成本升高。

通过将捕获配体附接到固体表面上来创建微阵列。随着更精确地点样越来越小的斑点的能力逐渐增加，这些微阵列可以检测数个靶标至数百万个靶标，这取决于密度、斑点大小等。在正常阵列上，每个斑点或一系列斑点均含有与靶标互补的捕获寡核苷酸、和抗原(由此样品中的抗体结合所附着的靶标)，或者将抗体印刷(附着)在阵列上以结合样品中的靶标，随后对所述靶标进行标记和检测，但是一些阵列也利用未标记的靶标。由于每个斑点是不同的物质并且潜在地需要数百种、数千种或甚至数百万种不同的捕获配体来产生单一阵列，因此这些阵列的创建对于生产而言变得非常麻烦且昂贵。

检测人临床样品中的传染性病原体、生物标记、毒素和细胞对于无病输血和移植以及多种诊断目的至关重要。然而，如上所述，制造用于不同药剂、生物标记、多核苷酸、抗原等的不同微阵列载玻片的时间和成本可能会成为阻碍。存在对于如下微阵列平台技术的需求，所述微阵列平台技术允许在降低相关的制造成本的同时稳健且准确地检测样品中的多种核酸或抗原。

发明内容

为了满足这些和其他需求，本文描述了微阵列平台技术的“通用阵列”方法。此类“微阵列”包括能够进行多重检测的任何平台，包括但不限于平面微阵列、条、线、珠、和孔阵列。使用该方法，可以例如用寡核苷酸斑点的阵列印刷单一类型的阵列，每个寡核苷酸斑点都缀合到固体支持物(例如，经由间隔子试剂如牛血清白蛋白BSA)。该通用阵列可以适于通过以下方式检测样品中的多种核酸：使用具有衔接子寡核苷酸序列的引物进行扩增，所述衔接子寡核苷酸序列允许所得PCR产物与点样在所述阵列上的寡核苷酸序列杂交。目的核酸序列的每个引物对可以含有这些独特的衔接子序列之一，从而允许每个扩增子与所述阵列上的不同斑点杂交。以这种方式，共同的或“通用”微阵列载玻片可以适于检测多种不同的核酸。此外，所述通用阵列方法还可以使用缀合至衔接子寡核苷酸序列的特异性抗体而适用于抗原(如多肽)，所述衔接子寡核苷酸序列与点样在所述阵列上的相应寡核苷酸序列杂交。因此，由于可以产生单一微阵列并使其适于多种不同的核酸或抗原检测测定，因此使制造成本显著最小化。

因此，本公开文本的某些方面提供了用于检测样品中的核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)在以下条件下使用引物对扩增来自样品的核酸的至少一部分，所述条件适合于扩增包含存在于所述样品中时的所述核酸的所述部分的扩增子，其中所述引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分的第一链杂交，和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交；b)在步骤(a)之后，使存在时的所述扩增子与各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列接触，并且其中存在时的所述扩增子经由所述第三寡核苷酸序列或所述第三寡核苷酸序列的互补体与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种在其固体支持物上杂交；c)在步骤(a)之后，将胶体检测试剂施加至所述固体支持物，其中所述胶体检测试剂包含与存在时的所述扩增子的所述标记结合的第一部分和包括胶体金属的第二部分；d)在(c)之后，用洗涤溶液洗涤所述固体支持物；以及e)在步骤(a)-(d)之后，检测所述胶体检测试剂，其中在所述固体支持物上检测到所述胶体检测试剂指示所述经杂交的扩增子的存在，从而检测出所述样品中的所述核酸。在一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列、多重珠阵列或孔阵列。在一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。在一些实施方案中，在步骤(e)中检测所述胶体检测试剂包括检测所述胶体金属。在一些实施方案中，在步骤(e)中检测所述胶体检测试剂包括：1)将显影试剂施加至所述固体支持物，其中所述显影剂适合于在存在所述胶体金属的情况下形成沉淀物；和2)通过检测在固体支持物上所述沉淀物的形成来检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过视觉、电子或磁性检测来检测。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过机械读取器来检测。在一些实施方案中，所述显影试剂包含银。在一些实施方案中，步骤(a)中的所述条件适合于通过聚合酶链反应(PCR)进行的扩增。在一些实施方案中，步骤(a)中的所述条件适合于通过以下方式进行的扩增：重组酶-聚合酶测定(RPA)、基于核酸测序的链测定(NASBA)、滚环扩增、支链扩增、连接扩增、或环介导的等温扩增。在一些实施方案中，所述标记包括生物素，并且所述第三寡核苷酸序列与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种杂交。在一些实施方案中，每种单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至相应的固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后用洗涤溶液洗涤所述固体支持物。在一些实施方案中，所述第一引物是在所述核酸的有义方向上扩增的正向引物，并且所述第二引物是在所述核酸的反义方向上扩增的反向引物。在一些实施方案中，所述第二引物是在所述核酸的有义方向上扩增的正向引物，并且所述第一引物是在所述核酸的反义方向上扩增的反向引物。在一些实施方案中，所述第二引物包含：所述第二寡核苷酸序列，其中所述第二寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸；和所述第三寡核苷酸序列，其中所述第三寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5’至3’方向上。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，所述第二引物进一步包含在所述第三寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，在步骤(a)中使用相对于所述第二引物过量的所述第一引物扩增所述核酸的所述部分，并且其中存在时的所述扩增子是单链核酸，所述单链核酸在步骤(b)中经由所述第三寡核苷酸序列的互补体与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种杂交。在一些实施方案中，在步骤(a)中使用约12.5:1与约100:1之间的第一引物与所述第二引物的比率扩增所述核酸的所述部分。在一些实施方案中，所述第一引物的所述标记包括生物素。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包括特异性结合生物素的中性亲和素、链霉亲和素、或抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包括中性亲和素，并且其中所述胶体检测试剂的所述第二部分包括胶体金离子。在一些实施方案中，在步骤(c)中将所述胶体检测试剂以0.00001OD至20OD的最终稀释度施加至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包含中性亲和素，其中所述胶体检测试剂的所述第二部分包括胶体金离子，并且其中在步骤(c)中将所述胶体检测试剂以0.05OD至0.2OD的最终稀释度施加至所述固体支持物。在一些实施方案中，在步骤(c)中将1pL至1000μL的胶体检测试剂施加至每μL扩增子中的所述固体支持物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前使所述样品暴露于裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.1％且小于或等于10％的N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.5％且小于或等于4％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于1％且小于或等于2％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，将所述样品以1:50样品:裂解缓冲液与50:1样品:裂解缓冲液之间的比率暴露于所述裂解缓冲液。在一些实施方案中，将所述样品的所述部分以约1:1样品:裂解缓冲液的比率暴露于所述裂解缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液进一步包含0.1X至5X磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液或Tris EDTA(TE)缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液进一步包含1X PBS。在一些实施方案中，在步骤(b)中将所述扩增子在杂交缓冲液中与所述固体支持物杂交，所述杂交缓冲液包含0.1X至10X盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液、0.001％至30％封闭剂、和0.01％至30％拥挤剂(crowding agent)。在一些实施方案中，所述封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、酪蛋白、或聚乙烯醇(PVA)。在一些实施方案中，所述封闭剂包括BSA，并且所述BSA以1％至3％存在于所述杂交缓冲液中。在一些实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇双酚A环氧氯丙烷共聚物。在一些实施方案中，所述聚乙二醇双酚A环氧氯丙烷共聚物以1％至3％存在于所述杂交缓冲液中。在一些实施方案中，所述杂交缓冲液包含2X至5X SSC缓冲液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前使用包含BSA的溶液封闭所述固体支持物。在一些实施方案中，使用2％BSA溶液将所述固体支持物在37℃下封闭1小时。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在封闭所述固体支持物之后用洗涤溶液洗涤所述固体支持物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前用洗涤缓冲液洗涤所述固体支持物，所述洗涤缓冲液包含0.1X至10X SSC缓冲液和0.01％至30％洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂包含0.05％至5％N-月桂酰肌氨酸钠盐。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲液包含1X至5X SSC缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液、洗涤缓冲液和杂交缓冲液中的一种或多种进一步包含与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种在其固体支持物上杂交的对照寡核苷酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)使所述样品与偶联至固体基底的寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与存在于所述样品中时的所述核酸杂交；(ii)在以下条件下洗涤所述固体基底，所述条件适合于去除与所述固体基底的非特异性相互作用但保留在存在于所述样品中时与所述寡核苷酸杂交的所述核酸；以及(iii)将存在于所述样品中时的所述核酸从所述寡核苷酸洗脱，其中使所述洗脱的核酸进行步骤(a)中的PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)使所述样品与寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与存在于所述样品中时的所述核酸杂交，(ii)与步骤(i)同时或在步骤(i)之后，使所述样品与固体基底接触，其中所述固体基底偶联至第一结合部分，其中所述寡核苷酸偶联至结合所述第一结合部分的第二结合部分，并且其中在适合于所述第二结合部分结合所述第一结合部分的条件下使所述样品与所述固体基底接触；(iii)在以下条件下洗涤所述固体基底，所述条件适合于去除与所述固体基底的非特异性相互作用但保留所述寡核苷酸和在存在于所述样品中时与所述寡核苷酸杂交的所述核酸；以及(iv)将存在于所述样品中时的所述核酸从所述寡核苷酸洗脱，其中使所述洗脱的核酸进行步骤(a)中的PCR扩增。在一些实施方案中，所述寡核苷酸经由共价相互作用偶联至所述固体基底。在一些实施方案中，所述寡核苷酸经由亲和素:生物素或链霉亲和素:生物素相互作用偶联至所述固体基底，或者其中所述第一结合部分包括亲和素、中性亲和素、链霉亲和素或其衍生物，并且所述第二结合部分包括生物素或其衍生物。在一些实施方案中，将所述固体基底定位于移液管尖端中，并且其中步骤(i)包括将所述样品吸移至所述移液管尖端中。在一些实施方案中，所述固体基底包括基质或多个珠。在一些实施方案中，所述核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述核酸包括RNA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前在适合于产生由所述核酸合成的cDNA的条件下将所述样品的至少一部分与逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸一起孵育，其中在步骤(a)中使用所述cDNA扩增所述核酸的所述部分。在一些实施方案中，在步骤(a)之前使用的所述引物是随机引物、多聚-dT引物或对所述核酸的所述部分具有特异性的引物。在一些实施方案中，在存在RNase抑制剂的情况下，将所述样品的所述部分与所述逆转录酶、引物和所述脱氧核糖核苷酸一起孵育。在一些实施方案中，在存在甜菜碱的情况下，将所述样品的所述部分与所述逆转录酶、引物和所述脱氧核糖核苷酸一起孵育。在一些实施方案中，所述甜菜碱以约0.2M至约1.5M的浓度存在。在一些实施方案中，所述核酸包括病毒核酸。在一些实施方案中，所述病毒核酸来自选自以下的病毒：HIV、HBV、HCV、西尼罗河病毒、寨卡病毒、和细小病毒。在一些实施方案中，所述核酸包括细菌、古生菌、原生动物、真菌、植物、或动物核酸。

本公开文本的其他方面涉及用于检测样品中的核酸的试剂盒或制品。在一些实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒包含：多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括偶联至标记的第一引物，其中所述第一引物与核酸的第一链杂交；和第二引物，所述第二引物包含：1)第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸并与所述核酸中与所述第一链相对的第二链杂交；2)第二寡核苷酸序列，其中所述第二寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5’至3’方向上；以及3)在所述第一寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，偶联至所述第一引物的所述标记包括生物素。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列，并且其中至少一种单链寡核苷酸序列在其固体支持物上与所述多个引物对中的引物对的第二引物的所述第二寡核苷酸序列杂交。在一些实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒包含：a)各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分的第一链杂交；和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交，其中所述多个引物对中的每个引物对的所述第三寡核苷酸序列与单链寡核苷酸捕获序列在其固体支持物上杂交。在一些实施方案中，所述多个引物对中的每个引物对的所述第二寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸，其中所述多个引物对中的每个引物对的所述第三寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5'至3'方向上，并且其中所述多个引物对中的每个引物对的所述第二引物进一步包含在所述第三寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，所述多个引物对中的每个引物对的所述第三寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，所述单链寡核苷酸捕获序列中的每一种在其支持物上偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。

