用于体液鉴定的方法
阅读说明：本技术 用于体液鉴定的方法 (Method for body fluid identification ) 是由 帕特里夏·阿尔瓦尼 拉谢尔·弗莱明 杰施里·帕特尔 于 2018-10-02 设计创作，主要内容包括：犯罪现场调查人员需要鉴定生物学组织或体液类型。这样的分析通常使用常规化学、血清学和酶学测试进行以鉴定体液或组织,然而,这些测试可能不可靠,并且常常不能满足法医学分析所需的特异性和灵敏度。本发明提供了通过检测特定RNA序列来准确鉴定循环血液、唾液、精子、精液、月经液和阴道物质的方法。特别地,本发明提供了用于确定生物学样品的类型的方法,其包括以下步骤：从所述样品中检测与HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)(L.gass)和卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)(L.crisp)中的任一种或更多种相关的RNA,以及确定所述样品是否是循环血液、唾液、精子、精液、月经液或阴道物质。(Criminal scene investigators need to identify biological tissue or fluid types. Such assays are typically performed using conventional chemical, serological and enzymatic tests to identify body fluids or tissues, however, these tests may be unreliable and often fail to meet the specificity and sensitivity required for forensic analysis. The present invention provides methods for accurately identifying circulating blood, saliva, sperm, semen, menstrual fluid, and vaginal material by detecting specific RNA sequences. In particular, the present invention provides a method for determining the type of a biological sample comprising the steps of: detecting RNA associated with any one or more of HBD, SLC4A1, GYPA, FDCSP, HTN3, STATH, PRM1, TNP1, PRM2, KLK2, MSMB, TGM4, MMP10, STC1, MMP3, MMP11, CYP2B7P, Lactobacillus gasseri (L.gass) and Lactobacillus crispatus (L.crisps) from the sample, and determining whether the sample is circulating blood, saliva, sperm, semen, menstrual fluid or vaginal material.)
相关申请
本申请要求2017年10月2日提交的新西兰临时申请号735997和2018年2月9日提交的新西兰临时申请号739809的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
该技术领域是RNA序列的检测，以及这些序列用于样品(特别是含有降解的RNA的样品)的鉴定和分型的用途。
背景技术
在许多情况下，犯罪现场调查人员会遇到感兴趣的细胞或体液，但需要确定其是什么组织或流体。该信息对于建立案件的活动场景可以是重要的。例如，经血的存在可表明性活动，而循环血液可能是外伤的结果。通常使用常规化学、血清学和酶学测试进行这样的分析以鉴定体液或组织，然而，这些测试可能不可靠，并且通常不能满足法医学分析所需的特异性和灵敏度。
基于细胞和组织中独特基因表达模式的信使RNA(mRNA)分析已成为克服这些局限性的一种方法[1-4]。用于组合的短串联重复序列(short tandem repeat，STR)和体液分析的DNA/RNA共提取现已成为世界各地案件研究实验室使用的有效且全面的工具。然而，自2003年引入差异表达的mRNA用于法医学唾液分析[2]以来，只有一小部分“核心”标志物被用于多重设计。这些包括唾液和口腔黏膜的组蛋白3(HTN3)和唾液蛋白(statherin)(STATH)[1，3，5-7]，***的鱼精蛋白1和2(PRM1/2)[1，3，5-7]，***的转谷氨酰胺酶4(TGM4)或精胶蛋白1(SEMG1)[1，3]，月经液的基质金属肽酶(MMP)7、10或11[1，3，5-7]，以及***物质的人β-防御素1(HBD1)、黏蛋白4(MUC4)或卷曲乳杆菌(Lactobacilli crispatus)(L.crisp)和格氏乳杆菌(Lactobacilli gasseri)(L.gass)[1，3，5-7]。在使用循环血液标志物时观察到更大的可变性。通常靶向的转录物包括血影蛋白β(SPTB)、羟甲基胆碱合酶(PBGD)、5′-氨基乙酰丙酸酯合酶2(ALAS2)、血型糖蛋白A(GYPA)、黏附分子、与CXADR抗原1(AMICA1)的相互作用、CD93分子和血红蛋白β(HBB)[1，3，5-7]。已经提出了其他mRNA标志物，但是与上述标志物相比，其由于特异性和灵敏度较低而较少使用[8-13]。细胞色素P450家族2亚家族B成员7假基因(CYP2B7P)是一个例外，它是用于检测***物质的有用标志物[14]。
准确检测和量化RNA丰度的能力是分子生物学的基本能力。广泛的多种RNA检测方法是目前可用的，从非扩增方法(原位杂交、微阵列和NanoString nCounter)到基于扩增(PCR)的方法(逆转录酶PCR(RT-PCR)和定量逆转录酶PCR(qRT-PCR))。除了RNAseq(下一代测序，也被称为第二代测序或大规模平行测序)外，所有RNA检测技术的关键先决条件是靶RNA序列的现有知识。这种靶向通过寡核苷酸序列在非扩增方法(探针)和基于扩增的方法(引物)两者中得到辅助。
用于PCR引物设计的方法一直在发展[1，2]，但仍然基于特异性、热力学、二级结构、二聚化和扩增子长度的核心标准[3-7]。除了这些标准外，RT-PCR引物设计(用于RNA扩增)还考虑了外显子边界覆盖，以确保仅扩增cDNA并避免扩增基因组DNA[8]。在其他实验因素[9-14]中，普遍认为PCR引物设计对靶扩增、检测和量化具有重要意义[3，8，11，15-18]。
虽然改进引物设计可以改进性能，但也必须考虑靶分子。RNA是不稳定的且容易降解[19-22]。常规方法推荐样品RNA完整性(RNA integrity，RIN)为至少RIN 8或更高，以确保适当的性能[23-26]。RIN值范围为从10(完整)到1(完全降解)。RNA的逐渐降解通过向较短RNA片段的持续移动来反映，RNA片段越短，降解的RNA越多。在这种情况下，较短意味着RNA片段不像未降解的RNA那么长，并且随着时间，RNA片段破碎成越来越小的片段。
此外，在必须分析现实生活的样品——法医学、临床、FFPE和环境取样的情况下，一定程度的降解是不可避免的。RNA降解对RNA检测和量化的不利影响已有详细记载[24，27-30]。除了避免分析降解的RNA外，目前没有明确的解决该问题的方案。
在此，发明人已经建立了用于通过检测特定RNA序列来准确鉴定循环血液、唾液、***、***、月经液和***物质的方法。
本发明的一个目的是提供用于特异性检测未知样品中的组织类型的方法和/或材料和/或至少为公众提供有用的选择。
发明内容
样品分型
在第一方面，本发明提供了对样品进行分型的方法，所述方法包括通过本发明的方法检测样品中RNA序列的步骤，其中检测RNA序列标志物指示样品的类型。
所述方法可以涉及仅使用一对引物或单个探针来对样品进行分型。或者，可以使用多对引物或多个探针。
特别地，本发明提供了用于确定生物学样品的类型的方法，其包括以下步骤：从所述样品中检测与HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P、L.gass和L.crisp中的任一种或更多种相关的RNA，以及确定所述样品是否是循环血液、唾液、***、***、月经液或***物质。
所述方法包括检测生物学样品是否是循环血液，包括检测与HBD、SLC4A1和/或GYPA相关的RNA的步骤。
所述方法包括检测生物学样品是否是唾液，包括检测与FDCSP和/或HTN3和/或STATH相关的RNA的步骤。
所述方法包括检测生物学样品是否是***，包括检测与PRM1、TNP1和/或PRM2相关的RNA的步骤。
该所述方法包括检测生物学样品是否是***，包括检测与KLK2、MSMB和/或TGM4相关的RNA的步骤。
所述方法包括检测生物学样品是否是月经液，包括检测与MMP10和/或STC1和/或MMP3和/或MMP11相关的RNA的步骤。
所述方法包括检测生物学样品是否是***物质，包括检测与CYP2B7P、L.gass和/或L.crisp相关的RNA的步骤。
本发明的方法包括但不限于使用多重PCR。
通过多重PCR进行样品分型
在一个实施方案中，用一种或更多种引物进行多重PCR，其中至少一种对样品的类型具有诊断性。
优选地，所述方法包括使用对HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P、L.gass或L.crisp中的任一种具有特异性的一种或更多种引物，更优选地，引物选自SEQ ID No：20至57中的任何一个。
所述方法包括检测生物学样品是否是循环血液，包括以下步骤：使用SEQ ID No：20和21的引物检测与HBD相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：22和23的引物检测与SLC4A1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：24和25的引物检测与GYPA相关的RNA。
所述方法包括检测生物学样品是否是唾液，包括以下步骤：使用SEQ ID No：26和27的引物检测与FDCSP相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：28和29的引物检测与HTN3相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：30和31的引物检测与STATH相关的RNA。
所述方法包括检测生物学样品是否是***，包括以下步骤：使用SEQ ID No：32和33的引物检测与PRM1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：34和35的引物检测与TNP1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：36和37的引物检测与PRM2相关的RNA。
所述方法包括检测生物学样品是否是***，包括以下步骤：使用SEQ ID No：38和39的引物检测与KLK2相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：40和41的引物检测与MSMB相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：42和43的引物检测与TGM4相关的RNA。
所述方法包括检测生物学样品是否是月经液，包括以下步骤：使用SEQ ID No：44和45的引物检测与MMP10相关的RNA，和/或使用和/或使用SEQ ID No：46和47的引物检测与STC1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：48和49的引物检测与MMP3相关的RNA，和/或使用SEQID No：50和51的引物检测与MMP11相关的RNA。
所述方法包括检测生物学样品是否是***物质，包括以下步骤：使用SEQ ID No：52和53的引物检测与CYP2B7P相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：54和55的引物检测与L.gass相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：56和57的引物检测与L.crisp相关的RNA。
引物
在另一个实施方案中，本发明提供了能够与RNA序列的稳定区域或对应于稳定区域的cDNA或其互补序列杂交的引物。
在另一个实施方案中，本发明提供了引物，其包含与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的任何部分具有至少70％同一性的至少5个核苷酸的序列。
在另一个实施方案中，引物由与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列具有至少70％同一性的至少5个核苷酸的序列组成。
在另一个实施方案中，引物包含SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少5个核苷酸的序列。
在另一个实施方案中，引物由SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少5个核苷酸的序列组成。
在另一个实施方案中，引物包含选自包含SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：57或其任何一个的互补序列的组的序列。
在另一个实施方案中，引物由选自包含SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：57或其任何一个的互补序列的组的序列组成。
在另一个实施方案中，引物选自包含SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：57或其任何一个的互补序列的组。