本公开文本的某些其他方面涉及用于扩增和检测样品中的核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)将所述样品的至少一部分与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和引物对的扩增混合物一起孵育，其中所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的一部分的第一链杂交，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第一捕获部分，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交；b)在适合于扩增包含存在于所述样品中时的所述核酸的所述部分的扩增子的条件下，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过连续毛细管管路通过第一、第二、和第三恒定温度区，以进行多个循环，其中所述多个循环中的每个循环包括：1)使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第一温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第一恒定温度区并持续第一持续时间，所述第一温度和所述第一持续时间适合于使存在于所述样品中时的所述核酸的所述链变性，2)在步骤(b)(1)之后，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第二温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第二恒定温度区并持续第二持续时间，所述第二温度和所述第二持续时间适合于将所述第一引物和所述第二引物退火至存在于所述样品中时的所述核酸的对应链，以及3)在步骤(b)(2)之后，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第三温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第三恒定温度区并持续第三持续时间，所述第三温度和所述第三持续时间适合于经由所述聚合酶和引物对扩增存在于所述样品中时的所述核酸靶标；c)在所述多个循环之后，使存在于所述样品中时的所述扩增子与附着于固体支持物的第一捕获部分缔合；以及d)检测存在于所述样品中时的所述扩增子与所述固体支持物的缔合，其中所述扩增子与所述一个或多个固体支持物的缔合指示在所述样品中所述核酸的存在。在一些实施方案中，所述第一捕获部分包含第三寡核苷酸序列，并且其中所述第二捕获部分包含在步骤(c)中与所述第三寡核苷酸序列或所述第三寡核苷酸序列的互补体杂交的单链寡核苷酸捕获序列。在一些实施方案中，检测存在时的所述扩增子与所述固体支持物的缔合包括：i)将胶体检测试剂施加至所述固体支持物，其中所述胶体检测试剂包含与存在时的所述扩增子的所述标记结合的第一部分和包括胶体金属的第二部分；和ii)检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，在步骤(d)(ii)中检测所述胶体检测试剂包括检测所述胶体金属。在一些实施方案中，在步骤(d)(ii)中检测所述胶体检测试剂包括：a)将显影试剂施加至所述固体支持物，其中所述显影剂适合于在存在所述胶体金属的情况下形成沉淀物；和b)通过检测所述沉淀物在固体支持物处的形成来检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过视觉、电子或磁性检测来检测。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过机械读取器来检测。在一些实施方案中，所述显影试剂包含银。在一些实施方案中，所述标记包括生物素或其衍生物，并且其中所述胶体检测试剂的所述第一部分包括特异性结合生物素的中性亲和素、链霉亲和素、或抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包括中性亲和素，并且其中所述胶体检测试剂的所述第二部分包括胶体金离子。在一些实施方案中，步骤(b)中的所述条件适合于通过聚合酶链反应(PCR)进行的扩增。在一些实施方案中，步骤(b)中的所述条件适合于通过以下方式进行的扩增：重组酶-聚合酶测定(RPA)、基于核酸测序的链测定(NASBA)、滚环扩增、支链扩增、连接扩增、或环介导的等温扩增。在一些实施方案中，使用蠕动泵、高效液相色谱(HPLC)泵、精密注射泵、或真空装置使与所述PCR扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前：使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约20℃与约55℃之间的预热区。在一些实施方案中，所述预热区在约37℃与约42℃之间。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述预热区，持续长达30分钟。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述预热区，持续约15分钟。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前：使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约80℃与约100℃之间的活化区。在一些实施方案中，所述活化区在约90℃与约95℃之间。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述活化区，持续长达20分钟。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述活化区，持续在约5分钟与约10分钟之间。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前：使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约55℃与约72℃之间的延伸区。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前：i)将第二样品的至少一部分与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和第二引物对的扩增混合物混合，其中所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物包含标记和第四寡核苷酸序列，所述第四寡核苷酸序列与第二核酸的一部分的第一链杂交，所述第四引物包含第五寡核苷酸序列和第三捕获部分，所述第五寡核苷酸序列与所述第二核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交；ii)在适合于扩增存在于所述样品中时的所述第二核酸的所述部分的条件下，使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述连续毛细管管路通过所述第一、第二、和第三恒定温度区，以进行第二多个循环，其中所述第二多个循环中的每个循环包括：1)使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分在所述第一温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第一恒定温度区并持续所述第一持续时间，所述第一温度和所述第一持续时间适合于使存在于所述第二样品中时的所述第二核酸的所述链变性，2)在步骤(ii)(1)之后，使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分在所述第二温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第二恒定温度区并持续所述第二持续时间，所述第二温度和所述第二持续时间适合于将所述第三引物和所述第四引物退火至存在于所述第二样品中时的所述第二核酸的对应链，以及3)在步骤(ii)(2)之后，使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分在所述第三温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第三恒定温度区并持续所述第三持续时间，以适合于经由所述聚合酶和第二引物对扩增存在于所述第二样品中时的所述第二核酸；其中存在于所述第二样品中时的所述第二核酸同时与存在于所述第一样品中时的所述扩增的第一核酸靶标、与第四捕获部分缔合，所述第四捕获部分与所述第三捕获部分缔合，其中所述第四捕获部分偶联至固体支持物；并且其中存在于所述第二样品中时的所述扩增的第二核酸与所述固体支持物的缔合与存在于所述第一样品中时的所述扩增的第一核酸的杂交同时进行检测，并且其中所述扩增的第二核酸靶标与所述固体支持物的缔合指示在所述第二样品中所述第二核酸靶标的存在。在一些实施方案中，所述第一样品和所述第二样品是相同的。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸是不同的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使与所述扩增混合物混合的所述第一样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述多个循环之后，并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使足够量的空气通过所述连续毛细管管路，以将与所述扩增混合物混合的所述第一样品的所述部分和与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分分隔开。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述量的空气通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使包含浓度在约0.1％与约10％之间的次氯酸钠的溶液通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述溶液包含浓度为约1.6％的次氯酸钠。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述漂白剂溶液通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使包含浓度在约5mM与约500mM之间的硫代硫酸盐的溶液通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述溶液包含浓度为约20mM的硫代硫酸盐。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述硫代硫酸盐溶液通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使水通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使水通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述PCR扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使足够量的空气通过所述连续毛细管管路，以将水和与所述PCR扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分分隔开。在一些实施方案中，步骤(a)包括将所述样品的所述部分***所述连续毛细管管路中并且使用机械臂或阀系统将所述样品的所述部分与所述扩增混合物混合。在一些实施方案中，所述核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述核酸包括RNA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：在适合于产生由所述RNA合成的cDNA的条件下将所述样品的至少一部分与逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸一起孵育，其中在步骤(a)中将所述cDNA与所述扩增混合物混合。在一些实施方案中，在步骤(a)之前使用的所述引物是随机引物、多聚-dT引物或对所述RNA的所述部分具有特异性的引物。在一些实施方案中，在经由所述连续毛细管管路通过在约37℃与约42℃之间的cDNA合成区的同时，将所述样品的所述部分与所述逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸一起孵育，持续足以产生由所述RNA合成的cDNA的时间。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使与所述逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸混合的所述样品的所述部分通过所述cDNA合成区之后并且在步骤(b)之前：使与所述逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约95℃下的活化区。在一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约80℃与约100℃之间的所述第一恒定温度区，持续1秒至约10分钟。在一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约45℃与约65℃之间的所述第二恒定温度区，持续2秒至约60秒。在一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约57℃与约74℃之间的所述第三恒定温度区，持续3秒至约60秒。在一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述PCR扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约45℃与约80℃之间的所述第二恒定温度区和所述第三恒定温度区两者，持续在约0.5秒与约5分钟之间。在一些实施方案中，所述多个循环包括大于或等于2个循环且小于或等于100个循环。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前将所述样品的所述部分与裂解缓冲液一起孵育，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.1％且小于或等于10％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，在步骤(a)中将所述样品进一步与甜菜碱混合。在一些实施方案中，在步骤(a)中将所述样品进一步与荧光或着色染料混合。在一些实施方案中，所述第二引物包含：所述第二寡核苷酸序列，其中所述第二寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸；和所述第三寡核苷酸序列，其中所述第三寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5’至3’方向上。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，所述第二引物进一步包含在所述第三寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，所述第一捕获部分附着于间隔子试剂，并且其中所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。在一些实施方案中，所述样品包括全血、血清、唾液、尿液、粪便、组织、或环境样品。在一些实施方案中，所述核酸包括病毒核酸。在一些实施方案中，所述病毒核酸来自选自以下的病毒：HIV、HBV、HCV、西尼罗河病毒、寨卡病毒、和细小病毒。在一些实施方案中，所述核酸包括细菌、古生菌、原生动物、真菌、植物、或动物核酸。

本公开文本的某些其他方面涉及用于扩增来自样品的核酸的设备。在一些实施方案中，所述设备包括：毛细管管路，所述毛细管管路围绕支持物以多个回路布置，其中所述多个回路中的每个回路包括第一、第二、和第三恒定温度区，并且其中所述毛细管管路在所述第一恒定温度区中加热至第一温度，在所述第二恒定温度区中加热至第二温度，并且在所述第三恒定温度区中加热至第三温度；机械臂，所述机械臂被配置为将与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和引物对的扩增混合物混合的包含核酸的样品引入所述毛细管管路中；以及泵或真空装置，所述泵或真空装置被配置为使与所述扩增混合物混合的所述包含核酸的样品通过所述毛细管管路内的所述多个回路。在一些实施方案中，所述设备进一步包括一个或多个处理器、存储器、一个或多个程序，其中所述一个或多个程序被存储在所述存储器中并且被配置为由所述一个或多个处理器执行，所述一个或多个程序包括用于控制所述第一、第二、和第三恒定温度区的温度的指令。在一些实施方案中，所述设备进一步包括用于cDNA合成区的保温箱，其中在所述多个回路的上游将所述毛细管管路加热至在约37℃与约42℃之间。在一些实施方案中，所述设备进一步包括用于活化区的保温箱，其中在所述多个回路的上游将所述毛细管管路加热至约95℃。在一些实施方案中，所述毛细管管路在所述多个回路中的每个回路中形成圆锥形、圆柱形或螺旋形形状。在一些实施方案中，所述毛细管管路包含聚四氟乙烯(PTFE)。在一些实施方案中，所述毛细管管路的多个回路包括约25至约44个回路。在一些实施方案中，所述机械臂包括蠕动泵或HPLC泵，所述蠕动泵或HPLC泵被配置为将与扩增混合物混合的所述包含核酸靶标的样品引入所述毛细管管路中，并且其中所述设备进一步包括第二泵，所述第二泵被配置为将与扩增混合物混合的所述包含核酸靶标的样品拉动通过所述毛细管管路。在一些实施方案中，所述设备进一步包括用于PCR延伸区的保温箱，其中在所述多个回路的下游将所述毛细管管路加热至在约55℃与约72℃之间。在一些实施方案中，被配置为使与所述扩增混合物混合的所述包含核酸的样品通过所述多个回路的真空装置是蠕动泵、高效液相色谱(HPLC)泵、或精密注射泵。

本公开文本的某些其他方面涉及用于检测样品中的抗原的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)提供各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列；b)在步骤(a)之后，使所述固体支持物与特异性地结合抗原的抗原结合结构域接触，其中所述抗原结合结构域偶联至单链寡核苷酸序列，所述单链寡核苷酸序列与所述固体支持物上的所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种杂交，并且其中在适合于所述抗原结合结构域的所述单链寡核苷酸序列与所述固体支持物上的所述至少一种单链寡核苷酸捕获序列杂交的条件下，使所述微阵列与所述抗原结合结构域接触；c)在步骤(a)之后，在适合于所述抗原结合结构域结合存在于所述样品中时的所述抗原的条件下，使所述固体支持物与所述样品的至少一部分接触；d)在步骤(a)之后，将胶体检测试剂施加至所述固体支持物，其中所述胶体检测试剂包含与存在时的所述抗原特异性结合的第一部分和包括胶体金属的第二部分；e)在(d)之后，用洗涤溶液洗涤所述固体支持物；以及f)在步骤(a)-(e)之后，检测所述胶体检测试剂，其中检测到所述胶体检测试剂指示在所述样品中所述抗原的存在。在一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列、多重珠阵列或孔阵列。在一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。在一些实施方案中，在步骤(f)中检测所述胶体检测试剂包括检测所述胶体金属。在一些实施方案中，在步骤(f)中检测所述胶体检测试剂包括：1)将显影试剂施加至所述固体支持物，其中所述显影剂适合于在存在所述胶体金属的情况下形成沉淀物；和2)通过检测所述沉淀物的形成来检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过视觉、电子或磁性检测来检测。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过机械读取器来检测。在一些实施方案中，所述显影试剂包含银。在一些实施方案中，所述第一部分包括与所述抗原特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域偶联至生物素或其衍生物，并且其中所述胶体悬浮体偶联至亲和素、中性亲和素、链霉亲和素或其与生物素结合的衍生物。在一些实施方案中，所述胶体金属是金、铂、钯、或钌。在一些实施方案中，多个斑点中的每个斑点处的所述单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之前使所述样品暴露于裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.1％且小于或等于10％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.5％且小于或等于4％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于1％且小于或等于2％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，将所述样品以1:50样品:裂解缓冲液与50:1样品:裂解缓冲液之间的比率暴露于所述裂解缓冲液。在一些实施方案中，将所述样品的所述部分以约1:1样品:裂解缓冲液的比率暴露于所述裂解缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液进一步包含0.1X至5X磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液或Tris EDTA(TE)缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液进一步包含1X PBS。在一些实施方案中，在步骤(b)中，在存在杂交缓冲液的情况下使所述固体支持物与所述抗原结合结构域接触，所述杂交缓冲液包含0.1X至10X盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液、0.001％至30％封闭剂、和0.01％至30％拥挤剂。在一些实施方案中，所述封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、酪蛋白、或聚乙烯醇(PVA)。在一些实施方案中，所述封闭剂包括BSA，并且所述BSA以1％至3％存在于所述缓冲液中。在一些实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇双酚A环氧氯丙烷共聚物。在一些实施方案中，所述聚乙二醇双酚A环氧氯丙烷共聚物以1％至3％存在于所述杂交缓冲液中。在一些实施方案中，所述缓冲液包含2X至5X SSC缓冲液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)和(c)之前使用包含BSA的溶液封闭所述固体支持物。在一些实施方案中，使用2％BSA溶液将所述固体支持物在37℃下封闭1小时。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在封闭所述固体支持物之后用洗涤溶液洗涤所述固体支持物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)和(c)之后且在步骤(d)之前用洗涤缓冲液洗涤所述固体支持物，所述洗涤缓冲液包含0.1X至10X SSC缓冲液和0.01％至30％洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂包含0.05％至5％N-月桂酰肌氨酸钠盐。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲液包含1X至5X SSC缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液、洗涤缓冲液和杂交缓冲液中的一种或多种进一步包含与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种在其固体支持物上杂交的对照寡核苷酸。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，所述病毒抗原来自选自以下的病毒：HIV、HBV、HCV、西尼罗河病毒、寨卡病毒、和细小病毒。在一些实施方案中，所述抗原是细菌、古生菌、原生动物、真菌、植物、或动物抗原。在一些实施方案中，所述样品包括全血、血清、唾液、尿液、粪便、组织、或环境样品。

本文进一步提供了用于检测样品中的抗原的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含：a)各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多种抗原结合结构域，其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域特异性地结合抗原，并且其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域偶联至与附着于所述固体支持物的单链寡核苷酸序列基本上互补的单链寡核苷酸序列。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含：c)偶联至胶体检测试剂的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域特异性地结合如下抗原，所述抗原也被(b)中的所述多种抗原结合结构域中的抗原结合结构域特异性地结合。

本文进一步提供了各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列，其中每种单链寡核苷酸捕获序列独立地选自SEQ ID NO:1-15。在一些实施方案中，每个固体支持物处的所述单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多种抗原结合结构域，其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域偶联至独立地选自SEQ ID NO:16-30的单链寡核苷酸序列。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与核酸的第一链杂交；和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交，其中每个第一引物的所述第三寡核苷酸序列独立地选自SEQ ID NO:16-30。

本文进一步提供了各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列，其中每种单链寡核苷酸捕获序列独立地选自SEQ ID NO:16-30。在一些实施方案中，每个固体支持物处的所述单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。本文还提供了试剂盒，所述试剂盒包含：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种序列；和b)多种抗原结合结构域，其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域偶联至独立地选自SEQ ID NO:1-15的单链寡核苷酸序列。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒包含：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种序列；和b)多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与核酸的第一链杂交；和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交，其中每个第一引物的所述第三寡核苷酸序列独立地选自SEQ ID NO:1-15。

在上文所述的任何多种序列的一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列、多重珠阵列或孔阵列。在上文所述的任何多种序列的一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。在上文所述的任何试剂盒的一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列、多重珠阵列或孔阵列。在上文所述的任何试剂盒的一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。

应当理解，可以组合本文描述的各实施方案的一个、一些或所有性质以形成本公开文本的其他实施方案。本公开文本的这些和其他方面对于本领域技术人员而言将变得清楚。本公开文本的这些和其他实施方案由随后的

具体实施方式

进一步进行描述。

附图说明

所述专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。

图1A示出了根据一些实施方案的用于抗原检测的通用阵列的图。BSA：牛血清白蛋白。

图1B示出了根据一些实施方案的使用通用阵列对乙型肝炎的生物标记(HBsAg)的检测。

图2A示出了根据一些实施方案的用于在用于核酸测试(NAT)的通用阵列中使用的扩增引物(tC序列：SEQ ID NO:34；HIV靶序列：SEQ ID NO:35)的图。图2B示出了使用图2A中示出的引物扩增靶序列的图。

图2C示出了根据一些实施方案的用于核酸测试(NAT)的通用阵列的图。

图2D和图2E示出了根据一些实施方案的使用用于核酸测试(NAT)的通用阵列检测来自丙型肝炎病毒(HCV)的核酸。示出了使用缺乏HCV核酸的样品(图2D)或含有HCV核酸的样品(图2E)获得的读出。

图3A示出了根据一些实施方案的用于NAT的通用阵列上的15种单独探针。

图3B示出了根据一些实施方案的与用于NAT的通用阵列一起使用的样品制剂中不同Empigen BB浓度的影响。

图3C示出了根据一些实施方案的与用于NAT的通用阵列一起使用的不同杂交缓冲液配制品的影响。所指示的缓冲液配制品表示为x/y/z，其中x是SSC缓冲液的强度(即，“3”指示3X SSC缓冲液)，y是BSA的百分比，并且z是PEG-C的百分比。

图3D示出了根据一些实施方案的不同NaOH浓度对从样品富集目的核酸的洗脱效率的影响。

图3E示出了根据一些实施方案的不同NaOH浓度与用于扩增中的经富集的目的核酸的量的组合的影响。

图3F示出了根据一些实施方案的不同洗脱策略与用于扩增中的经富集的目的核酸的量的组合的影响。

图3G示出了根据一些实施方案的核酸富集方案中不同引物浓度的影响。

图4A示出了根据一些实施方案的在移液管尖端中从样品富集目的核酸。

图4B和图4C示出了根据一些实施方案的经生物素标记的寡核苷酸与经中性亲和素标记的胶体金的比率的影响。所指示的比率是经生物素标记的探针:经中性亲和素标记的胶体金。虚线矩形指示实验结果，并且实心矩形指示经由2步式检测测定检测的BSA-金对照。

图5A示出了根据一些实施方案的连续扩增系统的图。

图5B和图5C示出了根据一些实施方案的连续扩增系统的示例性实施方案。图5B示出了用于获得样品的机械臂、泵系统、任选的预热和活化区、三个恒定温度区、废物收集单元、温度区控制器、和电源。图5C示出了可编程以提供不同温度的三个区、温度控制模块、任选的风扇控制、电源、泵模块、以及任选的预热和活化区。

图6A示出了根据一些实施方案的用于NAT的不对称扩增的图。

图6B示出了根据一些实施方案的用于NAT的不对称扩增中反向引物与正向引物的比率。

具体实施方式

通用技术

本领域技术人员通常熟知并且一般地使用常规方法采用本文描述或引用的技术和程序，所述常规方法是例如描述在以下参考文献中的广泛使用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,纽约；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；Harlow和Lane编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal CellCulture(R.I.Freshney编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction(Mullis等人编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；MonoclonalAntibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford UniversityPress,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,HarwoodAcademic Publishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.Lippincott Company,1993)。

微阵列

本文所述的通用阵列平台可以用于检测多种目的核酸或抗原。

核酸检测

本公开文本的某些方面涉及用于检测样品中的核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)在以下条件下使用引物对扩增来自样品的核酸的至少一部分，所述条件适合于扩增包含存在于所述样品中时的所述核酸的所述部分的扩增子，其中所述引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分的第一链杂交，和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交；b)在步骤(a)之后，使存在时的所述扩增子与各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列接触，并且其中存在时的所述扩增子经由所述第三寡核苷酸序列或所述第三寡核苷酸序列的互补体与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种在其固体支持物上杂交；c)在步骤(a)之后，将胶体检测试剂施加至所述固体支持物，其中所述胶体检测试剂包含与存在时的所述扩增子的所述标记结合的第一部分和包括胶体金属的第二部分；d)在(c)之后，用洗涤溶液洗涤所述固体支持物；以及e)在步骤(a)-(d)之后，检测所述胶体检测试剂，其中在所述固体支持物上检测到所述胶体检测试剂指示所述经杂交的扩增子的存在，从而检测出所述样品中的所述核酸。

通用阵列平台为例如诊断测试提供了一种适应性且通用的方法。例如，将具有已知序列、长为18个碱基的寡核苷酸作为小斑点共价附接至活化的载玻片或其他表面。在结合并阻断过量的结合位点之后，将互补寡核苷酸序列共价附接至抗原，如HIV-1gp41免疫显性区域。如果临床样品(如血液)含有针对HIV-1gp41的抗体并且与用所述互补寡核苷酸标记的HIV gp41肽混合，则所述抗体与gp41肽结合，当将其置于上文所述的微阵列上时，所述互补寡核苷酸与点样在阵列上的其配体配偶体结合。洗掉未结合的物质，并且用生物素标记的抗抗体(即单克隆抗人Ig或蛋白A/G)探测阵列。使用经抗生物素分子(即链霉亲和素)标记的金来标记与gp41结合的抗体，所述gp41由于上文所述的互补寡核苷酸系链而与微阵列上的特异性斑点结合。洗掉多余的物质，然后直接检测经金标记的微斑点，或使用金颗粒以催化银沉积(所述银沉积可以容易地检测到)，从而指示样品中针对gp41的抗HIV抗体的存在/不存在，从而基于样品中存在的可检测量的抗HIV-1gp41抗体提醒用户确定该人是否感染HIV。

重要的是，可以使用相同的寡核苷酸序列来标记不同的捕获试剂，所有捕获试剂全部都将结合阵列上的互补寡核苷酸序列。因此，下一个测定可以用于检测HBV、HCV、毒素、激素、或核酸，它们全部可以与相同斑点结合。捕获试剂将基于其寡核苷酸标记仅与相同斑点结合。因此，一组已知的寡核苷酸可以用于创建通用捕获微阵列，并且同一组互补寡核苷酸可以用于标记任何捕获试剂。例如，16x 16微阵列将具有256个斑点，每个斑点具有相应的寡核苷酸序列。这些寡核苷酸序列可以各自是独特的，或者阵列可以包括用于确认结果的冗余斑点。假设每个斑点都是一式两份的，则能够同时区分128种不同的测定。然后，该阵列可以成为标准的通用平台，并且可以通过简单地用128种不同的互补寡核苷酸序列标记不同的捕获试剂来检测数百万种不同的靶标，所述互补寡核苷酸序列可以作为通用试剂盒提供。另外，同一样品可以与含有不同测试和/或重叠测试的不同检测溶液混合。例如，通过与溶液A混合可以对样品进行感染性疾病筛查，然后通过将样品的另一部分与溶液B混合来进行癌症测试，然后通过将另一部分与溶液C混合来进行毒素测试，然后通过与溶液D混合针对任何目的靶标检测核酸以直接检测核酸或在扩增步骤之后检测核酸。微阵列不会改变—它保持固定—但是可以使用不同的检测溶液来测试许多不同的靶标。这有助于降低制造微阵列的成本，并极大地扩展了其检测几乎任何靶标的效用。下文更详细地描述了通用阵列平台的示例性特征和方面。

如本文所用，除非另有说明，否则核酸和/或寡核苷酸广泛地指核酸的聚合物(例如，DNA或RNA)，并且意在包括单链和双链种类，以及包含一种或多种通常是天然存在的和/或修饰的核苷/核苷酸的种类(例如，锁核酸、肽核酸或PNA等)。

如本文所用，除非另有说明，否则“扩增子”是指本文所述的任何类型的核酸扩增的产物，所述核酸扩增包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、重组酶-聚合酶测定(RPA)、基于核酸测序的链测定(NASBA)、滚环扩增、支链扩增、连接扩增、和环介导的等温扩增。在一些实施方案中，扩增子是双链核酸。在一些实施方案中，扩增子是单链核酸。

如本文所用，术语“固体支持物”是指适合于将生物分子(如核酸)附接其上的任何固体或半固体结构。固体支持物不必是平坦的或单一的结构，并且可以具有任何类型的一种或多种形状，包括球形形状(例如，珠)。固体支持物可以以任何形式布置。在一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列(例如，平坦载玻片)、多重珠阵列或孔阵列。此外，所述固体支持物可以由任何合适的材料制成，所述材料包括但不限于硅、塑料、玻璃、聚合物、陶瓷、光致抗蚀剂、硝化纤维素、和水凝胶。在一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。

纳米颗粒(如胶体金)的胶体悬浮体可以附接至生物探针(如抗体)，可用作在免疫染色中进行快速且灵敏检测的检测试剂。用于制备和使用胶体检测试剂的方法是本领域熟知的(参见例如，Hostetler等人,Langmuir 14:17-30,1998；Wang等人,Langmuir 17(19):5739-41,2001)。所述胶体检测试剂可以是任何材料的。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂包含金属。胶体金属的例子包括但不限于金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、钯(Pd)、铜(Cu)、镍(Ni)、钌(Ru)、及其混合物。在一些实施方案中，在步骤(e)中检测所述胶体检测试剂包括检测(例如，直接检测)所述胶体金属。在一些实施方案中，在步骤(e)中检测所述胶体检测试剂包括：1)将显影试剂施加至所述固体支持物，其中所述显影剂适合于在存在所述胶体金属的情况下形成沉淀物；和2)通过检测在固体支持物上所述沉淀物的形成来检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过视觉、电子或磁性检测来检测。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过机械读取器来检测。在上文所述的一些实施方案中，所述显影试剂包含银。在上文所述的一些实施方案中，使用硝酸银和还原剂(例如对苯二酚)。在上文所述的一些实施方案中，使用照相机(例如，CCD照相机)对胶体染色的结果进行成像。

在一些实施方案中，步骤(a)中的所述条件适合于通过聚合酶链反应(PCR)进行的扩增。在一些实施方案中，步骤(a)中的所述条件适合于通过以下方式进行的扩增：重组酶-聚合酶测定(RPA)、基于核酸测序的链测定(NASBA)、滚环扩增、支链扩增、连接扩增、或环介导的等温扩增。在一些实施方案中，所述标记包括生物素，并且所述第三寡核苷酸序列与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种杂交。