在另一个实施方案中，引物包含连接的标记或标签。
在另一个实施方案中，标记或标签引物不存在于自然界中。
本发明的引物可用于微阵列或芯片或类似产品，以用于检测RNA序列。
引物试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的至少一种引物的试剂盒。
优选地，试剂盒包含选自以下的至少一个引物对：SEQ ID No：20和21、22和23、24和25、26和27、28和29、30和31、32和33、34和35、36和37、38和39、40和41、42和43、44和45、46和47、48和49、50和51、52和53、54和55、以及56和57。
在一个实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
探针
在另一个实施方案中，本发明提供了能够与RNA序列或相应的cDNA或其互补序列杂交的探针。优选地，探针能够与HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、CYP2B7P、L.gass和L.crisp中的任一种杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了探针，其包含与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的任何部分具有至少70％同一性的至少10个核苷酸的序列。
在另一个实施方案中，探针由与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列具有至少70％同一性的至少10个核苷酸的序列组成。
在另一个实施方案中，探针包含SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少10个核苷酸的序列。
在另一个实施方案中，探针由SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少10个核苷酸的序列组成。
在另一个实施方案中，探针包含连接的标记或标签。
在另一个实施方案中，标记或标签探针不存在于自然界中。
本发明的引物可用于微阵列或芯片或类似产品，以用于检测RNA序列。
探针试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的至少一种探针的试剂盒。
优选地，试剂盒包含至少2种，更优选至少3种，更优选至少4种，更优选至少5种，更优选至少6种，更优选至少7种，更优选至少8种，更优选至少9种，更优选至少10种，更优选至少11种，更优选至少12种，更优选至少13种，更优选至少14种，更优选至少15种，更优选至少16种，更优选至少17种，更优选至少18种，更优选至少19种，更优选至少20种，更优选至少21种，更优选至少22种，更优选至少23种，更优选至少24种，更优选至少25种，更优选至少26种，更优选至少27种，更优选至少28种，更优选至少29种，更优选至少30种探针，更优选至少31种探针，更优选至少32种探针，更优选至少33种探针，更优选至少34种，更优选至少35种，更优选至少36种，更优选至少37种，更优选至少30种本发明的探针。
在一个实施方案中，试剂盒还包含使用说明书。
微阵列
在另一方面，本发明提供了微阵列，其包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19中任一个的序列或其互补序列的任何部分具有至少70％同一性的至少5个核苷酸的序列。
在另一方面，本发明提供了微阵列，其包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19中任一个的序列或其互补序列的至少5个核苷酸的序列。
在另一方面，本发明提供了微阵列，其包含与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：19中任一个的序列或其互补序列的任何部分具有至少70％同一性的序列的至少10个核苷酸的序列。
在另一方面，本发明提供了微阵列，其包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：95中任一个的序列或其互补序列的至少19个核苷酸的序列。
优选地，序列包含本发明序列的以下个核苷酸：至少5个，更优选至少10个，更优选至少15个，更优选至少20个，更优选至少25个，更优选至少30个，更优选至少35个，更优选至少40个，更优选至少45个，更优选至少50个，更优选至少55个，更优选至少60个，更优选至少65个，更优选至少70个，更优选至少75个，更优选至少80个，更优选至少85个，更优选至少90个，更优选至少95个，更优选至少100个，更优选至少120个，更优选至少140个，更优选至少160个，更优选至少180个，更优选至少200个，更优选至少240个，更优选至少250个。
本领域技术人员会理解如何基于序列表中以及说明书其他位置中的信息来选择合适的探针或引物以检测任何列出的标志物。
本领域技术人员理解可以产生可与稳定区域的任何部分杂交的探针或引物。本文提及的探针和引物仅作为实例给出，以证明稳定区域可用于降解的RNA的鉴定和分型。与稳定区域互补的任何引物或探针都适用于本发明的方法。
因此，本发明提供了：
1.用于确定生物学样品的类型的方法，其包括以下步骤：从所述样品中检测与HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P、格氏乳杆菌(L.gass)和卷曲乳杆菌(L.crisp)中的任一种或更多种相关的RNA，以及确定所述样品是否是循环血液、唾液、***、***、月经液或***物质。
2.根据1所述的方法，其包括检测与SEQ ID No：1至19中的一个或更多个相关的RNA。
3.根据1或2所述的方法，其中检测所述RNA的步骤包括使用对HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P、格氏乳杆菌(L.gass)和卷曲乳杆菌(L.crisp)中的任一种或更多种具有特异性的一种或更多种引物。
4.根据3所述的方法，其中所述一种或更多种引物选自SEQ ID No：20至57。
5.根据1至4中任一项所述的方法，其包括确定所述生物学样品是否是循环血液，包括以下步骤：使用SEQ ID No：20和21的引物检测与HBD相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：22和23的引物检测与SLC4A1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：24和25的引物检测与GYPA相关的RNA。
6.根据1至4中任一项所述的方法，其包括确定所述生物学样品是否是唾液，包括以下步骤：使用SEQ ID No：26和27的引物检测与FDCSP相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：28和29的引物检测与HTN3相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：30和31的引物检测与STATH相关的RNA。
7.根据1至4中任一项所述的方法，其包括确定所述生物学样品是否是***，包括以下步骤：使用SEQ ID No：32和33的引物检测与PRM1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：34和35的引物检测与TNP1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：36和37的引物检测与PRM2相关的RNA。
8.根据1至4中任一项所述的方法，其包括确定所述生物学样品是否是***，包括以下步骤：使用SEQ ID No：38和39的引物检测与KLK2相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：40和41的引物检测与MSMB相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：42和43的引物检测与TGM4相关的RNA。
9.根据1至4中任一项所述的方法，其包括确定所述生物学样品是否是月经液，包括以下步骤：使用SEQ ID No：44和45的引物检测与MMP10相关的RNA，和/或使用和/或使用SEQ ID No：46和47的引物检测与STC1相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：48和49的引物检测与MMP3相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：50和51的引物检测与MMP11相关的RNA。
10.根据1至4中任一项所述的方法，其包括确定所述生物学样品是否是***物质，包括以下步骤：使用SEQ ID No：52和53的引物检测与CYP2B7P相关的RNA，和/或使用SEQ IDNo：54和55的引物检测与L.gass相关的RNA，和/或使用SEQ ID No：56和57的引物检测与L.crisp相关的RNA。
11.根据1至10中任一项所述的方法，其包括测试所述生物学样品中HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、TGM4、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P、格氏乳杆菌(L.gass)和卷曲乳杆菌(L.crisp)中全部的RNA的存在。
12.根据1至11中任一项所述的方法，其包括检测HTN3和FDCSP；和/或SLC4A1、HBD、STC1和MMP10和/或TNP1、PRM1、KLK2、MSMB和CYP2B7中任一种或更多种的RNA的存在。
13.根据1至12中任一项所述的方法，其中所述引物是被标记的。
14.根据13所述的方法，其中所述引物是用荧光标记物、生物素、放射性或非放射性标记物标记的。
15.根据1至14中任一项所述的方法，其中使用扩增方法检测所述RNA。
16.根据15所述的方法，其中所述扩增方法选自包括以下的组：聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、多重PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)或定量PCR(Q-PCR)。
17.用于1至16中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含选自以下的至少一个引物对：SEQ ID No：20和21、22和23、24和25、26和27、28和29、30和31、32和33、34和35、36和37、38和39、40和41、42和43、44和45、46和47、48和49、50和51、52和53、54和55、以及56和57。
本领域技术人员会理解标记基因、由标记基因编码的mRNA和mRNA内的稳定区域之间的关系。本领域技术人员会理解给出序列是对应于mRNA或mRNA内的稳定区域的DNA序列。
具体实施方式
在本说明书中已经参考了一些专利说明书、其他外部文件或其他信息来源，这通常是为了提供用于讨论本发明特征的背景。除非另外特别说明，否则对这些外部文件的参考不应被解释为承认在任何法域中这些文件或这些信息来源是现有技术，或者构成本领域公知常识的一部分。
本说明书和权利要求中使用的术语“包含”表示“至少部分地由......组成”；也就是说，当解释本说明书和权利要求中包括“包含”的陈述时，在每个陈述中由该术语开头的特征都需要存在，但是也可以存在其他特征。诸如“包括”和“含有”的相关术语将以类似的方式解释。然而，在一些优选的实施方案中，包含可以用由......组成代替。
如本文所用，术语“RNA”意指信使RNA、小RNA、微小RNA、非编码RNA、长非编码RNA、小非编码RNA、核糖体RNA、小核仁RNA、转移RNA以及所有其他RNA种类和序列。
如本文所用，术语“稳定区域”是指RNA序列中的一个区域或一些区域，其比相同RNA序列的另一个区域或一些区域具有更多比对的测序读段。
如本文所用，术语“降解的RNA”是指不再完整的RNA。换言之，在序列数据库中注释或预测的理论全长RNA不再完整。全长RNA可以是片段化的和/或一些核苷酸不再存在。这可能发生在沿RNA序列的任何位置。
发明人强调，如何测量RNA降解的水平不是必需的，并且本发明在于所述方法还适用于可能存在一定程度降解的RNA的样品。
本发明人已经确定了鉴定生物学样品的类型的方法，目的是所述方法可以用于鉴定在法医学情况下获得的生物学样品。特别地，所述方法可以用于确定给定的生物学样品是否是循环血液、唾液、***、***、月经液或***物质。
本发明包括确定本已被发明人鉴定为对循环血液、唾液、***、***、月经液和/或***物质具有特异性的标志物的RNA的存在。如表1所示，为了鉴定循环血液，可以使用标志物HBD和/或SLC4A1和/或GYPA；对于唾液，可以使用标志物FDCSP和/或HTN3；对于***，可以使用标志物PRM1和/或TNP1和/或PRM2；对于***，可以使用标志物KLK2和/或MSMB和/或TGM4；对于月经液，可以使用标志物MMP10、MMP3和/或STC1；并且对于***物质，可以使用标志物CYP2B7P和/或L.gass和/或L.crisp。
应当理解，可以使用特定类型特异性的单一标志物或标志物对来测试给定样品是否是该类型。替代地，可以使用一种特定标志物或特定标志物对来确定给定样品是否是一种或两种或更多种类型。本发明还可用于在样品中测试所有标志物HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、PRM1、TNP1、PRM2、KLK2，TGM4、MSMB、MMP10、STC1、MMP3、CYP2B7P、L.gass和L.crisp的RNA的存在，以确定样品是否是循环血液、唾液、***、***、月经液和/或***物质。
然后，本发明的方法涉及产生靶向mRNA或mRNA中的稳定区域的探针或引物。所述方法允许改进对这样的RNA序列的检测，特别是在其中RNA是或已经经历降解的样品中。
表1.