在一些实施方案中，每种单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至相应的固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白(例如，BSA)。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后用洗涤溶液洗涤所述固体支持物。

在一些实施方案中，所述第一引物是在所述核酸的有义方向上扩增的正向引物，并且所述第二引物是在所述核酸的反义方向上扩增的反向引物。在一些实施方案中，所述第二引物是在所述核酸的有义方向上扩增的正向引物，并且所述第一引物是在所述核酸的反义方向上扩增的反向引物。在一些实施方案中，所述第二引物包含：所述第二寡核苷酸序列，其中所述第二寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸；和所述第三寡核苷酸序列，其中所述第三寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5’至3’方向上。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，所述第二引物进一步包含在所述第三寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。

在一些实施方案中，所述第一引物的所述标记包括生物素。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的第一部分包括特异性结合生物素的中性亲和素或其衍生物、链霉亲和素或其衍生物、亲和素或其衍生物、或抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包括中性亲和素，并且其中所述胶体检测试剂的所述第二部分包括胶体金离子。在一些实施方案中，在步骤(c)中将所述胶体检测试剂以0.00001OD至20OD的最终稀释度施加至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包含中性亲和素，其中所述胶体检测试剂的所述第二部分包括胶体金离子，并且其中在步骤(c)中将所述胶体检测试剂以0.05OD至0.2OD的最终稀释度施加至所述固体支持物。可以使用多种量的胶体检测试剂。在一些实施方案中，在步骤(c)中将1pL至1000μL的胶体检测试剂施加至每μL扩增子中的所述固体支持物。在一些实施方案中，在步骤(c)中将100μL的胶体检测试剂施加至每1.5μL扩增子中的所述固体支持物。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前使所述样品暴露于裂解缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.1％且小于或等于10％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.5％且小于或等于4％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液包含大于或等于1％且小于或等于2％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。

在一些实施方案中，将所述样品以1:50样品:裂解缓冲液与50:1样品:裂解缓冲液之间的比率暴露于所述裂解缓冲液。在一些实施方案中，将所述样品的所述部分以约1:1样品:裂解缓冲液的比率暴露于所述裂解缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液进一步包含0.1X至5X磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液或Tris EDTA(TE)缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解缓冲液进一步包含1X PBS。

在一些实施方案中，在存在杂交缓冲液的情况下使扩增子与所述固体支持物杂交。多种杂交缓冲液是本领域已知的。在一些实施方案中，在步骤(b)中将所述扩增子在杂交缓冲液中与所述固体支持物杂交，所述杂交缓冲液包含0.1X至10X盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液、0.001％至30％封闭剂、和0.01％至30％拥挤剂(crowding agent)。在一些实施方案中，所述封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、酪蛋白、或聚乙烯醇(PVA)。在一些实施方案中，所述封闭剂包括BSA，并且所述BSA以1％至3％存在于所述杂交缓冲液中。在一些实施方案中，所述拥挤剂是聚乙二醇双酚A环氧氯丙烷共聚物。在一些实施方案中，所述聚乙二醇双酚A环氧氯丙烷共聚物以1％至3％存在于所述杂交缓冲液中。在一些实施方案中，所述杂交缓冲液包含2X至5X SSC缓冲液。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前封闭所述固体支持物。在一些实施方案中，使用包含BSA的溶液封闭所述固体支持物。在一些实施方案中，使用2％BSA溶液将所述固体支持物在37℃下封闭1小时。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在封闭所述固体支持物之后用洗涤溶液洗涤所述固体支持物。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前用洗涤缓冲液洗涤所述固体支持物。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲液包含0.1X至10X SSC缓冲液和0.01％至30％洗涤剂。在一些实施方案中，所述洗涤剂包含0.05％至5％N-月桂酰肌氨酸钠盐。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲液包含1X至5X SSC缓冲液。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)使所述样品与偶联至固体基底的寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与存在于所述样品中时的所述核酸杂交；(ii)在以下条件下洗涤所述固体基底，所述条件适合于去除与所述固体基底的非特异性相互作用但保留在存在于所述样品中时与所述寡核苷酸杂交的所述核酸；以及(iii)将存在于所述样品中时的所述核酸从所述寡核苷酸洗脱，其中使所述洗脱的核酸进行步骤(a)中的PCR扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)使所述样品与寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与存在于所述样品中时的所述核酸杂交，(ii)与步骤(i)同时或在步骤(i)之后，使所述样品与固体基底接触，其中所述固体基底偶联至第一结合部分，其中所述寡核苷酸偶联至结合所述第一结合部分的第二结合部分，并且其中在适合于所述第二结合部分结合所述第一结合部分的条件下使所述样品与所述固体基底接触；(iii)在以下条件下洗涤所述固体基底，所述条件适合于去除与所述固体基底的非特异性相互作用但保留所述寡核苷酸和在存在于所述样品中时与所述寡核苷酸杂交的所述核酸；以及(iv)将存在于所述样品中时的所述核酸从所述寡核苷酸洗脱，其中使所述洗脱的核酸进行步骤(a)中的PCR扩增。在一些实施方案中，所述寡核苷酸经由共价相互作用偶联至所述固体基底。在一些实施方案中，所述寡核苷酸经由亲和素:生物素或链霉亲和素:生物素相互作用偶联至所述固体基底，或者其中所述第一结合部分包括亲和素、中性亲和素、链霉亲和素或其衍生物，并且所述第二结合部分包括生物素或其衍生物。在一些实施方案中，将所述固体基底定位于移液管尖端中，并且其中步骤(i)包括将所述样品吸移至所述移液管尖端中。在一些实施方案中，所述固体基底包括基质或多个珠。在一些实施方案中，所述核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述核酸包括RNA。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前在适合于产生由所述核酸合成的cDNA的条件下将所述样品的至少一部分与逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸一起孵育，其中在步骤(a)中使用所述cDNA扩增所述核酸的所述部分。在一些实施方案中，在步骤(a)之前使用的所述引物是随机引物、多聚-dT引物或对所述核酸的所述部分具有特异性的引物。在一些实施方案中，在存在RNase抑制剂的情况下，将所述样品的所述部分与所述逆转录酶、引物和所述脱氧核糖核苷酸一起孵育。在一些实施方案中，在存在甜菜碱的情况下，将所述样品的所述部分与所述逆转录酶、引物和所述脱氧核糖核苷酸一起孵育。在一些实施方案中，所述甜菜碱以约0.2M至约1.5M的浓度存在。在一些实施方案中，所述核酸包括病毒核酸。在一些实施方案中，所述病毒核酸来自选自以下的病毒：HIV、HBV、HCV、西尼罗河病毒、寨卡病毒、和细小病毒。在一些实施方案中，所述核酸包括细菌、古生菌、原生动物、真菌、植物、或动物核酸。在一些实施方案中，所述样品包括全血、血清、唾液、尿液、粪便、组织、或环境样品(例如，包括水、土壤等)。

在一些实施方案中，本文所述的任何试剂(例如，裂解缓冲液或杂交缓冲液)可以包含阳性对照寡核苷酸，所述阳性对照寡核苷酸例如与所述阵列的捕获寡核苷酸杂交。有利地，这可以用作阳性对照，以确保使用正确的试剂。例如，多种捕获寡核苷酸可以用于代表不同的试剂(例如裂解缓冲液、杂交缓冲液等)，并且每种试剂中的特定阳性对照可以用于“编码”使用了适当的试剂。当从总体上看时，所述多种捕获寡核苷酸可以指示微阵列制备/分析的一些或全部步骤是用掺有一种或多种阳性对照寡核苷酸的试剂完成的，从而指示使用了正确的试剂。

在一些实施方案中，本公开文本设想调整在扩增样品中的核酸的步骤中使用的所述第一引物相对于所述第二引物的比率。可以倾斜引物的比率以优先扩增所述核酸的一条链而不是另一条-一种称为不对称扩增的技术(参见例如，McCabe,PCR Protocols:A guideto Methods and Applications,76-83,1990)。有利地，不对称扩增中的倾斜的引物比率导致显著均匀的产物，这可以有助于增加在本公开文本的通用阵列上检测到的杂交信号的强度。在本公开文本的一些实施方案中，使用相对于所述第二引物过量的所述第一引物扩增所述核酸的所述部分，并且其中存在时的所述扩增子是单链核酸，所述单链核酸经由所述第三寡核苷酸序列的互补体与所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种杂交。在一些实施方案中，使用在约12.5:1与约100:1之间的所述第一引物与所述第二引物的比率扩增所述核酸的所述部分。在一些实施方案中，使用以下的所述第一引物与所述第二引物的比率：至少约2:1、至少约5:1、至少约10:1、至少约15:1、至少约20:1、至少约25:1、至少约30:1、至少约35:1、至少约40:1、至少约45:1、至少约50:1、至少约55:1、至少约60:1、至少约65:1、至少约70:1、至少约75:1、至少约80:1、至少约85:1、至少约90:1、至少约95:1、至少约100:1、至少约150:1、或至少约200:1。

抗原检测

除了核酸之外，本文所述的通用阵列平台可以用于检测多种目的抗原。因此，本公开文本的一些方面涉及用于检测样品中的抗原的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)提供各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列；b)在步骤(a)之后，使所述固体支持物与特异性地结合抗原的抗原结合结构域接触，其中所述抗原结合结构域偶联至单链寡核苷酸序列，所述单链寡核苷酸序列与所述固体支持物上的所述单链寡核苷酸捕获序列中的至少一种杂交，并且其中在适合于所述抗原结合结构域的所述单链寡核苷酸序列与所述固体支持物上的所述至少一种单链寡核苷酸捕获序列杂交的条件下，使所述微阵列与所述抗原结合结构域接触；c)在步骤(a)之后，在适合于所述抗原结合结构域结合存在于所述样品中时的所述抗原的条件下，使所述固体支持物与所述样品的至少一部分接触；d)在步骤(a)之后，将胶体检测试剂施加至所述固体支持物，其中所述胶体检测试剂包含与存在时的所述抗原特异性结合的第一部分和包括胶体金属的第二部分；e)在(d)之后，用洗涤溶液洗涤所述固体支持物；以及f)在步骤(a)-(e)之后，检测所述胶体检测试剂，其中检测到所述胶体检测试剂指示在所述样品中所述抗原的存在。

在一些实施方案中，所述抗原包括多肽、脂质、或碳水化合物。在某些实施方案中，所述抗原是多肽抗原。

以上关于核酸检测所述的任何组合物和方法也可以用于抗原检测，所述组合物和方法包括但不限于固体支持物、胶体检测试剂及其检测方法、显影试剂、间隔子试剂、裂解缓冲液、封闭剂、拥挤剂、杂交缓冲液、和洗涤缓冲液。

在一些实施方案中，所述第一部分包括与所述抗原特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域偶联至生物素或其衍生物，并且其中所述胶体悬浮体偶联至亲和素、中性亲和素、链霉亲和素或其与生物素结合的衍生物。在一些实施方案中，所述胶体金属是金、铂、钯、或钌。在一些实施方案中，多个斑点中的每个斑点处的所述单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之前使所述样品暴露于裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.1％且小于或等于10％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在一些实施方案中，所述抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，所述病毒抗原来自选自以下的病毒：HIV、HBV、HCV、西尼罗河病毒、寨卡病毒、和细小病毒。在一些实施方案中，所述抗原是细菌、古生菌、原生动物、真菌、植物、或动物抗原。在一些实施方案中，所述样品包括全血、血清、唾液、尿液、粪便、组织、或环境样品(例如，包括水、土壤等)。

装置

本公开文本的其他方面涉及用于扩增样品中的核酸的装置或设备。在一些实施方案中，所述装置或设备包括：毛细管管路，所述毛细管管路围绕支持物以多个回路布置，其中所述多个回路中的每个回路包括第一、第二、和第三恒定温度区，并且其中所述毛细管管路在所述第一恒定温度区中加热至第一温度，在所述第二恒定温度区中加热至第二温度，并且在所述第三恒定温度区中加热至第三温度；机械臂，所述机械臂被配置为将与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和引物对的扩增混合物混合的包含核酸的样品引入所述毛细管管路中；以及泵或真空装置，所述泵或真空装置被配置为使与所述扩增混合物混合的所述包含核酸的样品通过所述毛细管管路内的所述多个回路。

为了使用本文所述的方法检测样品中的核酸，核酸的至少一部分的扩增可以用于与阵列杂交。因此，在一些方面，本公开文本设想了可用于扩增目的核酸的设备。在一些实施方案中，本公开文本涉及用于核酸扩增的设备，所述设备具有毛细管管路、机械臂、和泵或真空装置。

所述核酸的扩增是在所述毛细管管路中进行的。所述毛细管管路围绕支持物以多个回路布置，其中所述多个回路中的每个回路包括第一、第二、和第三恒定温度区，并且其中所述毛细管管路在所述第一恒定温度区中加热至第一温度，在所述第二恒定温度区中加热至第二温度，并且在所述第三恒定温度区中加热至第三温度。这些区中的每个区可以对应于标准PCR或其他扩增反应的一部分，即PCR的变性、退火和延伸。对于等温扩增，可以将每个区加热至相同的温度(例如，37℃)。有利地，毛细管管路允许提高的热传导速率，这意味着可以迅速实现目标反应温度，并且可以缩短反应时间。所述多个回路中的每个回路中的毛细管管路可以形成任何形状，例如但不限于圆锥形形状、圆柱形形状或螺旋形形状。毛细管管路可以包含任何材料，例如但不限于聚四氟乙烯(PTFE)。所述毛细管管路的所述多个回路可以包括任何数目的回路，例如但不限于约25至约44个回路(例如，对应于扩增循环的数目)。