1.标记物(示出的)是任选的
RNA降解
虽然改进引物或探针设计可以在扩增和杂交方法中产生性能改进，但也必须考虑靶分子。RNA是不稳定的且容易降解[40-43]。常规方法推荐样品RNA完整性(RIN)为至少RIN8或更高，以确保适当的性能[44-47]。
RNA序列降解的其他测量是已知的，例如DV200[63]。
然而，本领域技术人员理解，如何测量RNA降解的水平不是必需的，并且本发明在于检测降解的RNA的能力。
在必须分析现实生活的样品——例如法医学、临床、***固定石蜡包埋的(FFPE)和环境样品的情况下，一定程度的降解是不可避免的。RNA降解对RNA检测和量化的不利影响已有详细记载[45，48-51]。
本发明的方法和材料使得能够改进对目的RNA序列的检测，特别是当RNA样品已经降解时。这使得能够对包含降解的RNA的样品(包括RIN值小于8的样品)进行分型。这特别出乎意料，因为在本发明之前通常认为不能以可接受的性能值实现对RIN小于8的降解的RNA序列的检测和分型。
RIN值范围为从10(完整)到1(完全降解)。RNA的逐渐降解通过向较短RNA片段的持续移动来反映，RNA片段越短，降解的RNA越多。当RIN值小于1时，这表示RNA降解超出检测。
本发明人发现，虽然本发明的探针和引物可用于对包含RIN值小于8的RNA的降解RNA来源进行检测和分型，但本发明的探针和引物也可用于对RIN值为8-10的RNA来源进行检测和分型。即，本发明的引物和探针也使得能够进行RNA的检测和分型，而与RIN值无关。
在一个实施方案中，当RNA完整性(RIN)小于RIN 8，更优选小于RIN 7，更优选小于RIN 6，更优选小于RIN 5，更优选小于RIN 4，更优选小于RIN 3，更优选小于RIN 2，更优选小于1时，本发明的方法起作用或使得能够进行RNA标志物检测。发明人还发现本发明的方法可用于对RIN未确定(超出检测)的RNA进行分型。
特别地，本发明人已经开发了对于循环血液、唾液、***、***、月经液和***物质特异性的19种标志物HBD、SLC4A1、GYPA、FDCSP、HTN3、STATH、PRM1、TGM4、TNP1、PRM2、KLK2、MSMB、MMP10、STC1、MMP3、MMP11、CYP2B7P.L.gass或L.crisp的区域具有特异性的一组引物，其允许鉴定可能经历一定程度的RNA降解的样品。表1概述了相应的引物。
RNA检测方法
将理解的是，在本发明中可以使用任何合适的检测RNA的方法。许多方法是本领域已知的，并且可以用于鉴定生物学样品的来源。
目前可用广泛多种RNA检测方法，从非扩增方法(原位杂交、微阵列和NanoStringnCounter)到基于扩增(PCR)的方法(逆转录酶PCR(RT-PCR)和定量逆转录酶PCR(qRT-PCR))、下一代测序(大规模平行测序/高通量测序)和RNA适配体。
原位杂交
原位杂交(ISH)是一种这样类型的杂交，其在组织的一部分或部分中(原位)，或者如果组织足够小(例如，植物种子、果蝇胚胎)则在整个组织(整装ISH(whole mount ISH))中，在细胞中，以及在循环肿瘤细胞(CTC)中，使用标记的互补DNA或RNA链(即探针)定位特定DNA或RNA序列。这与通常在组织切片中定位蛋白质的免疫组织化学不同。
原位杂交是用于鉴定组织切片中单个细胞内特定mRNA种类的强大技术，提供了对生理过程和疾病发病机理的了解。然而，原位杂交需要采取许多步骤，对所检查的每个组织和所使用的每种探针进行精确优化。为了保持组织内的靶mRNA，通常需要使用交联固定剂(例如甲醛)。
在ISH实验中靶RNA的降解是一个问题。本发明的方法通过靶向目的靶RNA内的稳定区域来提供对该问题的解决方案。
微阵列
DNA微阵列(通常也称为DNA芯片或生物芯片)是连接于固体表面的微观DNA斑点的集合。科学家们使用DNA微阵列同时测量大量基因的表达水平，或者对基因组的多个区域进行基因分型。每个DNA斑点含有皮摩尔(10-12摩尔)的特定DNA序列，称为探针(或报告分子或寡核苷酸)。这些可以是基因或其他DNA元件的短部分，其用于在高严格条件下与cDNA或cRNA(也称为反义RNA)样品(称为靶标)杂交。通常通过检测荧光团、银或化学发光标记的靶来检测和定量探针-靶杂交，以确定靶中核酸序列的相对丰度。
本发明可用于组织(包括经受降解的组织)的微阵列分析。通过设计包含在微阵列芯片上的靶向RNA的稳定区域(根据本发明)的探针，微阵列分析可以提供体内表达谱的更真实的表示，其在从组织样品提取RNA之后不会因降解而偏差。此类芯片还能够用于筛选含有RNA(包括降解的RNA)的样品，以如前所述对RNA的来源进行分型。
NanoString nCounter
NanoString的nCounter技术是DNA微阵列的一种变体，由Krassen Dimitrov和Dwayne Dunaway发明并获得专利。其使用分子“条形码”和显微镜成像在一次杂交反应中检测和计数多达数百种独特的RNA。每个颜色编码的条形码连接于对应于目的基因的单个靶特异性探针。
NanoString方案包括以下步骤：
●杂交：NanoString的技术使用在溶液中杂交的每种mRNA两种～50个碱基探针。报告探针携带信号，而捕获探针允许固定复合物以用于数据收集。
●纯化和固定：杂交后，除去过量的探针，将探针/靶复合物比对并固定在nCounter盒中。
●数据收集：将样品盒放置在数字分析仪器中以进行数据收集。对于每种靶分子，对盒表面上的颜色代码进行计数并列表。
nCounter分析系统：该系统由两个仪器组成：Prep Station，其是固定CodeSet复合物以进行数据收集的自动化流体仪器，以及Digital Analyzer，其通过对荧光条形码进行计数来获取数据。由于NanoString nCounter系统依赖探针-靶杂交用于RNA检测和分析，本发明可立即应用于NanoString nCounter。NanoString nCounter探针设计(靶杂交位点)旨在设计成符合某些热力学要求，并且不考虑靶RNA降解或稳定性。因此，我们相信通过本发明，通过设计探针以与RNA序列中的稳定区域杂交，可以极大地改进NanoStringnCounter RNA检测。
样品
样品可以是包含RNA的任何类型的生物学样品。
适于原位杂交的样品包括生物学组织切片。
优选地，法医学样品选自包含血液、***(有或没有***)、唾液、***物质和月经液的组。
RNA提取
RNA提取程序是本领域技术人员公知的。实例包括：酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿RNA提取[64]；基于磁珠的RNA提取[65]；基于柱的RNA纯化[66，67]；和TRIzol(TRI试剂)RNA提取[68]。
RNA测序和稳定区域鉴定
RNA测序是对样品中的所有RNA进行测序，其使用通常称为下一代测序(NGS)的测序(第二代测序或大规模平行测序；[69-72])。尽管不同的测序仪器制造商采用略微不同的测序化学，但可以使用任何这些NGS(大规模平行测序)技术实现RNA测序[69，73]。由于有许多NGS技术可供使用，因此RNA测序方法存在细微差别。以下是如何使用NGS进行RNA测序的一般性描述[70]：
●使用常用的RNA提取方法从目的样品中提取总RNA。提取后处理可用于富集RNA样品。
●然后使用提取的RNA合成互补DNA(cDNA)。然后将cDNA用作RNA测序的模板。
●NGS使用合成测序(SBS)化学的变体[74]。以cDNA为模板，逐碱基合成新的核苷酸片段(称为读段(reads))，在测序过程中记录每个引入的碱基[74]。
●RNA测序的数据输出是产生的所有读段及其序列的列表[74，70]。对该数据进行质量评估[75]。对于RNA测序，然后使用剪接感知序列比对算法将测序读段与参照基因组比对[76]。
然后可以使用任何基因组浏览器或序列查看软件将比对可视化。通过观察沿目的RNA的测序读段比对来鉴定RNA稳定区域。沿着RNA序列的具有更多比对读段的区域(高读段覆盖率)被认为是稳定区域。
稳定区域
根据本发明的RNA序列的稳定区域是任何给定RNA序列内的区域，RNA测序数据示出其与相同RNA序列的至少一个其他区域相比产生更多比对的测序读段。
基于PCR的方法
基于PCR的方法特别优选用于检测本发明方法中的RNA序列。
一般PCR方法是本领域技术人员公知的[77]。基本PCR方法的多种其他发展也可以有利地应用于本发明的方法。下面简要讨论实例。
多重PCR
多重PCR在单个PCR反应中利用多个引物组以产生对不同靶RNA、cDNA或DNA序列特异的不同大小的扩增产物(扩增子)。通过一次靶向多个序列，可以从单个反应获得诊断信息，否则将需要数倍的试剂和更多的时间来执行。退火温度和引物组通常被优化以在单一反应中工作，并产生不同的扩增子大小。也就是说，当通过凝胶电泳或毛细管电泳观察时，扩增子应形成不同的条带。多重PCR可用于本发明的方法中，以区分其在单个样品或反应中应用的样品类型。
MLPA
多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)(US 6,955,901)是多重聚合酶链式反应的变体，其允许仅用单个引物对扩增多个靶标。每个探针由识别DNA上的相邻靶位点的两个寡核苷酸组成。一个探针寡核苷酸含有正向引物识别的序列，另一个探针寡核苷酸含有反向引物识别的序列。只有当这两种探针寡核苷酸与其各自的靶标杂交时，它们才能连接成完整的探针。将探针分开成两部分的优点是仅扩增连接的寡核苷酸，而不扩增未结合的探针寡核苷酸。如果探针没有以这种方式分开，则任一端的引物序列都会使探针扩增而无论它们是否与模板DNA杂交。每个完整的探针具有独特的长度，因此可以分离和鉴定其产生的扩增子(例如通过毛细管电泳和其他方法)。由于用于探针扩增的正向引物是荧光标记的，每个扩增子产生可以通过毛细管测序仪检测的荧光峰。将在给定样品上获得的峰样式与在多种参照样品上获得的峰样式测量进行比较，可以确定每种扩增子的存在或不存在(或相对量)。这然后表明样品DNA中存在的靶序列的存在或不存在(或相对量)。也可以使用凝胶电泳或微流体系统如ShimadzuMultiNA检测产物。使用参照样品来确定是否存在是相同的。有关MLPA的更多信息可在万维网http：//www.mlpa.com获得。可以通过本领域技术人员已知的方法将MLPA探针合成为寡核苷酸。MLPA探针和试剂可以由HRC-Holland(http：//www.mlpa.com)商业生产和购买。
定量PCR
定量PCR(Q-PCR)用于测量PCR产物的量(通常是实时的)。Q-PCR定量测量DNA、cDNA或RNA的起始量。Q-PCR通常用于确定样品中是否存在DNA序列以及其在样品中的拷贝数。定量实时PCR具有非常高的精确度。Q-PCR方法使用荧光染料(例如SYBR Green、EvaGreen)或含有荧光团的DNA探针(例如TaqMan)来实时测量扩增产物的量。Q-PCR有时缩写为RT-PCR(实时PCR)或RQ-PCR、QRT-PCR或RTQ-PCR。
引物
术语“引物”是指与模板杂交并用于引发与模板互补的多核苷酸的聚合的短多核苷酸，其通常具有游离3′OH基团。这样的引物的长度优选为至少5个、更优选至少6个、更优选至少7个、更优选至少8个、更优选至少9个、更优选至少10个、更优选至少11个、更优选至少12个、更优选至少13个、更优选至少14个、更优选至少15个、更优选至少16个、更优选至少17个、更优选至少18个、更优选至少19个、更优选至少20个核苷酸。
在用于扩增RNA标志物序列的常规引物设计中，通常设计引物以覆盖外显子边界，以防止基因组DNA的扩增。
本发明涉及靶向RNA转录物的稳定区域，其在从降解的样品中扩增标志物时特别有用。明显的是，一旦鉴定出稳定区域，该区域可用于对含有RIN值为8至10以及低于8的RNA的样品进行分型。因此，这两种选择形成本发明的一部分。
在一个实施方案中，用于本发明方法的本发明的引物不跨越外显子边界。
尽管不是优选的，但在一个实施方案中，用于本发明方法的本发明的引物可以跨越外显子边界。
引物的标记
用于标记引物的方法是本领域技术人员公知的，包括：
引物可以被酶促标记[78]或化学标记(包括自动化固相化学合成；[79])。
引物可以用以下进行标记：荧光标记物(荧光团，[80])、生物素[81]、或放射性和非放射性标记物(例如地高辛)[82]。
用这些方法标记的引物构成本发明的一部分。
基于探针的方法
可以将基于探针的方法应用于本发明方法中以检测RNA序列。使探针与靶核酸序列杂交的方法是本领域技术人员公知的[83]。
基于探针的方法包括原位杂交。
术语“探针”是指在基于杂交的测定中用于检测与探针至少部分互补的多核苷酸序列的短多核苷酸。探针可以由如本文定义的多核苷酸的“片段”组成。优选地，这样的探针的长度为至少10个、更优选至少20个、更优选至少30个、更优选至少40个、更优选至少50个、更优选至少100个、更优选至少200个、更优选至少300个、更优选至少400个并且最优选至少500个核苷酸。
探针的标记
用于标记探针的方法是本领域技术人员公知的，并且包括：
探针可以被酶促标记[83，78]或化学标记(包括自动化固相化学合成)[79]。
探针可以是：
分子导标[84]、TaqMan[80]、Scorpion[85]、原位杂交探针[86]、放射性和非放射性[87，82]。
通过这些方法标记的探针构成本发明的一部分。
多核苷酸
如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度但优选至少5个核苷酸的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且作为非限制性实例包括以下：基因的编码和非编码序列、有义和反义序列互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列，及其片段。在一个实施方案中，分离核酸，使其与其正常细胞环境分离。术语“核酸”可与“多核苷酸”互换使用。
用于提取核酸的方法
用于提取核酸的方法是本领域技术人员公知的[83]。
如实施例部分所讨论的，可以根据样品类型任选地应用专门的提取程序。例如，可以使用DNA-RNA共提取方法提取来自法医学类型样品的RNA，如Bowden等2011年所述[88]。
所有这些方法都旨在包括在本发明的范围内。
百分比同一性
变体多核苷酸序列优选表现出与指定多核苷酸序列至少70％、更优选至少71％、更优选至少72％、更优选至少73％、更优选至少74％、更优选至少75％、更优选至少76％、更优选至少77％、更优选至少78％、更优选至少79％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、并且最优选至少99％的同一性。在指定多核苷酸序列的至少10个核苷酸位置、更优选至少11个核苷酸位置、更优选至少12个核苷酸位置、更优选至少13个核苷酸位置、更优选至少14个核苷酸位置、更优选至少15个核苷酸位置、更优选至少16个核苷酸位置、更优选至少17个核苷酸位置、更优选至少18个核苷酸位置、更优选至少19个核苷酸位置、更优选至少20个核苷酸位置、更优选至少21个核苷酸位置并且最优选整个长度的比较窗上确定同一性。本发明包括这些变体。
多核苷酸序列同一性可以以下列方式确定。使用可从NCBI(ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的bl2seq[89]中的BLASTN(来自BLAST程序套件，版本2.2.5[2002年11月])将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较。除了应关闭低复杂度部分的过滤之外，使用bl2seq的默认参数。
可以使用以下unix命令行参数检查多核苷酸序列的同一性：
bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F-p blastn
参数-F关闭低复杂度部分的过滤。参数-p为序列对选择适当的算法。bl2seq程序将序列同一性报告为行“Identities＝”中相同核苷酸的数量和百分比二者。
还可以使用全局序列比对程序(例如Needleman-Wunsch；[90])在候选多核苷酸序列和主题多核苷酸序列之间的重叠的整个长度上计算多核苷酸序列同一性。在可从http：//www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/获得的EMBOSS包[91]的needle程序中找到Needleman-Wunsch全局比对算法的完整实现。欧洲生物信息学研究所服务器还在http：/www.ebi.ac.uk/emboss/align/在线提供了执行两个序列之间的EMBOSS-needle全局比对的工具。
或者，可以使用GAP程序来计算序列同一性，该程序计算两个序列的最佳全局比对而不对末端缺口罚分(penalizing)[92]。
序列同一性也可以通过使用Vector NTI 9.0版比对待比较的序列来计算，其使用Clustal W算法[93]，然后使用Vector NTI 9.0版(2003年9月2日1994-2003 InforMax，授权给Invitrogen)计算比对的序列之间的百分比序列同一性。
因此，一般而言，本发明提供了用于检测样品中RNA序列的方法。所述方法包括以下步骤：
a)提供样品，以及
b)使用与RNA序列的稳定区域互补的至少一种引物或探针检测RNA序列。
RNA序列的稳定区域优选使用样品的RNA测序来鉴定，并且特别地，鉴定为RNA序列中比相同RNA序列的另一个区域或一些区域具有更多比对的测序读段的区域。
本文已经鉴定和讨论了稳定区域，并且用于本发明方法的稳定区域可以选自包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19或其任一个的互补序列的组。
本文还鉴定和讨论了引物，并且引物可选自包含SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：57或其任一个的互补序列的组。
另外，在更具体的情况下，可以看出本发明包括与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19或其互补序列的序列具有至少70％同一性的包含至少5个核苷酸的核苷酸序列。
此外，并且再一次在更具体的情况下，可以看出本发明包括包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19或其互补序列的序列的至少5个核苷酸的核苷酸序列。
此外，并且再一次在更具体的情况下，可以看出本发明包括与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19或其互补序列的序列具有至少70％的同一性的包含至少10个核苷酸的核苷酸序列。
此外，并且再一次在更具体的情况下，可以看出本发明包括包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19或其互补序列之序列的至少10个核苷酸的核苷酸序列。
此外，并且再一次在更具体的情况下，可以看出本发明包括选自SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：57中任一个的核苷酸序列。
如上定义的核苷酸序列在包含RNA的样品的分型中的用途特别构成本发明的一部分。
明显的是，包含RNA的样品可以从多种来源获得。最优选的样品是生物学组织样品，其可以是固体或液体。
本发明的方法特别适用于法医学领域，因此样品可以是包含RNA的任何类型的法医学样品，例如选自包含血液、***(有或没有***)、唾液、***物质和月经液的组。
优选在检测步骤之前从样品中提取RNA，并且如本领域技术人员已知的，可以直接或间接检测RNA序列。然而，优选地通过检测对应于RNA序列的互补DNA(cDNA)间接检测RNA序列。
在更具体的情况下，还可以看出本发明包括对包含RNA的样品进行分型的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供包含RNA的样品；
b)使用与RNA的一个或更多个稳定区域互补的至少一种引物或探针检测样品中的一个或更多个RNA序列；
其中所述稳定的RNA序列对于样品类型是特异性的；并且
其中检测稳定的RNA序列表明样品的类型。
在另一种情况下，可以看出本发明包括对包含降解的RNA的样品进行分型的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含降解的RNA的样品；
b)使用与降解的RNA的一个或更多个稳定区域互补的至少一种引物或探针检测样品中的一个或更多个稳定的RNA序列；
其中所述稳定的RNA序列对于样品的类型是特异性的；并且
其中检测靶RNA序列表明样品的类型。
在另一个实施方案中，本发明可以是用于鉴定样品中RNA的稳定区域的方法，所述方法包括：
a)提供包含RNA的样品，
b)从样品中分离总RNA，
c)从样品中除去DNA，
d)产生与样品中RNA互补的cDNA，
e)对cDNA进行测序。
其中RNA序列的稳定区域鉴定为RNA序列中比相同RNA序列的另一个区域或一些区域具有更多比对的测序读段的区域。
如前所述，该方法可以应用于已经降解至一定条件的RNA，所述条件先前被认为不可用作对提取RNA的样品的来源进行分型/鉴定的手段。本发明的方法可用于对其中RNA内容物具有小于8的RIN值的样品的来源进行分型/鉴定。由于具有小于8的值的RNA中的稳定区域也将存在于RIN值为8至10的RNA中，所以一旦鉴定了稳定区域，那些稳定区域也可用于对RIN为8至10的样品的来源进行鉴定/分型。因此，该方法可用于对具有任何RIN值的样品(包括无法确定RIN值的样品)的来源进行分型/鉴定。
如前所述，RNA序列的稳定区域可以被鉴定为RNA序列中的比相同RNA序列的另一个区域或一些区域具有更多比对的测序读段的区域。
对于技术人员明显的是，优选使用引物或探针检测RNA序列。同样明显的是，如果合适/需要，可以使用多于一种引物或探针(例如两种引物)检测RNA序列。
引物和/或探针优选应该对应于从样品中提取的RNA稳定区域内的序列，或与该序列互补，或能够与该序列杂交。引物用于扩增与引物结合的稳定区域的一部分，例如通过聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法可选自标准PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)和定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)。
另外，并且对于技术人员而言也是明显的是，可以使用探针检测RNA序列。这优选对应于从样品中提取的RNA稳定区域内的序列，或与该序列互补。
RNA序列可以由对样品类型特异的标志物基因编码。也就是说，样品中RNA序列的表达或RNA序列的存在是对样品类型的诊断。例如，当样品是循环血液时，标志物基因选自：
●血红蛋白δ(HBD)，和/或
●溶质载体家族4(阴离子交族蛋白)，成员1(Diego血型)(SLC4A1)，
●血型糖蛋白A(GYPA)。
当样品包含唾液时，标志物基因选自：
●滤泡树突状细胞分泌蛋白(FDCSP)，和/或
●组蛋白3(HTN3)
●唾液蛋白(STATH)。
当样品包含***时，标志物基因选自：
●鱼精蛋白1(PRM1)，和/或
●过渡蛋白1(在组蛋白替换为鱼精蛋白期间)(TNP1)和/或
●鱼精蛋白2(PRM2)。
当样品是***时，标志物基因选自：
●激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)，和/或
●微精原蛋白β(MSMB)和/或
●转谷氨酰胺酶4(TGM4)。
当样品是月经液时，标志物基因选自：
●基质金属肽酶10(MMP10)，和/或
●斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)，和/或
●基质金属肽酶3(MMP3)
●基质金属肽酶11(MMP11)。
当样品是***物质时，标志物基因选自：
●细胞色素P450家族2亚家族B成员7(CYP2B7P)和/或
●卷曲乳杆菌蛋白(L.gass)和/或
●格氏乳杆菌蛋白(L.crisp)。
本发明的检测方法可包括使用能够与RNA序列的稳定区域或对应于稳定区域的cDNA或其互补序列杂交的引物或探针。该方法可以包括使用仅一对引物或单个探针来对样品进行分型。或者，可以使用多对引物或多个探针。
引物或探针可包含(i)与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的任何部分具有至少70％同一性的至少5个核苷酸的序列，或(ii)与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列具有至少70％同一性的至少5个核苷酸的序列，或(iii)SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少5个核苷酸的序列，或(iv)SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少5个核苷酸的序列，或(v)选自序列SEQ ID NO：20至57中任一个的序列，或(vi)连接至选自这些序列中任一个的序列的标记物或标签。
引物或探针可包含(i)与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的任何部分具有至少70％同一性的至少10个核苷酸的序列，或(ii)与SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列具有至少70％同一性的至少10个核苷酸的序列，或(iii)SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少10个核苷酸的序列，或(iv)SEQ ID NO：1至19中任一个的序列或其互补序列的至少10个核苷酸的序列，或(v)选自序列SEQ ID NO：20至57中任一个的序列，或(vi)连接至选自这些序列中任一个的序列的标记物或标签。
举例来说，可以使用以多种引物进行的多重PCR进行样品的分型，其中至少一种引物诊断样品的类型。