所述设备的泵或真空装置可以被配置为使与所述扩增混合物混合的所述包含核酸的样品通过所述毛细管管路内的所述多个回路。本领域熟知的多种泵和真空装置可以用于所述设备。在一些实施方案中，所述泵或真空装置是蠕动泵。在一些实施方案中，所述泵或真空装置是高效液相色谱(HPLC)泵。在一些实施方案中，所述泵或真空装置是精密注射泵。

所述设备的机械臂可以被配置为将与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和引物对的扩增混合物混合的包含核酸的样品引入所述毛细管管路中。在一些实施方案中，所述机械臂包括蠕动泵或HPLC泵，所述蠕动泵或HPLC泵被配置为将与扩增混合物混合的所述包含核酸靶标的样品引入所述毛细管管路中，并且其中所述设备进一步包括第二泵，所述第二泵被配置为将与扩增混合物混合的所述包含核酸靶标的样品拉动通过所述毛细管管路。

可以将另外的部件添加至所述设备。在一些实施方案中，所述设备进一步含有一个或多个处理器、存储器、一个或多个程序，其中所述一个或多个程序被存储在所述存储器中并且被配置为由所述一个或多个处理器执行，所述一个或多个程序包括用于控制所述第一、第二、和第三恒定温度区的温度的指令。在一些实施方案中，所述设备进一步含有用于cDNA合成区的保温箱(例如，在所述样品是RNA时)，其中在所述多个回路的上游将所述毛细管管路加热至在约37℃至约42℃之间。在一些实施方案中，所述保温箱是温度浴、珀耳帖(Peltier)装置、或电阻加热器。在一些实施方案中，将与扩增混合物混合的所述样品在所述cDNA合成区中保持15秒至30分钟。在一些实施方案中，所述设备进一步含有用于活化区的保温箱，其中在所述多个回路的上游将所述毛细管管路加热至约95℃。在一些实施方案中，所述设备进一步含有用于PCR延伸区的保温箱，其中在所述多个回路的下游将所述毛细管管路加热至在约55℃与约72℃之间。

所述泵、机械臂和各种温度区可以全部由系统控制面板控制，从而允许对每个部件的更改，例如，可以改变不同区的温度。此外，所述控制面板可以用于改变泵送速度，从而更改在主扩增区域的每个温度区中花费的时间长度。因此，在一些实施方案中，所述设备可以进一步包括一个或多个处理器、存储器、一个或多个程序，其中所述一个或多个程序被存储在所述存储器中并且被配置为由所述一个或多个处理器执行，所述一个或多个程序包括用于控制所述第一、第二、和第三恒定温度区的温度的指令。

根据本领域已知的标准技术，可以在不同温度区中将所述毛细管管路的温度维持在所需的温度。在一些实施方案中，一个或多个温度区的温度由珀耳帖或电阻加热器维持。在一些实施方案中，使用聚酰亚胺胶带(例如，在铜管路内部)来隔离一个或多个温度区。

在一些实施方案中，在回路完成之后，使用机械臂将扩增子施加至微阵列(例如，本公开文本的固体支持物)。在一些实施方案中，添加染料，例如以帮助使点样在微阵列上的液体可视化。在一些实施方案中，在完成回路之后，将所述扩增子收集到具有杂交缓冲液的容器中，然后添加至微阵列(例如，通过吸移手动地进行、或使用机械臂)。

上文所述的设备可以用于本公开文本的任何方法中。例如，在一些实施方案中，所述方法包括：a)将所述样品的至少一部分与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和引物对的扩增混合物一起孵育，其中所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的一部分的第一链杂交，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第一捕获部分，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交；b)在适合于扩增包含存在于所述样品中时的所述核酸的所述部分的扩增子的条件下，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过连续毛细管管路通过第一、第二、和第三恒定温度区，以进行多个循环，其中所述多个循环中的每个循环包括：1)使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第一温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第一恒定温度区并持续第一持续时间，所述第一温度和所述第一持续时间适合于使存在于所述样品中时的所述核酸的所述链变性，2)在步骤(b)(1)之后，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第二温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第二恒定温度区并持续第二持续时间，所述第二温度和所述第二持续时间适合于将所述第一引物和所述第二引物退火至存在于所述样品中时的所述核酸的对应链，以及3)在步骤(b)(2)之后，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第三温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第三恒定温度区并持续第三持续时间，所述第三温度和所述第三持续时间适合于经由所述聚合酶和引物对扩增存在于所述样品中时的所述核酸靶标；c)在所述多个循环之后，使存在于所述样品中时的所述扩增子与附着于固体支持物的第一捕获部分缔合；以及d)检测存在于所述样品中时的所述扩增子与所述固体支持物的缔合，其中所述扩增子与所述一个或多个固体支持物的缔合指示在所述样品中所述核酸的存在。

用于使用上述设备扩增和检测样品中的核酸的一般步骤在下面进行了描述，并且可以采用上述任何试剂或技术。

所述方法可以包括将所述样品的至少一部分与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和引物对的扩增混合物一起在初始容器中孵育，其中所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的一部分的第一链杂交，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第一捕获部分，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交。

然后，使用泵和机械臂来在适合于扩增包含存在于所述样品中时的所述核酸的所述部分的扩增子的条件下，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过连续毛细管管路通过第一、第二、和第三恒定温度区，以进行多个循环，其中所述多个循环中的每个循环包括：1)使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第一温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第一恒定温度区并持续第一持续时间，所述第一温度和所述第一持续时间适合于使存在于所述样品中时的所述核酸的所述链变性，2)在步骤(b)(1)之后，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第二温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第二恒定温度区并持续第二持续时间，所述第二温度和所述第二持续时间适合于将所述第一引物和所述第二引物退火至存在于所述样品中时的所述核酸的对应链，以及3)在步骤(b)(2)之后，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分在第三温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第三恒定温度区并持续第三持续时间，所述第三温度和所述第三持续时间适合于经由所述聚合酶和引物对扩增存在于所述样品中时的所述核酸靶标。

接下来，在所述多个循环之后，可以使存在于所述样品中时的所述扩增子与附着于固体支持物的第一捕获部分缔合。

最后，可以检测存在于所述样品中时的所述扩增子与所述固体支持物的缔合，其中所述扩增子与所述一个或多个固体支持物的缔合指示在所述样品中所述核酸的存在。

在一些实施方案中，所述第一捕获部分包含第三寡核苷酸序列，并且其中所述第二捕获部分包含在步骤(c)中与所述第三寡核苷酸序列或所述第三寡核苷酸序列的互补体杂交的单链寡核苷酸捕获序列。在一些实施方案中，检测存在时的所述扩增子与所述固体支持物的缔合包括：i)将胶体检测试剂施加至所述固体支持物，其中所述胶体检测试剂包含与存在时的所述扩增子的所述标记结合的第一部分和包括胶体金属的第二部分；和ii)检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，在步骤(d)(ii)中检测所述胶体检测试剂包括检测所述胶体金属。在一些实施方案中，在步骤(d)(ii)中检测所述胶体检测试剂包括：a)将显影试剂施加至所述固体支持物，其中所述显影剂适合于在存在所述胶体金属的情况下形成沉淀物；和b)通过检测所述沉淀物在固体支持物处的形成来检测所述胶体检测试剂。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过视觉、电子或磁性检测来检测。在一些实施方案中，所述沉淀物的形成通过机械读取器来检测。在一些实施方案中，所述显影试剂包含银。在一些实施方案中，所述标记包括生物素或其衍生物，并且其中所述胶体检测试剂的所述第一部分包括特异性结合生物素的中性亲和素、链霉亲和素、或抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述胶体检测试剂的所述第一部分包括中性亲和素，并且其中所述胶体检测试剂的所述第二部分包括胶体金离子。在一些实施方案中，步骤(b)中的所述条件适合于通过聚合酶链反应(PCR)进行的扩增。在一些实施方案中，步骤(b)中的所述条件适合于通过以下方式进行的扩增：重组酶-聚合酶测定(RPA)、基于核酸测序的链测定(NASBA)、滚环扩增、支链扩增、连接扩增、或环介导的等温扩增。在一些实施方案中，使用蠕动泵、高效液相色谱(HPLC)泵、精密注射泵、或真空装置使与所述PCR扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述连续毛细管管路。在上文所述的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(b)之前：使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约20℃与约55℃之间的预热区。在一些实施方案中，所述预热区在约37℃与约42℃之间。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述预热区，持续长达30分钟。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述预热区，持续约15分钟。在上文所述的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(b)之前：使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约80℃与约100℃之间的活化区。在一些实施方案中，所述活化区在约90℃与约95℃之间。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述活化区，持续长达20分钟。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过所述活化区，持续在约5分钟与约10分钟之间。在上文所述的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前：使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约55℃与约72℃之间的延伸区。在一些上述实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前：i)将第二样品的至少一部分与包含脱氧核糖核苷酸、聚合酶和第二引物对的扩增混合物混合，其中所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物包含标记和第四寡核苷酸序列，所述第四寡核苷酸序列与第二核酸的一部分的第一链杂交，所述第四引物包含第五寡核苷酸序列和第三捕获部分，所述第五寡核苷酸序列与所述第二核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交；ii)在适合于扩增存在于所述样品中时的所述第二核酸的所述部分的条件下，使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述连续毛细管管路通过所述第一、第二、和第三恒定温度区，以进行第二多个循环，其中所述第二多个循环中的每个循环包括：1)使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分在所述第一温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第一恒定温度区并持续所述第一持续时间，所述第一温度和所述第一持续时间适合于使存在于所述第二样品中时的所述第二核酸的所述链变性，2)在步骤(ii)(1)之后，使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分在所述第二温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第二恒定温度区并持续所述第二持续时间，所述第二温度和所述第二持续时间适合于将所述第三引物和所述第四引物退火至存在于所述第二样品中时的所述第二核酸的对应链，以及3)在步骤(ii)(2)之后，使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分在所述第三温度下经由所述连续毛细管管路通过所述第三恒定温度区并持续所述第三持续时间，以适合于经由所述聚合酶和第二引物对扩增存在于所述第二样品中时的所述第二核酸；其中存在于所述第二样品中时的所述第二核酸同时与存在于所述第一样品中时的所述扩增的第一核酸靶标、与第四捕获部分缔合，所述第四捕获部分与所述第三捕获部分缔合，其中所述第四捕获部分偶联至固体支持物；并且其中存在于所述第二样品中时的所述扩增的第二核酸与所述固体支持物的缔合与存在于所述第一样品中时的所述扩增的第一核酸的杂交同时进行检测，并且其中所述扩增的第二核酸靶标与所述固体支持物的缔合指示在所述第二样品中所述第二核酸靶标的存在。

在一些实施方案中，所述第一样品和所述第二样品可以是相同的或可以不是相同的。在一些实施方案中，所述第一样品和所述第二样品是相同的。在一些实施方案中，所述第一样品和所述第二样品是不同的样品。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸可以是相同的或可以不是相同的。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸是相同的。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸是不同的。应注意的是，可以使用本文所述的设备和方法检测来自不同的样品的相同核酸。