优选使用至少4种、更优选至少5种、更优选至少6种、更优选至少7种、更优选至少8种、更优选至少9种、更优选至少10种、更优选至少11种、更优选至少12种、更优选至少13种、更优选至少14种、更优选至少15种、更优选至少16种、更优选至少17种、更优选至少18种、更优选至少19种、更优选至少20种、更优选至少21种、更优选至少22种、更优选至少23种、更优选至少24种、更优选至少25种、更优选至少26种、更优选至少27种、更优选至少28种、更优选至少29种、更优选至少30种、更优选至少31种、更优选至少32种、更优选至少33种、更优选至少34种、更优选至少35种、更优选至少36种、更优选至少37种、更优选至少38种本发明的引物进行多重PCR。
本发明还允许提供包含至少一种根据本发明的引物或探针的试剂盒。这样的试剂盒可以包含任何数量的引物或探针，特别地试剂盒可包含至少2种、更优选至少3种、更优选至少4种、更优选至少5种、更优选至少6种、更优选至少7种、更优选至少8种、更优选至少9种、更优选至少10种、更优选至少11种、更优选至少12种、更优选至少13种、更优选至少14种、更优选至少15种、更优选至少16种、更优选至少17种、更优选至少18种、更优选至少19种、更优选至少20种、更优选至少21种、更优选至少22种、更优选至少23种、更优选至少24种、更优选至少25种、更优选至少26种、更优选至少27种、更优选至少28种、更优选至少29种、更优选至少30种、更优选至少31种、更优选至少32种、更优选至少33种、更优选至少34种、更优选至少35种、更优选至少36种、更优选至少37种、更优选至少38种本发明的引物或探针。引物和探针的组合也可以在这样的试剂盒中提供。
明显的是，该试剂盒还应包含使用说明书(如果需要这样的使用说明书的话)。
本发明还允许提供微阵列或芯片或类似产品，其包含本文已经鉴定为可用于对样品进行分型/鉴定的RNA的稳定区域的序列或其互补序列。这些序列已用于产生可用于微阵列或芯片或类似产品的引物和探针，以用于检测核苷酸序列。
这种微阵列或芯片具有特别的商业重要性，因为它们使得能够有效和准确地鉴定包含RNA的未知样品，包括RNA已降解的情况。一旦这些产品具有本发明的知识的益处，也就可以在本领域技术人员的能力范围内产生这些产品。
附图说明
图1.HBD、SLC4A1、TNP1、KLK2、MMP3和STC1的表达模式。每种体液的6个样品进行扩增；BL＝循环血液，SA＝唾液/口腔，SM＝***(semen)(含有***)，SF＝***(seminalfluid)(不含***)，MF＝月经液，VM＝***物质。相同的样品和捐赠者不一定用于评估所有标志物。从***样品中仅扩增了TNP1和KLK2。
图2.六种新mRNA与四种公知的标志物的灵敏度比较[1]。上图：HBD和SLC4A1与GYPA相比，使用3个样品，分别为2、1和0.5μL循环血液，引物浓度为0.2μM。从顶部开始第二行：TNP1与PRM2相比，使用来自三个捐赠者的1μL***的9个样品，引物浓度为0.05μM。从底部开始第二行：KLK2与TGM4相比，使用3个样品，分别为2、1和0.5μL***液(无***)，引物浓度为0.1μM。下图：MMP3和STC1与MMP11相比，使用来自两个捐赠者的9个月的经液样品(第2天和第3天)，引物浓度为0.1μM。平均峰高(APH)和标准偏差由三个技术重复计算。
图3.两种已知标志物(GYPA、MMP11)和四种新mRNA候选物(HBD、SLC4A1、MMP3、STC1)的RNA-Seq结果(fragments per kilobase of exon per million fragmentsmapped，FPKM)。BL＝循环血液；BU＝口腔；MF＝月经液；VM＝***物质。
图4.三种多重测定中包括的所有标志物的引物序列和预期的扩增子大小。
图5.三种多重测定的体液特异性。
图6.以下的电泳图：A.口腔样品，B.月经液样品，和C.***和***物质的混合样品。使用多重D(顶部)、多重Q(中间)和多重P(底部)扩增每个样品。
图7.多重化的影响。在对于以下的多重(白色柱)和单重反应(阴影)中获得的APH：A.0.05μM FDCSP和0.012μM HTN3，B.0.05μM HBD和0.04μM SLC4A1，C.0.04μM MMP10和0.02μM STC1，D.0.03μM PRM1和0.04μM TNP1，E.0.14μM KLK2和0.03μM MSMB，以及F.0.02μMCYP2B7P。
图8.体液混合物的分辨。值以RFU给出。在子宫周期的第2天从自然循环捐赠者收集MF。当添加其他组分时，样品为14周。在子宫周期的第19天从自然循环捐赠者收集VM。当添加其他组分时，样品为11周。对于包含MF、VM或***作为组分1的样品，在RT之前分别将RNA以1∶75、1∶50和1∶8稀释。对于MF-血液、MF-***(5μL和10μL)和***-唾液混合物进行cDNA样品的进一步稀释以调节峰高。SA＝唾液，SM＝***。
图9.使用多重P扩增***后***样品。
图10.老化样品中的标志物检测。从在室温下保存或冷冻15至35个月的老化的体液样品、老化的RNA和老化的cDNA中获得峰高(RFU)。
图11.案件类型样品的分析。预期结果突出显示。1在mRNA分析完成之后，公开了预期结果。BL＝循环血液，SA＝唾液，SP＝***，SF＝***，VM＝***物质，NR＝无结果。
2如所公开的[2]进行了CellTyper扩增。在Genetic Analyzer 3130xl上分离PCR产物，峰值幅度阈值为100RFU。
现在通过以下非限制性实施例举例说明本发明。
实施例1：身体样品中的RNA稳定区域的鉴定
材料和方法
体液特异性候选基因的鉴定
用于鉴定循环血液(HBD、SLC4A1)和月经液(MMP3、STC1)的候选mRNA选自先前公开的降解体液的RNA-Seq数据[22]。考虑它们在体内的生理功能，***标志物候选物(TNP1、KLK2)选自基因表达数据库(TiGER、PaGenBase)[24，25]。
引物设计
如先前所述[23]使用OligoAnalyzer 3.1在线工具(Integrated DNATechnologies，Inc.，Coralville，IA，USA)设计HBD、SLC4A1、MMP3和STC1的引物以靶向转录物稳定区域(StaR)。使用Geneious v.5.6.7软件(Biomatters Ltd.，Auckland，NewZealand)观察测序覆盖图，并选择高覆盖区域用于引物设计。使用常规引物设计策略设计TNP1和KLK2的引物。使用Primer-BLAST[26]验证所有引物对其预期mRNA靶标的特异性。引物序列和预期的扩增子大小列于表2中。
表2.新体液标志物的引物序列和预期的扩增子大小
收集体液样品
经奥克兰大学人类参与者伦理委员会(University of Auckland HumanParticipants Ethics Committee，UAHPEC)批准，从健康的同意的志愿者中获得6种样品(每种50μL)：循环血液、***和***(无***)，以及唾液/口腔黏膜、月经和非经期***拭子。使用
RNA提取和纯化
如先前所述[22，23]使用
cDNA合成
使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Thermo FisherScientific，Inc.的Applied BiosystemsTM)根据制造商的说明制备互补DNA(cDNA)。将10微升无DNA的RNA在20μL反应中进行逆转录。在GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler(Thermo Fisher Scientific，Inc.的Applied BiosystemsTM)上使用以下程序进行合成：25℃下10分钟，37℃下120分钟，然后85℃下5分钟，并保持在4℃。
聚合酶链式反应(PCR)
PCR反应
使用Multiplex PCR Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)根据制造商的说明扩增体液cDNA样品。在含有12.5μL 2×PCR主混合物的25μL PCR反应中扩增2微升cDNA。用于特异性测试的引物浓度如下：0.05μM(HBD)、0.03μM(SLC4A1)、0.08μM(TNP1)、0.4μM(KLK2)、0.02μM(MMP3)、0.02μM(STC1)。用于比较的引物浓度分别为0.2μM(循环血液)、0.05μM(***)和0.1μM(***和月经液)。最后，添加无核酸酶的水以使每个反应的总体积达到25μL。
PCR循环条件
用于在GeneAmp PCR System 9700上进行扩增的PCR循环条件如先前所公开的[22，23，1]：在95℃下初始变性15分钟，然后是94℃下30秒、58℃下3分钟和72℃下1分钟的35个循环，在72℃下最终延伸45分钟并冷却至4℃。
毛细管电泳和数据分析
在Genetic Analyzer 3130xl(Thermo Fisher Scientific，Inc.的AppliedBiosystemsTM)上分离PCR产物。将1微升扩增的PCR产物与9μL甲酰胺/大小标准储备溶液混合，后者通过将15μL GeneScanTM 500 ROXTM添加至1000μL HiDiTM甲酰胺而产生。用GeneMapper v.3.2.1(Thermo Fisher Scientific，Inc.的Applied BiosystemsTM)使用50RFU的峰值幅度阈值分析结果。
结果和讨论
体液标志物候选物的选择
进行循环血液(2个捐赠者)和月经液(1个捐赠者)的全转录组配对末端测序(2×100bp)，以鉴定每种体液类型可能独有的高表达生物学标志物[22]。将每个样品的加工和合并的测序读数与人参照序列组装体hg19(GRCh37)比对，以允许确定每个检测到的转录物的最大计数值[22]。数据按最大计数数进行分类，并在样品类型之间进行比较，以排除同时表达的基因，并鉴定高度丰富且可能特异的体液标志物。从该数据集中鉴定出四种mRNA候选物：循环血液的血红蛋白δ(HBD)和溶质载体家族4，成员1(SLC4A1)，以及月经液的基质金属肽酶3(MMP3)和斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)。
基于其在人体中推定的生理功能，从两个基因表达数据库(TiGER，PaGenBase)[24，25]中选择另外两种候选基因：***的转移蛋白1(TNP1)和可不含***的***的激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)。
RNA-Seq数据分析
图3显示在口腔和***物质样品中没有HBD和GYPA片段测序，而分别在两个和三个样品中检测到SLC4A1(FPKM＜0.06)。对于SLC4A1，在循环血液和月经液两者中观察到最高的FPKM值，但是在样品BL5中显示出更高的GYPA水平。HBD以相对低的水平检测到；然而，在两个月经液样品中，FPKM值高于GYPA，并且在口腔或***样品中未检测到片段。
在口腔黏膜中未检测到所有月经液标志物候选物(图3)。在循环血液中也无法检测到MMP3，而在一个样品中对STC1进行了测序，而在两个样品中对MMP11进行了测序(FPKM＜0.07)。此外，一个***物质样品(VM3)含有低水平的MMP3和STC1(FPKM＜0.6)。在月经液中，MMP3和STC1的FPKM值分别比MMP11高38.3倍和15.1倍。
特异性筛选
通过单重终点(singleplex endpoint)RT-PCR评估六种体液标志物候选物的表达谱。使用从总RNA合成的2μL cDNA扩增来自不同捐赠者的每种体液的六个样品(50μL循环血液和***、全口腔、月经和非经期***拭子)。当观察到交叉反应峰时(TNP1、MMP3和STC1，图1)，再扩增相应的样品以验证信号重现性。对每个样品也制备了省略RT酶的逆转录阴性(RT-)对照，并且扩增。所有RT-对照均为阴性(数据未显示)。
血红蛋白δ(HBD)
血红蛋白δ或δ-珠蛋白基因是位于染色体11p15.5上的人β-珠蛋白基因簇的一部分。两条δ链与两条α链一起构成HbA2四聚体(α2δ2)，其占成年人总血红蛋白的约2-3％[27]。HBD的编码区与HBB具有很强的序列同源性，两者均在骨髓和网织红细胞中表达[27，28]。HBD基因突变可导致临床上不显著的δ-地中海贫血，其特征是身体产生HbA2的能力降低[27]。
HBD mRNA仅存在于循环血液和月经液中(图1)。所有循环血液和六个月经液样品中的五个产生高于5000RFU的信号。其余月经样品(MF5)产生272RFU的信号，可能是由于血液含量较低，因为该样品是在***的第4天收集的，并且捐赠者仅报告轻微出血。因此，所获得的拭子的颜色相比于第2天或第3天的样品为更浅的红色。所有***、口腔和***物质样品均为阴性(图1)。尽管高样品输入体积，这些结果表明了HBD在血液中的高丰度和特异性表达模式。
虽然已知HBD表达仅达到HBB的约50％[27]，但我们的数据显示HBD mRNA的一致和有效检测，因此证明了该标志物对于血液鉴定的适合性。鉴于HBB的相对强和广泛的表达可导致非目标体液的扩增，HBD的降低的表达也是有利的[3，10]。虽然一些观察到的信号可能是由于样品中存在痕量血液而不是真正的HBB表达，但这些发现显然使结果的解释复杂化。由于HBD显示与HBB相同的表达模式，因此其降低的转录率在这种情况下是有益的，因为其提高了标志物特异性(图1)。
溶质载体家族4(阴离子交换蛋白)，成员1(Diego血型)(SLC4A1)
SLC4A1，也称为阴离子交换蛋白1(AE1)或带3，位于染色体17q21-22上，是红细胞膜中的主要整合蛋白，通过与锚蛋白-1和蛋白质4.1和4.2的相互作用将脂质双层连接到蛋白质网络[29]。SLC4A1还与血型糖蛋白A(GYPA)和血红蛋白相互作用[30]。C-末端结构域起到阴离子交换剂的作用，提高了血液输送CO2的总容量[29，30]。已发现SLC4A1基因中的大量突变，导致病症例如遗传性球形红细胞增多症、东南亚卵形红细胞症和遗传性棘状红细胞增多症，这些都会影响红细胞表型并导致轻度至重度贫血[29，30]。
图1显示，在0.03μM的引物浓度下，SLC4A1对含血液的样品具有特异性，而不存在于在***、口腔或***物质样品中。在所有循环血液样品和六个月经液样品中的两个中检测到SLC4A1 mRNA，峰高高于6000RFU。其余月经液样品分别产生3430RFU(MF 1)、4804RFU(MF 2)、2596RFU(MF 4)和937RFU(MF 6)的峰。这可表明与HBD相比，SLC4A1的表达略微降低，在月经液样品中，HBD平均产生1.4倍高的RFU，然而，差异不是统计学显著的(Student′st-检验，p＞0.1)。此外，用于SLC4A1的引物浓度(0.03μM)低于用于HBD的引物浓度(0.05μM)，并且不同的样品用于评价这两种标志物。重要的是，SLC4A1对于含有血液的样品是特异的，并且不存在于***、口腔或***物质样品中(图1)。
过渡蛋白1(在组蛋白替换为鱼精蛋白期间)(TNP1)
TNP1已经定位于染色体2q35-q36。TNP1与较大的TNP2一起代替了***发生过程中延伸和凝聚***细胞的细胞核中的组蛋白，并且随后被鱼精蛋白代替[31]。TNP1可以破坏核小体的稳定性并防止DNA弯曲，从而通过作为比对因子(alignment factor)促进链断裂的修复[31]。发现TNP1基因启动子区域中的突变可降低TNP1的表达，并可能导致男性不育[52]。
我们的结果表明TNP1在含有***的***样品中有强烈的表达(图1)。值得注意的是，在来自无***捐赠者的六个样品或任何循环血液和***物质样品中未检测到TNP1。然而，一个唾液和一个月经液样品产生峰(分别为147和152RFU)，但是这些容易与***样品区分，后者均超过4300RFU。再扩增唾液和月经液样品以验证信号重现性并且未观察到峰，表明最初观察到的信号可能是由痕量TNP1 mRNA的扩增或非特异性引物结合引起的。在这两个样品中，重复扩增清楚地区分了交叉反应和靶mRNA信号。
激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)
编码激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)(也称为人激肽释放酶2)的基因位于染色体19q13.41上。KLK2是由***合成的丝氨酸蛋白酶，与***特异性抗原(PSA/KLK3)具有高度序列同一性[32]。其将PSA和尿激酶的酶原形式激活成其酶促活性形式[32]。此外，KLK2具有切割精胶蛋白(semenogelin)I和II以及纤连蛋白的能力[33]。KLK2的酶促活性可以通过锌离子可逆地调节，锌离子在***和***液中最高[32]。
如图1所示，KLK2 mRNA存在于所有测试的***样品中，包括由无***个体捐赠的六个样品。没有观察到与非目标体液的交叉反应。所有循环血液、口腔、月经液和***物质样品均为阴性(图1)。虽然以前的研究报道了非***组织(包括唾液腺和子宫内膜)中KLK2 mRNA的存在[34]，但我们的研究结果表明这种mRNA对***样品的特异性。
基质金属肽酶3(MMP3)
基质金属肽酶(MMP)是锌或钙依赖性内肽酶的大家族，其分解代谢多种底物，从而调节蛋白质活性[35，36]。其在组织退化(tissue degradation)和重塑过程(包括月经)中发挥多种作用[35，36]。该家族的三个成员，即MMP 7、MMP 10和MMP 11已被广泛用作法医学月经液标志物[1，3，5-7，36]。
MMP3也称为溶基质蛋白酶-1(定位于11q22.3)，是MMP超家族的另一成员，其在月经期间高度表达(图1)。该酶是伤口愈合和瘢痕形成的关键调节剂之一[35]。对小鼠的研究表明，缺陷的MMP3表达可导致伤口尺寸增加、伤口愈合减慢和瘢痕收缩受损[35]。
我们的结果将MMP3鉴定为合适的月经液标志物。该mRNA在***的第2天和第3天强烈表达。所有六个月经液样品均产生大于2000RFU的峰(图1)。此外，在循环血液和***样品中未检测到MMP3 mRNA(图1)。然而，一个口腔(113RFU)和一个***物质样品(第19天，159RFU)也产生峰。当再扩增这些样品时，未观察到信号(数据未显示)。
在先前的研究中，引入MMP 7、10和11作为特异性用于检测月经的标志物。从那时起，多项研究报告了其在月经期外的子宫期表达[36，7，11]。在循环血液[10，7，11]、唾液、***和皮肤[11]中也检测到MMP。一项研究甚至建议将MMP7作为一般性的***分泌标志物[18]。在这里，我们还观察到MMP3与唾液/口腔黏膜和***物质的交叉反应(图1)。然而，这些信号不可重现，我们推断，其是由大样品输入(即整个拭子)导致痕量MMP3 mRNA的扩增或非特异性引物结合引起的。尽管如此，交叉反应峰低于200RFU(图1)，因此明显可与月经样品区分开来。总之，MMP3对月经排放的特异性等于或大于MMP7、10或11的特异性。
斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)
斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)最初被描述为硬骨鱼类(bony fishe)的小体(corpuscle)中的同型二聚体糖蛋白，其中其调节钙和磷酸盐的稳态[37]。
在人中，STC1基因位于染色体8p21.2上，并且该蛋白质作为自分泌或旁分泌因子还可以调节细胞内钙和/或磷酸盐水平，因此有助于骨形成[37，38]。与其在鱼类中的功能相比，人的STC1活性被认为是局部的而不是全身性的，因为其不存在于循环中[38]。然而，STC1似乎是多效性因子，并且其他提出的功能包括参与缺血、血管生成、肌肉收缩以及免疫和炎性应答[37，38]。已知这些过程都在月经前、月经期间和月经后发生在子宫内膜中。
我们的数据证实STC1 mRNA在循环血液样品中检测不到(图1)。此外，没有从口腔或***样品中获得信号，这与精囊中不存在STC1 mRNA的先前的发现一致[38]。在该研究中，STC1在月经液样品中强烈表达(图1，平均峰高7703RFU)。然而，六个***物质(VM)样品中的两个也产生峰(分别为150和347RFU)。再扩增这两个VM样品并且未观察到信号(数据未显示)。在子宫周期的第8天获得样品VM1，这是月经后的早期阶段。因此，该信号可能是在擦拭期间收集的残留痕量STC1 mRNA的结果。相反，样品VM 3在子宫周期的第19天收集自另一个个体。该捐赠者在样品捐赠时使用激素避孕药，这可能对STC1表达产生影响。已经报道了STC1在卵巢中的表达[38]并且似乎交叉反应最可能从***样品中获得。尽管如此，在这项研究中，即使引物浓度提高到0.4μM，也仅在月经液和***物质样品中观察到STC1 mRNA表达(数据未显示)。进一步的研究可以解决在获得样品的***阶段或使用避孕药是否影响STC1表达的问题。
与现有标志物的比较
分别使用0.2μM(循环血液)、0.05μM(***)和0.1μM(***和月经液)的引物浓度用于比较和相同的cDNA样品将六种新体液候选物的灵敏度与先前公开[1]的相应的充分表征的标志物进行比较。将HBD和SLC4A1与血型糖蛋白A(GYPA)，TNP1与鱼精蛋白2(PRM2)，KLK2与转谷氨酰胺酶4(TGM4)以及MMP3和STC1与MMP11进行比较。如图2所示，与相应已知标志物相比，所有新mRNA从其各自的目标体液中产生更高的平均峰高(APH)。在引物浓度为0.2μM时，与GYPA相比，HBD和SLC4A1两者对血液检测的灵敏度显著更高(产生显著更高的信号)(Student’s t-检验，HBD为p＜0.0005，SLC4A1为p＜0.005)。在引物浓度为0.05μM时，来自***样品的TNP1的提高的灵敏度也具有统计学显著性(p＜0.05)。然而，对于MMP11与MMP3(p＜5·10-21)和STC1(p＜5·10-17)的比较，获得了最低的p值。这些发现表明与MMP11相比，检测灵敏度极显著提高(即相同样品中的信号升高)。MMP3和STC1mRNA两者在月经子宫内膜中似乎比MMP11丰富得多，虽然显示相同的表达模式[1，3，7]。尽管引物设计可能对观察到的峰高差异有所贡献，但其各自的FPKM值也反映了这一点(图3、7)。仅KLK2峰高的增加没有达到统计学显著性，但是与TGM4相比，67％的***样品产生更高的KLK2信号。
结论
本实施例通过单重终点逆转录(RT-PCR)并且部分地使用RNA-Seq评估了六种新mRNA的表达以用于法医学体液鉴定，并且已经评估了其表达模式。与其他身体来源相比，所有标志物候选物在其各自的目标体液类型中都非常丰富。HBD和SLC4A1可用于确认循环血液的存在。TNP1mRNA存在于含有***的***中，而KLK2 mRNA仅限于***，而无论***是否存在。MMP3和STC1可用于鉴定月经液样品。
与使用相等引物浓度的相应已知标志物[1]相比，所有六种候选mRNA均显示出升高的信号强度。除KLK2外，与MMP11相比，APH的升高达到统计学显著性，直至MMP3的极端p值为5·10-21。基于RNA-Seq和CE结果，与MMP11相比，MMP3和STC1 mRNA两者在月经期间在子宫内膜中似乎更丰富，因此可有助于由月经引起的血斑(blood stain)的鉴定。特别是STC1的检测可用于区分循环血液和月经液，因为其不存在于循环系统中(图1，[38]。
对于利用唾液和月经液的TNP1，对于利用唾液和***物质的MMP3，以及对于利用两个非月经***样品的STC1，观察到单交叉反应(图1)。在所有情况下，这些峰值仍然低于350RFU，因此很容易与目标体液信号区分开来。此外，交叉反应不可重现，因此我们的数据支持早期发现：技术重复可用于mRNA结果解释[39]。此外，应该记住，提取体液的体积或RNA/cDNA输入量分别在交叉反应峰的出现中起主要作用。本研究使用大体积体液(50μL或整个拭子)和未稀释的cDNA样品，以揭示痕量表达并探索标志物特异性的极限。鉴于此，预期会发生交叉反应，但是所有非目标信号都具有比目标信号更低的峰高，并且是不可重现的。此外，在法医学案件中，样品通常是少量、降解的或以其他方式受损的[22，23]，因此限制了可从样品中获得的RNA和cDNA的量。在此处使用的引物浓度(图1)中，交叉反应保持在最低限度，特别是当与受控的RNA或cDNA输入量、严格的PCR条件和合适的解释准则相结合时[8，10，11，13]。然而，交叉反应使体液混合物的分离复杂化。
总结
同时评估每种体液中的多种mRNA可以帮助避免假阳性，因为不太可能所有分型的标志物均错误地指示某种体液的存在[9]。因此，这里表征的六种新mRNA可以通过扩展有用的法医学体液标志物组来极大提高mRNA分型结果的证明价值。除了公知的转录物外，可以开发引物一些或全部上述标志物的更大和改进的多重系统。
实施例2：多重测试
材料和方法
样品收集
在完全知情同意的情况下从健康志愿者获得人体样品。用于特异性测试的样品包括用于RNA的循环血液、液体唾液、***(含有***)、无******、月经液和***物质，以及用于DNA的来自男性个体的血液。对于循环血液和唾液，捐赠者为24至53岁，并且包括男性和女性。将血液以5-0.05μL的等分试样放置在无菌的
通过将增加体积的血液或***(1μL、5μL和10μL)添加到1/3的MF拭子来制备体液混合物。同样，将1μL、5μL或10μL唾液添加到1/3的VW拭子以及放置在拭子上的2μL***。最后，将2μL***和10μL唾液添加到VM拭子。除了MF和***的混合物外，所有样品均一式两份制备。
对于灵敏度研究，提取降低体积的循环血液(2.5-0.05μL)、唾液(5-0.25μL)、***(semen)(1-0.05μL)和***(seminal fluid)(1-0.05μL)，而对于MF和VM，对降低的RNA浓度进行逆转录。所有样品均一式两份制备，并使用10μL和1μL RNA进行逆转录。
对于物种特异性测试，适时地从包括灵长类动物、猴、鸟类、猫、鸡、狗、豚鼠、水獭、兔、绵羊和小袋鼠在内的24个物种收集循环血液和唾液。样品由宠物主人、兽医和奥克兰动物园(Auckland Zoo)工作人员提供。获得了总共41个样品(20个循环血液和21个唾液/口腔黏膜)。保留来自所有物种的在提取过程中收集的DNA级分。