在上文所述的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在使与所述扩增混合物混合的所述第一样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述多个循环之后，并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使足够量的空气通过所述连续毛细管管路，以将与所述扩增混合物混合的所述第一样品的所述部分和与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分分隔开。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在使所述量的空气通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使包含浓度在约0.1％与约10％之间的次氯酸钠的溶液通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述溶液包含浓度为约1.6％的次氯酸钠。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在使所述漂白剂溶液通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使包含浓度在约5mM与约500mM之间的硫代硫酸盐的溶液通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述溶液包含浓度为约20mM的硫代硫酸盐。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在使所述硫代硫酸盐溶液通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使水通过所述连续毛细管管路。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在使水通过所述连续毛细管管路之后并且在使与所述PCR扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分通过所述第一、第二、和第三恒定温度区以进行所述第二多个循环之前：使足够量的空气通过所述连续毛细管管路，以将水和与所述PCR扩增混合物混合的所述第二样品的所述部分分隔开。在一些实施方案中，水和空气通过方案包括在样品之间的各20秒的四个水脉冲，所述四个水脉冲由20秒的空气脉冲分隔开。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，步骤(a)包括将所述样品的所述部分***所述连续毛细管管路中并且使用机械臂或阀系统将所述样品的所述部分与所述扩增混合物混合。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述核酸包括DNA。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述核酸包括RNA。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(a)之前：在适合于产生由所述RNA合成的cDNA的条件下将所述样品的至少一部分与逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸一起孵育，其中在步骤(a)中将所述cDNA与所述扩增混合物混合。在一些实施方案中，在步骤(a)之前使用的所述引物是随机引物、多聚-dT引物或对所述RNA的所述部分具有特异性的引物。在一些实施方案中，其中在经由所述连续毛细管管路通过在约37℃与约42℃之间的cDNA合成区的同时，将所述样品的所述部分与所述逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸一起孵育，持续足以产生由所述RNA合成的cDNA的时间。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在使与所述逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸混合的所述样品的所述部分通过所述cDNA合成区之后并且在步骤(b)之前：使与所述逆转录酶、引物和脱氧核糖核苷酸混合的所述样品的所述部分经由所述连续毛细管管路通过在约95℃下的活化区。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约80℃与约100℃之间的所述第一恒定温度区，持续1秒至约10分钟。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约90℃与约97℃之间的所述第一恒定温度区，持续2秒至约20秒。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约95℃下的所述第一恒定温度区，持续至少10秒。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约45℃与约65℃之间的所述第二恒定温度区，持续2秒至约60秒。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约55℃下的所述第二恒定温度区，持续至少15秒。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约50℃与约57℃之间的所述第二恒定温度区，持续2秒至约60秒。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约57℃与约74℃之间的所述第三恒定温度区，持续3秒至约60秒。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约65℃与约72℃之间的所述第三恒定温度区，持续3秒至约60秒。在一些实施方案中，使与所述扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约65℃与约72℃之间的所述第三恒定温度区，持续至少15秒。在一些实施方案中，如果使用等温或LAMP扩增，则所有三个恒定温度区可以具有相同的温度，例如37℃。此外，对于所有恒定温度区，可以控制泵或真空装置的速度，以更改与所述扩增混合物混合的所述样品在每个恒定温度区中所花费的时间长度。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，在所述多个循环中的每个循环期间，使与所述PCR扩增混合物混合的所述样品的所述部分通过在约45℃与约80℃之间的所述第二恒定温度区和所述第三恒定温度区两者，持续在约0.5秒与约5分钟之间。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述多个循环包括大于或等于2个循环且小于或等于100个循环。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(a)之前将所述样品的所述部分与裂解缓冲液一起孵育，所述裂解缓冲液包含大于或等于0.1％且小于或等于10％N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(w/v)。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，在步骤(a)中将所述样品进一步与甜菜碱混合。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，在步骤(a)中将所述样品进一步与荧光或着色染料混合。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述第二引物包含：所述第二寡核苷酸序列，其中所述第二寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸；和所述第三寡核苷酸序列，其中所述第三寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5’至3’方向上。在一些实施方案中，所述第三寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，所述第二引物进一步包含在所述第三寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述第一捕获部分附着于间隔子试剂，并且其中所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述样品包括全血、血清、唾液、尿液、粪便、组织、或环境样品。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述核酸包括病毒核酸。在一些实施方案中，所述病毒核酸来自选自以下的病毒：HIV、HBV、HCV、西尼罗河病毒、寨卡病毒、和细小病毒。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述核酸包括细菌、古生菌、原生动物、真菌、植物、或动物核酸。在一些实施方案中，所述样品包括全血、血清、唾液、尿液、粪便、组织、或环境样品(例如，包括水、土壤等)。

试剂盒和制品

本公开文本的其他方面涉及用于检测样品中的核酸或抗原的试剂盒或制品。

在一些实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒具有：多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括偶联至标记的第一引物，其中所述第一引物与核酸的第一链杂交；和第二引物，所述第二引物包含：1)第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸并与所述核酸中与所述第一链相对的第二链杂交；2)第二寡核苷酸序列，其中所述第二寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5’至3’方向上；以及3)在所述第一寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，所述第二寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在一些实施方案中，偶联至所述第一引物的所述标记包括生物素。在上文所述的一些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列，并且其中至少一种单链寡核苷酸序列在其固体支持物上与所述多个引物对中的引物对的第二引物的所述第二寡核苷酸序列杂交。

在一些实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒具有：a)各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分的第一链杂交；和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交，其中所述多个引物对中的每个引物对的所述第三寡核苷酸序列与单链寡核苷酸捕获序列在其固体支持物上杂交。在一些实施方案中，所述多个引物对中的每个引物对的所述第二寡核苷酸序列允许在5’至3’方向上的引物延伸，其中所述多个引物对中的每个引物对的所述第三寡核苷酸序列的取向是在与从所述第二寡核苷酸序列的引物延伸的方向相比相反的5'至3'方向上，并且其中所述多个引物对中的每个引物对的所述第二引物进一步包含在所述第三寡核苷酸序列的5’端与所述第二寡核苷酸序列的5’端之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，所述多个引物对中的每个引物对的所述第三寡核苷酸序列在3’末端包含修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸阻断引物延伸。在上文所述的一些实施方案中，所述单链寡核苷酸捕获序列中的每一种在其支持物上偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂含有树状大分子。

在一些实施方案中，本公开文本涉及试剂盒，所述试剂盒具有：a)各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多种抗原结合结构域，其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域特异性地结合抗原，并且其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域偶联至与附着于所述固体支持物的单链寡核苷酸序列基本上互补的单链寡核苷酸序列。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步含有：c)偶联至胶体检测试剂的第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域特异性地结合如下抗原，所述抗原也被(b)中的所述多种抗原结合结构域中的抗原结合结构域特异性地结合。

在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒进一步包含引物序列。例如，对于HBV的检测，本公开文本的试剂盒可以进一步包含用于检测HBV核酸(例如，HBV sAg)的扩增引物。在一些实施方案中，扩增了包含序列TTC CTA GGA CCC CTG CTC GTG TTA CAG GCG GGGTTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTC ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACTTCT CTC AAT TTT CTA GGG GG(SEQ ID NO:33)的扩增子。在一些实施方案中，所述扩增引物包括：包含序列CCC CCT AGA AAA TTG AGA GAA GTC CAC CAC G(SEQ ID NO:32)的第一引物和包含序列ATT CCT AGG ACC CCT GCT CGT GTT A(SEQ ID NO:31)的第二引物。在一些实施方案中，所述第一引物包含偶联至5’端的生物素。

寡核苷酸

本公开文本的其他方面涉及单链寡核苷酸，例如系链或捕获序列。这些序列可以可互换地作为系链或捕获序列使用。例如，本文提供了多种单链寡核苷酸捕获序列，其中所述多种单链寡核苷酸捕获序列中的每种序列独立地选自SEQ ID NO:1-15。另外，本文提供了多种单链寡核苷酸捕获序列，其中所述多种单链寡核苷酸捕获序列中的每种序列独立地选自SEQ ID NO:16-30。有利地，已经针对稳健且一致的杂交、缺乏二级结构、以及与(例如与人基因组有关的)天然存在的序列不存在同源性，从数千种潜在序列中鉴定出了这些序列。

本文进一步提供了各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列，其中每种单链寡核苷酸捕获序列独立地选自SEQ ID NO:1-15。在一些实施方案中，每个固体支持物处的所述单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括树状大分子。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒具有：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多种抗原结合结构域，其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域偶联至独立地选自SEQ ID NO:16-30的单链寡核苷酸序列。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒具有：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种单链寡核苷酸捕获序列；和b)多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与核酸的第一链杂交；和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交，其中每个第一引物的所述第三寡核苷酸序列独立地选自SEQ ID NO:16-30。

本文进一步提供了各自附着于固体支持物的多种单链寡核苷酸捕获序列，其中每种单链寡核苷酸捕获序列独立地选自SEQ ID NO:16-30。在一些实施方案中，每个固体支持物处的所述单链寡核苷酸捕获序列偶联至间隔子试剂，并且所述间隔子试剂偶联至所述固体支持物。在一些实施方案中，所述间隔子试剂包括血清白蛋白。在一些实施方案中，所述间隔子试剂含有树状大分子。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒具有：根据以上实施方案中任一项所述的多种序列；和b)多种抗原结合结构域，其中所述多种抗原结合结构域中的每种抗原结合结构域偶联至独立地选自SEQ ID NO:1-15的单链寡核苷酸序列。本文进一步提供了试剂盒，所述试剂盒具有：a)根据以上实施方案中任一项所述的多种序列；和b)多个引物对，其中所述多个引物对中的每个引物对包括：1)第一引物，所述第一引物包含标记和第一寡核苷酸序列，所述第一寡核苷酸序列与核酸的第一链杂交；和2)第二引物，所述第二引物包含第二寡核苷酸序列和第三寡核苷酸序列，所述第二寡核苷酸序列与所述核酸的所述部分中与所述第一链相对的第二链杂交，其中每个第一引物的所述第三寡核苷酸序列独立地选自SEQ ID NO:1-15。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列、多重珠阵列或孔阵列。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述固体支持物被布置为微阵列、多重珠阵列或孔阵列。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述固体支持物是硝酸纤维素、二氧化硅、塑料或水凝胶。

通过参考下述实施例，会更加全面地理解本公开文本。然而，它们不应被解读为以任何方式限制本公开文本的任何方面或范围。

实施例

通过参考下述实施例，会更加全面地理解本公开文本。然而，实施例不应被解读为限制本公开文本的范围。应理解本文所描述的实施例和实施方案仅出于说明目的，并且将建议本领域技术人员根据它们进行各种修改或变化，并且它们被包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范围之内。

实施例1：用于检测蛋白质和核酸生物标记的“通用阵列”技术

通用阵列概念采用了一种具有印刷至阵列表面的探针DNA寡核苷酸序列的阵列。使与探针寡核苷酸互补的靶DNA寡核苷酸与印刷的探针杂交。还与靶DNA寡核苷酸序列附接的是允许检测特定大分子的试剂。例如，可以将特异性结合疾病或癌症相关生物标记的抗体缀合至印刷至阵列的序列之一互补的DNA寡核苷酸序列，以允许生物标记的特异性检测。由于靶DNA寡核苷酸的一部分与探针杂交，因此可以将不同的靶DNA寡核苷酸用于不同的测定，从而允许将相同的阵列(例如“通用”阵列)配置为用于多种不同的测定以检测生物标记、蛋白质、抗体、和/或目的核酸。

这种概念展示于图1A中。图1A描绘了缀合至BSA的单链寡核苷酸探针(“cA”)，产生了“BSA-cA缀合物探针”，然后将其印刷至阵列。为了检测生物标记(在该实施例中为HBsAg蛋白)，将特异性结合HBsAg的一抗缀合至与探针序列互补的寡核苷酸序列(“tA缀合物”)，从而使tA缀合物与其上印刷BSA-cA缀合物探针的阵列位置处的探针杂交。多种类型的标记可以用于检测阵列位置处生物标记的存在。在该实施例中，结合生物标记的经金标记的二抗用于在银沉淀到金上之后检测阵列位置处生物标记的存在，所述沉淀可以经由用CCD照相机的比色检测可视化为斑点(参见例如，Alexandre,I.等人(2001)Anal.Biochem.295:1-8)。

图1B示出了示例性测定的结果。如图1B中所示，仅当使用结合斑点处的该探针的特异性寡核苷酸时，才在阵列上的所述斑点处检测到HBsAg蛋白。

类似地，通用阵列概念也可以应用于核酸测试(NAT)，如图2A至图2E中所示。在该实施例中，使用采用以下扩增引物的聚合酶链反应(PCR)扩增目的核酸，所述扩增引物具有3种组分：取向为3’至5’方向、与通用阵列上的探针互补的序列(“tC序列”)；防止PCR延伸到tC序列中的间隔子(例如，2个非核苷酸接头)；和取向为5’至3’方向、对目的核酸具有特异性的寡核苷酸引物(图2A)。因此，在使用引物扩增后，靶序列被掺入扩增子产物中，从而允许与印刷在阵列上的探针杂交(图2B)。PCR反应还包括另一种对目的核酸具有特异性的引物，所述引物具有可检测的标记(在这种情况下为生物素)从而允许检测与阵列杂交的扩增子。

通用阵列的图示于图2C中。扩增子含有靶核酸的被所述两个引物扩增的部分，从而导致扩增子在一端具有生物素标记，而在另一端具有与阵列杂交的突出端(tC序列)。在与印刷的探针杂交后，可以通过多种手段检测扩增子。在该实施例中，使用银沉积(例如，如上所述)来检测金缀合的中性亲和素(“NAG”)。

该测定的代表性读出示于图2D和图2E中。在该实施例中，在缺乏HCV核酸的样品中使用对HCV具有特异性的寡核苷酸未检测到杂交(“HCV阴性”；图2D)。然而，在含有HCV核酸的样品中，仅在使用与阵列上某些斑点杂交的特异性寡核苷酸时才检测到杂交；非特异性寡核苷酸没有产生信号(图2E)。

通用阵列概念对蛋白质生物标记检测和NAT的适应性在下面提供的实施例中有更详细的描述。

实施例2：探针DNA寡核苷酸序列

通过制备含有15种不同探针DNA寡核苷酸序列的阵列(“15元件阵列”)来测试实施例1中描述的通用阵列概念。

方法

为了产生阵列，将一组探针DNA寡核苷酸序列缀合至载体蛋白并排列在载玻片上。然后，使用与探针寡核苷酸互补的一组靶DNA寡核苷酸(例如，以具有三种组分的扩增引物的形式)来扩增样品，从而允许靶DNA与印刷的探针杂交。

在15元件阵列中使用的探针序列和互补序列提供于表1中。

表1.在15元件阵列中使用的探针序列和互补序列。

使用HBV DNA(5ug，在1:1血浆裂解物中)测试15元件阵列。HBV引物包含序列ATTCCT AGG ACC CCT GCT CGT GTT A(SEQ ID NO:31；正向)和CCC CCT AGA AAA TTG AGA GAAGTC CAC CAC G(SEQ ID NO:32；反向)。合成探针序列并将其缀合至HBV正向引物。互补序列是缀合至阵列的寡核苷酸。将生物素缀合至反向引物的5’端，并以200nm浓度使用引物。按照制造商说明书使用Promega1步式RT-qPCR系统(一步式逆转录-qPCR试剂系统)生成靶扩增子。