DNA/RNA共提取和RNA纯化
如先前所述[53]使用
如所公开的[53]，使用ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System(Promega)对粗制RNA裂解物进行进一步处理。RNA在45μL无核酸酶的水中洗脱。立即使用TURBO DNAfreeTM试剂盒对纯化的RNA样品进行DNase处理。按照制造商的说明，向每个样品中添加4.5μL 10x TURBO DNase Buffer和2μL TURBOTM DNase。
RNA和DNA样品的定量
如[53]中所述，使用
如上所述通过使用
RNA样品的逆转录
使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied)根据制造商的说明对无DNA的RNA样品(10μL或1μL)进行逆转录。每个反应的总体积为20μL。
引物和多重设计
使用OligoAnalyzer 3.1在线工具(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA，USA)设计HBD、SLC4A1、FDCSP、HTN3、MMP10、STC1和CYP2B7P的引物以靶向转录物稳定区域(StaR)[23]。在Geneious v.5.6.7(Biomatters Ltd.，Auckland，NewZealand)中观察测序覆盖图，并选择高覆盖区域用于引物设计。使用常规引物设计策略设计TNP1、KLK2和MSMB的引物，而PRM1的引物则是从文献中采用的[94]。使用Primer-BLAST(National Center for Biotechnology Information，U.S.National Library ofMedicine，Bethesda，MD，USA)验证所有引物对其预期mRNA靶标的特异性。
将引物编译到三种多重测定中：
1)组合了FDCSP和HTN3的双重法(多重D)
2)包含HBD、SLC4A1、MMP10和STC1的四重法(多重Q)和
3)组合了PRM1、TNP1、KLK2、MSMB和CYP2B7P的五重法(多重P)。
优化的引物浓度如下：
1)0.05μM FDCSP和0.012μM HTN3，
2)0.05μM HBD、0.04μM SLC4A1、0.04μM MMP10和0.02μM STC1，以及
3)0.03μμM PRM1、0.04μμM TNP1、0.14μM KLK2、0.03μM MSMB和0.02μM CYP2B7P。
图4列出了引物序列和预期的扩增子大小。
多重终点PCR
使用12.5μL
扩增阴性对照(ANEG)包含无核酸酶的水来代替cDNA。由来自多个个体的每种体液(用于多重D的唾液样品，用于多重Q的月经液样品，和用于多重P的***物质样品)的四个已知样品的合并的cDNA制备扩增阳性对照(APOS)。在合并之前，测试每个样品中所有目标mRNA的存在。将所得的APOS样品在TE缓冲液中稀释，以在没有过度扩增的情况下显示约10,000个相对荧光单位(RFU)的峰高。
通过调整退火温度和持续时间以及最终延伸时间，优化了RT-PCR的方案[1]。为了允许使用通用扩增方案，将PCR条件选择为在所有三种多重测定中同时使目标信号最大化的条件。最终优化的PCR条件是：
在95℃初始变性15分钟，然后
94℃ 30秒、60℃ 3分钟和72℃ 1分钟的35个循环，
在72℃最终延伸10分钟，并且
冷却至4℃。
毛细管电泳和数据分析
在3500xL基因分析仪(Applied)上分离PCR产物。简单地说，每个样品中将9.6μL Hi-DiTM与0.4μL GeneScanTM 600dye Size Standard v2.0(Applied)混合，并向其中添加2μL PCR产物。每分析22个样品就注入一个扩增阳性对照和一个阴性对照。样品在1.2kV的电压下注入24秒。使用
结果
物种特异性
如表3所示，所有灵长类动物血液样品(除松鼠猴(squirrel monkey)外)均产生两种循环血液标志物的信号。对于HBD观察到最多信号，尤其是在灵长类动物和兔血液中。这是预料之中的，因为灵长类动物的mRNA与人mRNA非常相似(例如，人和白颊长臂猿(northern white-cheeked gibbon)HBD之间有98％的序列同一性[54])。此外，血红蛋白在许多鸟类和哺乳动物中广泛表达，尽管其中一些仅具有假基因[55]。仅在灰头狐蝠(grey-headed flying fox)样品中观察到STC1。在猫血液中检测到MMP10加2bp大小的信号。在合趾猿(siamang gibbon)和绒顶柽柳猴(cotton-top tamarin)样品中检测到与CYP2B7P相同大小的扩增产物。这可能是由于在灵长类动物中CYP2B7P表达的结果，而人仅具有假基因。绒顶柽柳猴样品也显示出超出刻度(off-scale)的MSMB峰。
大多数动物唾液样品未显示出靶扩增产物的存在。仅冠毛猕猴(bonnet macaque)样品产生FDCSP、SLC4A1、MSMB和CYP2B7P信号。在松鼠猴和狗样品中也检测到了FDCSP。绒顶柽柳猴样品显示MSMB和CYP2B7P峰，其在血液中也观察到。这些不太可能源自残留的DNA，因为DNA的扩增不会产生可比较的信号。因此，一些灵长类动物物种的循环血液或唾液中可能存在MSMB或低水平的CYP2B7P mRNA。
表3.从24个物种收集的循环血液和唾液的三种多重测定的特异性。
1观察到的产物大小比预期小1-2bp。
2观察到的产物大小比预期大1-2bp。
3提取阴性对照。
4由于同一样品中的DNA浓度低于检测阈值，因此预计没有信号。
由于样品体积难以估算，剩余的信号可能源于超负荷的PCR导致的痕量mRNA扩增。在大多数样品中，观察到了预期标志物位置以外的额外扩增产物。这些可能是由于非特异性引物结合所致，并且可以通过进一步提高退火温度来避免[56]。
动物DNA样品大多显示出升高的基线和峰高低于1000RFU的许多非特异性扩增产物。尽管一些峰的大小与预期的标志物产物的相同，但这可能是偶然发生的。结合噪声基线出现的数个意料之外的信号是存在DNA的良好指示。对于来自冠毛猕猴、侏儒狨猴、合趾猿和蜘蛛猴的TNP1，观察到超过4,000RFU信号。这可能是由于TNP1引物扩增了DNA。另外，在金狮狨猴样品中观察到MSMB。
体液特异性
图5表明，除无******中的PRM1信号(187RFU)外，未观察到来自非靶体液的交叉反应。但是，输精管切除术后的***中有时会存在***[57]。另外，在一个月经液样品中未检测到CYP2B7P。宫颈黏液和***分泌物对月经期间流失的总液体量几乎没有贡献[58]，因此相应标志物可能以低于检测限存在。
对于MMP10，人DNA样品产生60RFU的峰(图5)。该信号可归因于升高的基线，并且可以通过提高分析阈值来避免。另外，TNP1被扩增(54,263RFU)。这可能是由于TNP1正向引物跨外显子/外显子边界放置且仅七个碱基与不同的外显子而不是反向引物对齐的事实。因此，TNP1无法区分mRNA和DNA模板，并且TNP1信号不能证实***的存在。逆转录酶阴性(RT-)对照可以帮助验证残留的基因组DNA是否可能对信号有所贡献。此外，大规模平行测序(MPS)可以确定扩增子序列，从而在将来区分模板。
为了评估由于过量样品输入而导致的假阳性的可能性，对来自五个捐赠者的每种体液的10个样品(10μL唾液、5μL血液、2μL***以及整个MF和VM拭子)进行扩增。靶标志物信号通常被过度扩增，即在70,000-90,000RFU范围内(表4)。例外的是来自捐赠者A的唾液中的HTN3，来自捐赠者R的月经液样品以及月经液样品中的CYP2B7P，其相当低。这证实了以前对个体和样品中转录物丰度高变异的发现[4，10]。
除了循环血液中的MMP10、STC1、PRM1和MSMB，唾液中的HBD、SLC4A1、PRM1和KLK2以及月经液中的HTN3以外，对于所有标志物和体液均观察到低水平的交叉反应。这证实了先前关于所有目前已知的mRNA在非靶体液中具有低转录物丰度的报道[3，39，10，14]。大多数信号低于500RFU，并且如果应用适当的分析阈值则可能不存在，并且在3500xL仪器上靶标志物峰在4,000-12,000RFU的理想范围内。但是，对于来自两个捐赠者的两个MF样品中的FDCSP，两个唾液、一个***和三个VM样品中的MMP10，以及一个VM样品中的MSMB，观察到超过10,000RFU的交叉反应。这表明了非靶体液中相对较高的FDCSP、MMP10和MSMB转录物丰度，因此与其余mRNA相比具有较低特异性。然而，在理想的样品输入下没有观察到交叉反应(图5)。
表4.使用过量RNA和cDNA输入的三种多重测定的体液特异性。
1观察到的产品大小比预期小1-2bp。
2观察到的产品大小比预期大1-2bp。
因此，必须限制样品输入量并避免过度扩增，尽管这可能会导致忽略体液混合物的微量组分。HTN3、HBD、SLC4A1和PRM1似乎是具有最高特异性的标志物。三种多重测定的电泳图的实例如图6所示。
灵敏度
使用10μL RNA进行cDNA合成，三种多重测定的检测下限(LOD)为约0.5μL唾液(多重D)，0.05μL循环血液(多重Q)，0.05μL含***的***(多重P)和0.25μL无******(多重P)。对于MF(多重Q)和VM(多重P)，使用1μLRNA进行cDNA合成，LOD为从整个拭子获得的RNA的约1/50，使用1μLRNA进行cDNA合成。这些结果与其他法医学多重系统[3，1，39，5，59]相似。
精确度
通过相同的cDNA样品的一式三份扩增来评估三种多重测定的精确度。从所得峰高计算标准偏差(σ)和表示为σ除以平均值的变异系数(CV)。
唾液标志物对于FDCSP表现出67％和39％的平均值周围的离差，并且对于HTN3为约77％和103％。这表明HTN3的平均值周围的较高水平的变异性，并且两种标志物的中等至低的精确度。HBD的变异性为8％至49％，SLC4A1的变异性为18％至36％。因此，两种标志物显示出比唾液标志物更高的精确度。在MF样品中似乎出现较少的离差。MMP10、STC1和CYP2B7P分别显示21-24％、14-16％和18-19％的变异性。这些值表明重复和样品之间的中度到良好的精确度水平，特别是对于STC1。PRM1的变异性为14-93％，TNP1的变异性为7-53％，KLK2的变异性为14-141％，并且MSMB的变异性为16-51％。一个***样品中KLK2的高离差(141％)是由于在两个重复中未能扩增。在第二个***样品的一个重复中也未检测到KLK2，而所有其他mRNA始终可检测到。尽管对于mRNA分析预期了峰高的高变异性[60]，但包括更大量重复的进一步研究可更精确地确定CV值。
多重化的影响
为了研究多重化对靶标检测的影响，在多重和单重反应二者中的总共三种重复中，扩增了12个样品，即每种体液两个样品。所有样品先前已经在多重扩增中显示出理想的峰高。如图7所示，与单重相比，仅HTN3在多重中唯一产生更高的信号。对于大多数标志物和样品，在单重反应中获得了更高的平均峰高(APH)。预期这是由于单重扩增中引物组之间竞争的减少[56]。对于MMP10和SLC4A1观察到最强的不利影响。与单重反应相比，多重反应中的APH分别降低了4.1倍和1.8倍。这可能是引物之间低的异二聚化值的结果(ΔG≥-9.76kcal/摩尔)。然而，有趣的是，与循环血液相比，在MF中SLC4A1和HBD的APH差异更明显。
然而，对于PRM1未观察到单重或多重中信号增加的明显趋势，TNP1在多重中表现稍好。在多重中该mRNA始终可检测到，而两个单重重复未能扩增。使用单重反应，分别在12个重复中有4个和2个中也未能检测到KLK2和MSMB，而在多重中仅3个和0个重复未检测到。CYP2B7P的多重化的影响是可忽略不计，尽管在多重中标准差略高。
在从一式三份扩增平均得到的30个标志物观察结果中的60％中，靶标志物在多重中表现出比在单重中更小的峰高变异(数据未显示)。TNP1、KLK2和MSMB仅在多重中显示出更高的精确度。因此，尽管多重化对绝对峰高并且因此对靶标检测具有不利影响，但是在多重中标志物倾向于提高的精确度和一致的扩增。多重化引起的峰高损失可通过调节引物浓度来抵消，其在相同多重中平衡了标志物之间的信号。
体液混合物的分辨
除了1μL唾液与2μL***混合的一个样品外，正确鉴定了所有体液混合物(图8)。使用从提取的RNA的1∶8稀释液得到的未稀释cDNA样品，FDCSP和HTN3达到5,829RFU和3,135RFU，而***标志物为MSMB为11,521RFU并且KLK2为40,745RFU。在两种扩增中均未检测到循环血液和MF标志物。额外稀释cDNA样品以将***标志物的峰高调节至理想的4,000-12,000RFU范围会导致唾液标志物信号丢失。这意味着可能无法正确分辨具有大量主要组分和少量次要组分的不均匀混合物。