结果

结果示于图3A中。每个图片代表在同一15元件阵列上使用的不同互补序列。在每个图片的所有四个角中看到的黑色斑点是BSA-金缀合物的阳性对照(在图3A中由角框表示)，所述BSA-金缀合物在银沉淀之后可视化为黑色斑点(参见实施例1)。简而言之，每种互补序列特异性地检测15元件阵列上的正确探针序列(在图3A中由非角框表示)。在一些情况下，在互补序列中观察到交叉反应性，如NS1与NS5或NS3与NS7(在图3A中由虚线框表示)。

使用15元件阵列进行的该测试展示了通用阵列概念的探针组分。在此，使用了15种探针序列以及缀合至HBV引物(即一种靶序列)的15种互补序列，但是每种互补序列可以缀合至不同的靶引物。因此，通用探针可以用于有效地区分一系列靶序列。因此，使用通用探针消除了为每个实验/靶标设计新的阵列探针的需要。

实施例3：通用阵列试剂

实施例1中所述的通用阵列概念使用特定试剂来制备样品并使样品与阵列杂交。在该实施例中，测试了特定试剂浓度。

方法

样品制备的第一部分使用裂解缓冲液，样品与缓冲液的比率为1:1。裂解缓冲液(表3)包含磷酸盐缓冲盐水(表2)。

表2.10X磷酸盐缓冲盐水。

表3.裂解缓冲液。

成分	量
		10X磷酸盐缓冲盐水	1X
Empigen BB	0.5％至1％

样品制备的第二部分使用PCR扩增样品。使用实施例1中所述的三组分引物系统或实施例10中所述的不对称扩增系统完成该扩增。当使用三组分引物系统时，使用100nM至200nM的引物。当使用不对称扩增系统时，使用40nM至80nM的正向引物和1μM至8μM的反向引物。如果起始样品是RNA，则以0.1X至5X使用逆转录酶混合物。

使样品与阵列杂交的第一部分使用了杂交缓冲液(表5)，所述杂交缓冲液主要由盐水-柠檬酸钠(SSC)组成(表4)。

表4.20X盐水-柠檬酸钠。

成分	量
		氯化钠	3M
柠檬酸，三钠盐	0.3M

表5.杂交缓冲液。

在制备杂交缓冲液之后，将金缀合的中性亲和素(“NAG”)添加至缓冲液并稀释至0.05OD至0.2OD的最终稀释度。将通过PCR(如上所述)产生的扩增子添加至杂交/中性亲和素金混合物中，使得每210μl混合物中存在1μl至5μl扩增子。

一旦样品与阵列杂交(参见实施例4)，就用杂交洗涤缓冲液(表6)洗涤阵列，所述杂交洗涤缓冲液同样包含SSC缓冲液(表4)。该洗涤缓冲液含有足以减少阵列上的背景信号的量的洗涤剂。

表6.杂交洗涤缓冲液。

成分	量
		20X SSC	1X至5X
N-月桂酰肌氨酸钠盐	0.05％至2％

结果

裂解缓冲液中不同浓度的Empigen BB的测试展示于图3B中。在该测试中，靶标是作为RNA病毒的HIV的一部分。使用Empigen BB促进了病毒裂解，所述病毒裂解释放RNA，并且意味着裂解产物(裂解物)可以直接用于RT-PCR或PCR。将不对称扩增系统用于扩增HIV靶标。使用一种互补序列，并且将一种探针(在图3B中虚线矩形指示探针在阵列上的位置)连同BSA-金阳性对照(在图3B中由右侧的实心矩形指示)多次打点在阵列上。0％至1％的Empigen BB浓度允许靶标扩增，而2.5％至10％的浓度抑制靶标扩增。

实施例4：10分钟1步式杂交和阵列处理

使用以下处理方案测试实施例1中所述的通用阵列概念。这些方案允许将PCR或RT-PCR扩增产物直接与阵列杂交(即无需额外的清除步骤)。

方法

在杂交之前，使用150μl在1X PBS中的2％BSA封闭阵列。然后将阵列在37℃和250RPM下的热振荡器中放置60分钟。在封闭之后，将阵列用150μl超纯H₂O洗涤三次，使得去除过量的未结合的试剂。将最后的洗涤液留在孔中，直到准备好样品，以防止阵列变干。

为了制备用于杂交的样品，通过向2ml杂交缓冲液(对于详情参见实施例3)中添加20μl 10OD NAG，在每载玻片上制备2ml的杂交缓冲液/NAG混合物(Hyb/NAG)。然后，对于每种扩增子，准备具有210μl Hyb/NAG的0.5ml微量离心管，因为每种扩增子将加载到两个孔中，并且每个孔需要100μl。在准备管之后，将2.1μl扩增子添加至每个管并短暂涡旋，之后将所有管短暂离心。

为了杂交，将最终的洗涤液从孔去除，并且向每孔中添加100μl Hyb/NAG/扩增子混合物。然后，将阵列在37℃和250RPM下的热振荡器中放置10分钟。

在杂交之后，将混合物从孔中吸移出。然后，将阵列用100μl杂交洗涤缓冲液(详情请参见实施例3)洗涤三次，以去除未结合的试剂。紧接第三次洗涤之后，将阵列用150μl超纯H₂O洗涤三次。将最后的洗涤液留在孔中，直到准备好银染色剂，以防止阵列变干。

使用的银染色剂是Intuitive Biosciences制造的试剂盒。使用GenePix Pro 7将载玻片成像。

不同的杂交缓冲液配制品对严格性的影响示于图3C中。在此，使用不对称扩增系统来扩增HCV靶标。使用一种互补序列，并且将一种探针连同BSA-金阳性对照(在图3C中由实心矩形指示)多次打点在阵列上。在该测试中，使用两种不同的杂交缓冲液配制品来制备用于杂交的样品。用于制备在顶部行图片中的样品的第一配制品包含3X SSC、1％BSA和3％PEG-C(3/1/3杂交缓冲液)。用于制备在底部行图片中的样品的第二配制品包含2X SSC、1％BSA和2％PEG-C(2/1/2杂交缓冲液)。在比较这两种配制品时，可以看出3/1/3杂交缓冲液不如2/1/2杂交缓冲液严格，因为在不存在裂解物的情况下观察到信号(比较左侧的顶部和底部图片中的虚线矩形)并且在不同量的裂解物下观察到非特异性信号。

实施例5：用于制备样品的两步式珠富集方法

在实施例1中所述的用于使用通用阵列概念的核酸测试的步骤之前，可以使用磁珠从样品富集目的核酸。在该实施例中，用与目的核酸互补的经生物素标记的寡核苷酸来标记经链霉亲和素包被的磁珠。然后将这些珠添加至样品/裂解缓冲液混合物中，以结合目的核酸。然后使用氢氧化钠从珠移取目的核酸，并使用Tris中和所洗脱的靶标。

方法

使用以下方案将经生物素标记的寡核苷酸与磁珠结合。

1.将400μl经链霉亲和素包被的磁珠(在此为：Bangs Lab珠(目录号BM568))添加至1.5ml管中。

2.将珠磁性分离30秒以分离珠，然后通过吸移小心去除上清液并将其丢弃。

3.将珠重悬于200μl结合缓冲液(20mM Tris pH 8.0/0.5M NaCl)中。

4.添加2μl经生物素标记的寡核苷酸(在此为：生物素化的HIV反向引物)，然后将溶液在室温下在摇摆的情况下孵育15分钟。

5.将珠磁性分离30秒，然后通过吸移小心去除上清液并将其丢弃。

6.在仍在磁性设备上的同时，使用200μl结合缓冲液洗涤珠。丢弃缓冲液上清液。

7.使用200μl结合缓冲液再次重复洗涤。丢弃缓冲液上清液。

8.将具有结合的生物素-引物的磁珠重悬于200μl结合缓冲液中。

使用以下方案从样品富集目的核酸。

1.将样品(在此为：HIV RNA血清样品)与裂解缓冲液1:1混合(该混合物称为样品裂解物)。建议总体积为200μl的样品裂解物。

2.将5μl用经生物素标记的寡核苷酸标记的经链霉亲和素包被的磁珠添加至样品裂解物。

3.通过吸移混合并且在室温下孵育10分钟。

4.将珠磁性分离60秒。

5.通过吸移小心去除上清液并将其丢弃。

6.使用100μl结合缓冲液洗涤珠。

7.小心去除结合缓冲液上清液并将其丢弃。

8.将磁珠重悬于5μl 0.1M氢氧化钠(NaOH)中。

9.在室温下孵育30秒。

10.将珠磁性分离15秒。

11.小心移取上清液(约5μl)并且转移至含有5μl 100mM Tris的新的1.5ml管并且通过吸移混合(洗脱1)。

12.将珠仍在初始管中重悬于10μl 100mM Tris中(洗脱2)。

结果

使用不同的NaOH浓度从磁珠移取目的核酸的影响展示于图3D中。在此，用作输入物的样品裂解物是稀释至10⁵个拷贝/ml的HIV RNA血清样品，然后与裂解缓冲液1:1混合。观察到使用0.05N和更高浓度的NaOH有效地从珠移取目的核酸(比较图3D中标记为“洗脱1”的底部图片组的矩形内的信号与标记为“洗脱后的珠”的顶部图片组的矩形内的信号)。相比之下，当不使用NaOH时，目的核酸保持附接至珠(比较图3D中最右侧的顶部和底部图片的矩形内的信号)。

使用不同的NaOH浓度对随后的RT-PCR的信号强度的影响展示于图3E中。在此，用作输入物的样品裂解物是稀释至10³个拷贝/ml的HIV RNA血清样品，然后与裂解缓冲液1:1混合。如果将5μl经富集的目的核酸用作RT-PCR输入，则可以使用少于0.1N NaOH，但如果将3μl经富集的目的核酸用作RT-PCR输入，则需要至少0.1N NaOH(比较图3E中顶部和底部图片组的矩形内的信号)。

洗脱经富集的目的核酸的不同方法之间的比较展示于图3F中。在此，用作输入物的样品裂解物是稀释至10³个拷贝/ml的HIV RNA血清样品，然后与裂解缓冲液1:1混合。使用100mM Tris从磁珠洗脱经富集的目的核酸比使用10mM TE产生更强的下游信号，而不管随后的RT-PCR中使用3μl还是5μl(比较图3F中顶部和底部图片组的蓝色矩形内的信号)。

实施例6：用于制备样品的一步式珠富集方法

在使用实施例1中所述的通用阵列概念进行核酸测试之前，可以使用磁珠富集目的核酸。在该实施例中，将经链霉亲和素包被的磁珠与互补于目的核酸的经生物素标记的寡核苷酸以及样品裂解物混合。因此，寡核苷酸与目的核酸的杂交与经生物素标记的寡核苷酸与磁珠的结合发生在相同的步骤中。

方法

在一步式珠富集方法中使用以下方案。

1.将40μl磁珠(在此为：Nvigen珠(目录号K61002))添加至1.5ml管中。

2.使用磁性设备，将珠磁性分离30秒以分离珠，然后通过吸移小心去除上清液并将其丢弃。

3.在管仍在磁性设备上的同时，使用200μl结合缓冲液洗涤珠，然后丢弃缓冲液上清液。

4.从磁性设备取出管，并将未标记的磁珠重悬于200μl结合缓冲液(20mM Tris/0.5M NaCl)中。

5.制备具有经生物素标记的寡核苷酸(在此为：生物素HIV-R3引物)的1X裂解缓冲液(1X PBS/1％Empigen BB)。

a.建议浓度为在每100μl裂解缓冲液A中的5皮摩尔(pM)、25pM或125pM引物。

6.在1.5mL管中，将样品(在此为：HIV血清)在健康血浆或稀释缓冲液(10mM Tris/0.1mM EDTA)中稀释至优选浓度。建议最终体积为100μl的稀释样品。

7.将以1:1比率含有引物的裂解缓冲液添加至来自步骤6的稀释样品，以产生样品裂解物。建议最终体积为200μl的样品裂解物。

8.在室温下孵育混合物10分钟，以使引物结合裂解样品中的目的核酸。

9.将5μl未标记的磁珠(来自步骤4)添加至来自步骤8的混合物。

10.通过吸移混合，然后在室温下孵育5分钟。

11.再次通过吸移混合，然后在室温下再孵育5分钟。

12.使用磁性设备，将珠磁性分离60秒，然后通过吸移小心去除上清液并将其丢弃。

13.使用100μl结合缓冲液洗涤珠，然后小心去除结合缓冲液上清液并将其丢弃。

14.从磁性设备取出管并且将珠重悬于5μl 0.1M氢氧化钠(NaOH)中。

15.在室温下孵育30秒。

16.使用磁性设备，将珠磁性分离15秒。

17.小心移取上清液(约5μl)并且转移至含有5μl 100mM Tris的新的1.5mL管并且通过吸移混合(洗脱1)