在任何含有月经液的混合物中均未观察到CYP2B7P。这可能是因为该mRNA以低于检测阈值存在。在两个含有***的样品中也未检测到TNP1，可能是由于扩增失败。升高的基线导致两个意料之外的信号(MMP10，58RFU和KLK2，50RFU)。重要的是，更大的体液体积并不一定会产生更高的峰。尽管在具有MF的第一组混合物中HBD信号随血液体积的增加而增加，但第二组混合物并未显示出这种相关性。这可能是由于样品之间模板丰度的差异所致。
***后***样品中***mRNA的检测
为了评估在***后收集的***拭子上可以检测到***mRNA的时间范围，使用多重P对自***起的时间(time since intercourse，TSI；通过每日问卷从自我声明的信息中获知。在对照实验中，捐赠者连续24天提供***拭子)为1至6天的24个样品进行扩增。结果如图9所示。
在***后多至三天的时间里，所有四种***标志物均始终被检测到。对于PRM1，来自TSI 3d样品的最低信号为1,469RFU(样品D19)。***后四天收集的拭子也显示所有四种***标志物，但样品D10除外，该样品未显示KLK2信号，可能是扩增失败所致。五天后收集的两个样品(D11和D26)分别显示出MSMB和一种另外的标志物。而TSI为六天的一个样品(D12)未被检测到，第二个样品(D27)显示了PRM1峰(903RFU)。因此，可以在多至6天中使用五重测定来鉴定***后样品中的***mRNA。这些结果表明，与报道了***mRNA的检测仅限于TSI≤1d的样品的先前的研究[10]相比，***后样品中的标志物检测显著增强，。
稳定性研究
法医学文献报道了从沉积后长达56年的体液的成功mRNA扩增[61]。在这项研究中，研究了检测和鉴定老化的体液、老化的RNA和老化的cDNA样品的能力。就存储时间选择了这三个类别中的每个类别的五个单一来源样品，并使用所有三种多重测定法对其进行了扩增，并在必要时进行cDNA稀释。另外，分析了从鼻血(nosebleed)获得的老化的cDNA样品。结果如图10所示。
所有老化的循环血液样品(17-25个月)均被正确鉴定，未观察到交叉反应。老化的RNA样品(29-35个月)正确显示了所有靶标志物，但经液样品中没有CYP2B7P。老化的cDNA样品(15-30个月)也被成功扩增，不存在交叉反应。在老化的MF cDNA样品中，未检测到月经液标志物STC1，但是强烈的CYP2B7P信号为样品的***起源提供了更多的置信度。
鼻血样品正确显示了HBD和SLC4A1的信号，而未检测到FDCSP、HTN3、PRM1、TNP1和KLK2。但是，观察到MMP10、STC1、CYP2B7P，尤其是MSMB。这可能是有问题的，因为这些结果错误地表明了MF和***混合物的存在。先前的一项研究也报道了来自鼻黏膜的CYP2B7P的扩增[39]。≥200RFU的分析阈值(AT)可以防止对STC1和CYP2B7P进行假阳性鉴定，但仍允许对MMP10和MSMB进行鉴定。因此，在可能存在鼻黏膜的情况下，对mRNA谱分析结果的解释应谨慎。因此，未检测到STC1或CYP2B7P的MMP10信号被认为不能证实MF(除非MMP10峰高超过循环血液标志物的峰高)，而MSMB必须伴随第二***标志物以确认***的存在。
案件类型样品
在盲法研究中处理案件类型样品，其中研究人员不知道样品来源。总共分析了十二个样品(六个拭子(样品1-6)和六个胶带黏附物(tape lift)(样品7-12))。首先使用10μLRNA和10μL cDNA扩增所有样品。必要时进行随后的cDNA稀释。根据前面部分获得的结果，如果峰高超过20,000RFU，则需要稀释。将400RFU的分析阈值用于峰分配。为了将结果与以前使用的方法进行比较，还使用CellTyper[1]扩增了所有样品或其最高稀释度。结果显示在图11中。为所有样品制备了RT-对照。这些都没有显示任何标志物峰(数据未显示)。
使用任何一种多重系统，三个样品(3、8和11)未显示标志物峰。样品3是来自鸡的唾液样品，因此正确地缺少mRNA结果。样品8是从无***症男性的一双男性内衣的胯部处内侧获得的。因此，***的存在是可能的。样品11是来自咖啡杯的胶带黏附物，因此预期包含唾液。所收集的材料可能不足以产生这两个样品的结果。
使用CellTyper未能确定样品1(***拭子)、2(唾液和蓝莓汁的皮肤拭子)、7(一双男士内衣的胯部内侧)和12(血迹)。新的多重法证实了样品1的***物质的存在。这表明在一些个体中乳杆菌可能是不可靠的VM标志物。然而，CYP2B7P的检测使得能够确定该样品的来源。对于样品2获得了TNP1信号(611RFU)。该结果没有提供信息，因为信号可能源自残留的基因组DNA，虽然RT-对照缺乏靶信号。对于样品7，新的多重法证实了***的存在。TNP1为***的存在提供了强有力的支持，但由于从DNA扩增的风险，应谨慎解释。MMP10没有提供信息，因为没有检测到相应的mRNA。最后，在样品12(血迹的胶带黏附物)中观察到了HBD和SLC4A1。这正确地证实了循环血液的存在。这些结果表明，在四个样品中的三个样品中，与CellTyper相比，使用新的多重检法改善了体液检测。
使用新多重法将样品4鉴定为VM。尽管这是正确的结果，但该测定法未能检测出唾液为第二组分(图11)。相反，在样品5中仅确认了唾液。该拭子还包含了唾液和VM的混合物。唾液是在收集VM样品之后(样品5)或之前(样品4)施用的。这可能表明在提取过程中细胞裂解最有可能从拭子的最外表面去除细胞材料。另一种解释可能是体液比例太不均匀而无法分辨。CellTyper在两个样品中检测到唾液。与新的多重法相比，这表明对唾液的更高灵敏度。但是，反过来，CellTyper未能在任一个样品中鉴定出***物质。
两种多重法均正确地证实了样品6中唾液的存在。该样品还含有痕量的血液，但二者均未检测到。还预期了样品9(来自T恤衫的颈部和上前部的胶带黏附物)也可能存在唾液。新的多重法检测到FDCSP、MMP10和MSMB。这些信号不足以推断体液的存在。CellTyper检测到相应的标志物类型(STATH和MMP11)，这也不能证实体液。似乎在某些日常物品上可能存在mRNA背景水平，这可以通过进一步研究加以解决。
改进的多重法证实了样品10中循环血液的存在。还观察到了MMP10，但由于没有另外的mRNA，因此无法提供信息。该样品是从一双男士内衣的胯部内侧采集的，并施用了少量血液。CellTyper检测到TGM4，这表明***的存在，但未能检测到血液。总体而言，新的多重法似乎对循环血液和***mRNA更灵敏，而CellTyper对唾液更灵敏。引物浓度的进一步调整可能会提高新的多重法对唾液的灵敏度。
结论
总体而言，结果证明了三种终点RT-PCR多重测定法在低丰度和老化体液样品的鉴定以及混合物和案件类型样品的分辨中的成功应用。优化的系统显示出与其他法医学多重测定法[3，1，59]相似的特异性和灵敏度，与CellTyper[1]相比改善了案件类型样品的结果。
物种特异性研究表明，一些引物序列不是人特异性的。HBD经常从非人血液样品(尤其是灵长类、猫和兔)中扩增。因此，应谨慎分析大的红色污渍。绒顶柽柳猴、冠毛猕猴和合趾猿样品对于CYP2B7P和MSMB也容易产生假阳性。唾液样品产生很少的假阳性，但是狗唾液产生FDCSP信号。电泳图中多个额外峰的出现是存在基因组DNA的强烈指示。因此，分析人员应仔细审查案件的框架，并考虑样品是否可能产生假阳性结果。不存在DNA谱可另外表明存在非人体液。如果怀疑存在动物体液，则应进行另外的物种的测试。
在所有人体液中，较高体积的体液、RNA和cDNA通常会产生更强的信号。尽管高模板量的样品可能显示出升高的基线噪声和可能落入标志物窗口的非特异性峰，但在增加模板量下没有抑制迹象。在超负荷PCR反应中容易出现假阳性。这些可能是由于非靶标体液中的低水平基因表达或非特异性引物退火导致的假象形成。因此，必须调节cDNA输入量以建立标志物特异性。复制扩增可用于鉴定交叉反应。RT-对照可以提供有关DNA是否可能有助于信号的其他信息。建议使用400RFU的分析阈值，以有助于防止假阳性标志物鉴定。
在整个研究过程中，观察到个体间和样品间的高差异，尽管在重复之间检测到的体液是一致的。由于影响基因表达的多种因素[4]和目前无法测量样品中人特异性RNA浓度[62]，这是可以预期的。复制之间的低精确度进一步加剧了这种变化的影响。多重化提高了整体精确度，但对大多数标志物的绝对峰高有不利影响。此外，随机效应在低模板样品中很明显。在低RNA浓度下观察到多种标志物的缺失，而在更低RNA浓度下相同标志物再现。
成功鉴定了***后收集的样品中***物质和***的混合物多至六天。重要的是要注意到比例不均匀的混合物可能无法完全分辨。尽管在所有分析的混合物中都成功检测到了主要组分，但是次要组分由于低的丰度可能未检测到，导致信号低于检测阈值。但是，这是该技术的一般限制。鉴于以上结果，开发的多重系统为法医学样品的体液和细胞类型评估提供了可靠而灵敏的方法。
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SEQ ID NO：1 血红蛋白δ(HBD)
SEQ ID NO：2 溶质载体家族4(阴离子交换蛋白)，成员1(Diego血型)(SLC4A1)
SEQ ID NO：3 血型糖蛋白A(MNS血型)(GYPA)
SEQ ID NO：4 滤泡树突状细胞分泌蛋白(FDCSP)
SEQ ID NO：5 组蛋白3(HTN3)
SEQ ID NO：6 (多核苷酸，唾液蛋白(STATH)
SEQ ID NO：7 鱼精蛋白1(PRM1)
SEQ ID NO：8 过渡蛋白1(TNP1)
SEQ ID NO：9 鱼精蛋白2(PRM2)
SEQ ID NO：10 激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)
SEQ ID NO：11 微精原蛋白β(MSMB)
SEQ ID NO：12 转谷氨酰胺酶4(TGM4)
SEQ ID NO：13 基质金属肽酶10(溶基质蛋白酶2)(MMP10)
SEQ ID NO：14 斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)
SEQ ID NO：15 基质金属肽酶3(MMP3)
SEQ ID NO：16 基质金属肽酶11(MMP11)
SEQ ID NO：17 细胞色素P450家族2亚家族B成员7假基因(CYP2B7P1)
SEQ ID NO：18 格氏乳杆菌
SEQ ID NO：19 卷曲乳杆菌
SEQ ID NO：20 血红蛋白δ(HBD)
SEQ ID NO：21 血红蛋白δ(HBD)
SEQ ID NO：22 溶质载体家族4(阴离子交换蛋白)，成员1(Diego血型)(SLC4A1)
SEQ ID NO：23 溶质载体家族4(阴离子交换蛋白)，成员1(Diego血型)(SLC4A1)
SEQ ID NO：24 血型糖蛋白A(MNS血型)(GYPA)
SEQ ID NO：25 血型糖蛋白A(MNS血型)(GYPA)
SEQ ID NO：26 滤泡树突状细胞分泌蛋白(FDCSP)
SEQ ID NO：27 滤泡树突状细胞分泌蛋白(FDCSP)
SEQ ID NO：28 组蛋白3(HTN3)
SEQ ID NO：29 组蛋白3(HTN3)
SEQ ID NO：30 唾液蛋白
SEQ ID NO：31 唾液蛋白
SEQ ID NO：32 鱼精蛋白1(PRM1)
SEQ ID NO：33 鱼精蛋白1(PRM1)
SEQ ID NO：34 过渡蛋白1(TNP1)
SEQ ID NO：35 过渡蛋白1(TNP1)
SEQ ID NO：36 鱼精蛋白2(PRM2)
SEQ ID NO：37 鱼精蛋白2(PRM2)
SEQ ID NO：38 激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)
SEQ ID NO：39 激肽释放酶相关肽酶2(KLK2)
SEQ ID NO：40 微精原蛋白β(MSMB)
SEQ ID NO：41 微精原蛋白β(MSMB)
SEQ ID NO：42 转谷氨酰胺酶4(TGM4)
SEQ ID NO：43 转谷氨酰胺酶4(TGM4)
SEQ ID NO：44 基质金属肽酶10(溶基质蛋白酶2)(MMP10)
SEQ ID NO：45 基质金属肽酶10(溶基质蛋白酶2)(MMP10)
SEQ ID NO：46 斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)
SEQ ID NO：47 斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)
SEQ ID NO：48 基质金属肽酶3(MMP3)
SEQ ID NO：49 基质金属肽酶3(MMP3)
SEQ ID NO：50 基质金属肽酶11(MMP11)
SEQ ID NO：51 基质金属肽酶11(MMP11)
SEQ ID NO：52 细胞色素P450家族2亚家族B成员7假基因(CYP2B7P1)
SEQ ID NO：53 细胞色素P450家族2亚家族B成员7假基因(CYP2B7P1)
SEQ ID NO：54 格氏乳杆菌
SEQ ID NO：55 格氏乳杆菌/卷曲乳杆菌
SEQ ID NO：56 卷曲乳杆菌
SEQ ID NO：57 格氏乳杆菌/卷曲乳杆菌
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