18.将珠仍在初始管中重悬于10μl 100mM Tris中(洗脱2)。

结果

在一步式富集中使用不同的生物素标记寡核苷酸(引物)浓度的影响展示于图3G中。在此，输入样品是稀释至10⁵个拷贝/ml的HIV RNA血清样品，将其与阴性对照进行比较。当用于一步式富集时，范围为从5pM至125pM的引物浓度是有效的(比较图3G中标记的底部图片组的矩形内的信号与顶部图片组的矩形内的信号)。此外，一步式富集比两步式富集更有效(比较图3G中最右面底部图片的矩形内的信号与在底部的其他图片的矩形内的信号)。

实施例7：在移液管尖端中的锚定的过滤器

在移液管尖端中的样品富集展示于图4A中。在此，锚定的过滤器将具有共价偶联化学(例如，链霉亲和素)的磁珠或基质保留在尖端内部。此外，尖端含有能够附接至(例如，经由生物素)珠或基质的寡核苷酸，所述寡核苷酸与目的核酸互补(对于样品富集过程的示例性实施方案，参见实施例5和6)。

首先，将样品通过移液管尖端上下吸移，由此目的核酸被寡核苷酸捕获。然后，将洗涤缓冲液通过移液器尖端上下吸移，以去除任何多余的试剂或样品。最后，将洗脱缓冲液通过尖端上下吸移，以洗脱目的核酸。

目的核酸可以随后用于实施例1中所述的通用阵列概念中。

实施例8：生物素与中性亲和素金的比率

当使用如实施例1中所述的通用阵列时，经生物素标记的寡核苷酸与经中性亲和素标记的胶体金的比率对于信号检测是重要的。这种概念展示于图4B和图4C中。与先前实验一样(参见实施例4)，使用一种互补序列，并且将一种探针连同BSA-金阳性对照(由实心矩形指示)多次点样在阵列上。图4B使用1X目标浓度并且图4C是图4B中所示的目标量的两倍。将与点样的探针互补的靶标孵育，然后洗涤，之后将与结合至阵列的靶标的相对端互补的经生物素标记的探针和经中性亲和素标记的胶体金(NAG)(生物素探针:NAG)以一系列比率添加至载玻片，孵育，洗涤并进行银增强。在图4B和图4C两个图上，在1步式检测测定中，降低经生物素标记的探针与NAG的比率会增加信号(虚线矩形)。阳性对照是2步式检测测定的例子，其中将靶标与阵列一起孵育，洗掉，然后添加与靶标互补的经生物素标记的探针，洗掉过量的经生物素标记的探针，之后添加NAG。

实施例9：连续扩增系统

使用毛细管管路的连续扩增系统可以用于扩增目的核酸。这种概念展示于图5A中。首先，使用蠕动泵将与扩增(例如，PCR)混合物混合的样品移出初始容器并移入毛细管管路中。然后，使它通过任选的RT区(在样品是RNA的情况下这是必需的)，所述区保持在恒定的温度(例如，37℃或42℃)下。样品通常在该区中保持15分钟(例如，在使用圆形加热系统的情况下，为15个环路的毛细管管路)。

接着，使样品通过任选的PCR活化区，所述PCR活化区保持在恒定温度(例如，95℃)下。样品通常在该区中保持10分钟以活化PCR反应组分(例如，在使用圆形加热系统的情况下，为10个环路的毛细管管路)。在这两个任选区域之后，样品到达主扩增区域，所述主扩增区域是圆柱体，将所述圆柱体垂直划分(参见图5A中的顶视图)为三个恒定温度区(例如，95℃、55℃、65℃)。这些区中的每个区对应于标准PCR反应的一部分，即变性、退火和延伸。将毛细管围绕主扩增圆柱体缠绕多次(例如，44次缠绕)，使得在使样品通过环路时，使它重复地依次穿过三个区中的每个区。使划分成比例，使得样品在第一区中花费约15秒，在第二区中花费15秒，并且在第三区中花费30秒。

最后，使样品离开扩增系统并进入收集系统，在所述收集系统中对其进行检测(例如，MosaiQ检测芯片)。扩增混合物内的指示剂染料用于触发收集过程。

泵、RT区、PCR活化区和主扩增区域全部由系统控制面板控制。这允许对每个部件的更改，例如可以改变不同区的温度。此外，所述控制面板可以用于改变泵送速度，从而更改在主扩增区域的每个温度区中花费的时间长度。

连续扩增系统的一个例子展示于图5B中。该单元使用机械臂和蠕动(或HPLC)泵来拾取已经提取并添加至RT-PCR混合物中的样品，然后将样品移动至毛细管管路中。然后，泵经由毛细管管路将样品输送至任选的预热区(可调，但设置为37℃)，持续10-15分钟，并且之后将样品输送至任选的PCR活化区(可调，但设置为95℃)，持续10分钟。随后，将样品输送至PCR扩增模块，在该模块中所述样品进行循环，其中毛细管围绕三个恒定但可调的温度区的每次缠绕持续约一分钟。这些区允许将样品加热至95℃持续约15秒，然后加热至约55℃以使引物退火约15秒，然后到65℃-72℃的扩增/延伸区上，在所述扩增/延伸区中发生扩增，然后循环回到95℃变性区以供下一个环路。此举连续进行40-50个环路(循环)的毛细管，直到样品离开扩增模块并经过任选的72℃延伸区持续5分钟，并且进入收集托盘，所述收集托盘由于扩增产物含有染料(如蓝色或FITC)而检测扩增产物。

连续扩增系统的第二示例性实施方案展示于图5C中。该例子包括与以下各项合并在一起“Q线圈系统”(在图像的右上方可见，包封在通气、透光的塑料外壳中，其含有在线圈中的3个温度区)：电源(不可见，内部)、机箱风扇(其具有模拟控制以相对于无风扇(如，图5B中的Q1000)实现更精确的温度控制)、以及3个数字可编程显示器(左下方)。由蠕动泵(或其他泵机构，如HPLC)从机器人样品板收集设备(未显示)从外部(在此处不可见)泵送的连续管路流入Q1144机箱的背面，然后通过Q线圈系统外壳(其含有Z1＝95'C，Z2＝55'C和Z3＝65'C的3个温度区)，并且最后离开Q114机箱，以最终分配和收集到样品管中。该系统最为一致地保持3个温度区，并给出始终低至10^4个拷贝/mL血清阳性(1uL样品/反应管混合物＝约10个HIV DNA拷贝)的结果。

方法

下面提供了用于在连续扩增系统(参见图5A至图5C)中检测HIV的反应混合物和方案。

每反应主混合物(24ul/rxn)：

7μl无核酸酶的水

12.5μl BIOTIUM混合物(其中具有Eva绿)

1.5μl 5M甜菜碱缓冲液

1μl 0.2％蓝色染料

0.75μl正向引物(Q-HIV-F1-tc，300nM)

0.75μl反向引物(生物素-HIV-R3，300nM)

0.5μl Promega RT混合物

---------

每管24μl主混合物，+1μl样品。

将样品在裂解缓冲液“X1”中通过1:1稀释度提取。裂解缓冲液X1配方是[2％Triton X100+1x PBS]。替代性裂解缓冲液是“A1”＝[2％Empigen BB+1x PBS]，其在PCR系统和Q系统中均工作良好，然而，裂解-X1缓冲液在Q系统中表现稍微更好并且用于最终的表型测试。在使用之前将样品提取10分钟。

将引物以10μM(在使用之前刚从100μM原液稀释的)使用。

对于样品加载：

机械臂将蠕动泵的入口浸入各列不同的孔中。每一列对应于一种测试，并且每种测试使用不同量的水洗、漂白剂和中和化学品。系统在消毒与洗涤步骤之间使用小的空气间隙。空气、漂白剂和洗涤步骤如下：

I.制备25μl样品并且将其各自加载到板中的第1行中(注意：第1列和第12列仅是水，并且将200μl加载在两列的每个孔中)。所有使用的水都是无核酸酶的水。

II.如下制备其他行中的每一行的100μl：

在第3行第2-11列中为20％漂白剂(最终为1.6％)。

在第5行第2-11列中为20mM硫代硫酸盐。

在第6、7、8...行第2-11列中均为水。

样品加载程序：

1.从第1行收集样品持续60s。空气持续30s。

2.来自第3行的2x漂白剂脉冲，各自持续20s(各约15μl)，在两者之间为20s空气。

3.来自第5行的2x硫代硫酸盐脉冲，各自持续20s(各约15μl)，在两者之间为20s空气。

4.来自第6行的1x水脉冲持续15s，15s空气。

5.来自第7行的1x水脉冲持续15s，15s空气。

6.来自第8行的2x水脉冲持续15s，15s空气。

7.在下一次样品收集之前延迟30s(空气)。

在引入下一个样品之前，使用漂白剂从管线中清除扩增子。由于漂白剂残留会使下一反应失活，因此测试了各种使漂白剂失活的方法。这些方法包括：水稀释、气阱、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠和硫代硫酸钾。通过使用这些方法，无需在样品之间广泛地冲洗系统。因此，可以连续执行多个扩增(例如，不同靶标的扩增)。使用并尝试了许多次洗涤迭代，然而，单独的水不足以在短时间量内清除先前的样品(耗费超过10分钟的水脉冲以避免残留)，而单独的漂白剂在没有足够的水洗涤的情况下又太强(并且最终发现硫代硫酸盐最有效地快速中和漂白剂)，其中最佳洗涤在第140节中提到。对于以上程序中列出的洗涤，使用的漂白剂是20％的8.2％次氯酸盐原液(最终为大约1.6％)，而硫代硫酸盐最终为20mM。

实施例10：不对称扩增

不对称扩增概念采用倾斜的引物比率以获得显著均匀的产物。不对称扩增是本文所述的可用于制备与通用阵列(参见实施例1)杂交的样品的两种方法中的第二种。不对称扩增可以用于热循环扩增过程如聚合酶链反应(PCR)中，或用于等温扩增过程如重组酶聚合酶扩增(RPA)中。

不对称扩增使用两种引物，即正向引物(也称为5’引物或有义引物)和反向引物(也称为3’引物或反义引物)。正向引物具有与通用阵列上的捕获序列相同的序列，以及目的核酸的5’端的短的一部分。反向引物对目的核酸(在这种情况下，目的核酸的3’端)具有特异性，并且具有可检测的标记(在这种情况下，在其5’端处的生物素)以允许检测与阵列杂交的扩增子。反向引物的使用量超过正向引物的使用量。例如，对于2:1或3:1比率，可以使用15-20nM的反向引物和5-10nM的正向引物。过量也可以更大，例如可以使用12.5:1至100:1的反向引物与正向引物的比率，例如20:1。这种倾斜的引物比率导致在扩增过程期间正向引物在反向引物之前用尽。因此，最终溶液中的主要产物是由反向引物产生的产物。

显示不对称RPA过程的步骤的图示于图6A中。RPA通过包括逆转录酶以直接从RNA模板产生DNA链而允许使用DNA或RNA模板(图6A中所示的第一步)。如果使用的是DNA模板，则反向链已经存在，因此不需要合成。不对称扩增过程从该反向链开始。

一旦存在反向链，则正向引物与其结合，并且合成正向链(图6A中所示的第二步)。因为正向引物含有通用阵列捕获序列，因此合成的正向链现在在模板序列的5’端处含有通用阵列捕获序列。

在下一步中，反向引物与合成的正向链结合，并且合成反向链(图6A中所示的第三步)。在3’端处，合成了与通用阵列捕获序列互补的系链序列。因此，合成的反向链含有(从3’至5’)系链序列、模板的反向链拷贝、和生物素标记(图6A中所示的产物)。因为反向引物过量使用，所以不对称PCR的结果主要是这种合成的反向链。然后可以将合成的反向链与通用阵列杂交(使用系链序列)，并进行检测(使用生物素)。

反向引物与正向引物的不同比率的测试示于图6B中。在该实施例中，针对HCV靶标设计的引物与一种互补序列缀合。将一种探针(在图6B中虚线矩形指示探针在阵列上的位置)连同BSA-金阳性对照(在图6B中由实心矩形指示)多次打点在阵列上。在阵列上观察到的信号强度随着过量反向引物的量增加而增加。

尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述公开文本，但是实施方式和实施例不应被解读为限制本公开文本的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用以其整体并入。

序列表

<110> 酷商瑞士股份公司

<120> 自组装诊断阵列平台

<130> 70925-20001.40

<140> 尚未分配

<141> 与此一起

<150> US 62/614,313

<151> 2018-01-05

<160> 35

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成构建体

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

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<223> 合成构建体

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atggtcatta cgacgaggat aagc 24

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<212> DNA

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<223> 合成构建体

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gtcaatgact agtttcgagt atag 24

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<212> DNA

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

ttgagtatac tacgatctcg ggtt 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

caacaagtga ccgagctttg gtga 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

agaaatacaa ctaaacgcga tcgc 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

agagcattag acttattcga taaa 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

tgttgcacgt tggggataga ggta 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

tcatatggca aaacggatgg acat 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

ccagtttatc cacggaggct atag 24

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

attcctagga cccctgctcg tgtta 25

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 32

ccccctagaa aattgagaga agtccaccac g 31

<210> 33

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

ttcctaggac ccctgctcgt gttacaggcg gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca 60

ataccgcaga gtctagactc gtggtggact tctctcaatt ttctaggggg 110

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 34

ctcacatcca acaatacagg tcacat 26

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 35

catgagaaat atcacagtaa ttgg 24