西红花醛的新用途
阅读说明：本技术 西红花醛的新用途 (New application of crocetin ) 是由 徐宏喜 谭红胜 席志超 吕玥 江雪 陈江成 党泽方 于 2019-04-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了西红花醛的新用途,所述的新用途是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗前列腺癌的药物或保健品、用于制备预防或/和治疗前列腺癌复发的药物或保健品、用于制备降血脂的药物或保健品或用于制备预防或/和治疗炎症的药物或保健品。实验表明：西红花醛对前列腺癌及前列腺癌复发具备显著的预防和治疗作用,且具有降血脂作用及治疗非酒精性脂肪肝的作用,对炎症也具有显著的治疗作用,可望用于制备预防或/和治疗前列腺癌或前列腺癌复发的药物或保健品、降血脂的药物或保健品、预防或/和治疗炎症的药物或保健品。(The invention discloses a new application of crocetin, which is used for preparing a medicament or health-care product for preventing or/and treating prostatic cancer, a medicament or health-care product for preventing or/and treating prostatic cancer relapse, a medicament or health-care product for reducing blood fat or a medicament or health-care product for preventing or/and treating inflammation by taking at least one of crocetin or hydrate, pharmaceutically acceptable salt and precursor compound thereof as an active ingredient. Experiments show that: the saffron aldehyde has obvious effects of preventing and treating the recurrence of the prostate cancer and the recurrence of the prostate cancer, has the effects of reducing blood fat and treating non-alcoholic fatty liver, has obvious effects of treating inflammation, and can be used for preparing medicines or health-care products for preventing or/and treating the recurrence of the prostate cancer or the prostate cancer, medicines or health-care products for reducing the blood fat, and medicines or health-care products for preventing or/and treating the inflammation.)
技术领域
本发明涉及西红花醛的新用途，具体是涉及西红花醛在制备预防或/和治疗***癌或***癌复发的药物或保健品、降血脂的药物或保健品、预防或/和治疗炎症的药物或保健品中的新用途，属于医药技术领域。
背景技术
***癌是威胁男性健康的常见肿瘤之一，2002年全球新发病例为679 000例，位列男性肿瘤的第2位。***癌确切的发病原因尚未明确，而且近年来呈迅速上升趋势。早期***癌可无任何预兆症状，仅仅是筛查时发现血清***特异抗原值升高和(或)直肠指检发现***异常改变，而一旦出现症状，常属较晚期的进展性***癌，此时***患者中往往已经出现癌细胞转移浸润现象。目前***癌的主要治疗手段为手术、放疗、化疗，尚无有效的治疗药物。
目前在癌症的治疗方面，由于手术治疗和放化疗的不断进步，原发癌症以及一些早期癌症患者的死亡率在不断的下降，癌症逐渐地变成了一种慢性疾病，称之为“带瘤生存”。目前带瘤生存的患者不断增多，仅在美国就有1200万带瘤生存的患者。但是癌症总体的死亡率依然居高不下，癌症的复发就是其中一个主要原因。在临床上，对于预防癌症的复发已经越来越受到人们的关注，但是到目前为止仍没有相关的预防指南，也没有针对性的药物。
关于癌症复发的机理还没有明确的机制。目前比较主流的说法是，癌症复发的主要原因是由于静止期癌细胞(Quiescent cancer cell)重新进入细胞周期。静止期肿瘤细胞存在于肿瘤发生发展的各个阶段，此外当患者接受了放化疗之后也会导致一部分肿瘤细胞进入静止期。肿瘤细胞进入静止期是其进行自我保护的一种机制，癌细胞进入静止期后可以减少细胞存活所需的能量，并降低对药物的敏感度，从而有利于癌细胞的存活。当机体环境发生变化后，静止期癌细胞会重新进入细胞周期，肿瘤又重新开始生长，从而导致癌症的复发。所以，如果可以抑制静止期癌细胞重新进入细胞周期，将会一定程度上预防癌症的复发。
非酒精性脂肪肝病是指除酒精和其他明确的干涉因素所致的肝细胞内脂肪堆积过多沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。非酒精性脂肪肝病人在人群中发病率很高，随病程的进展临床表现不一，其中主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化。目前，非酒精性脂肪肝的病因较多，发病机制尚未完全明确，研究认为肥胖、二型糖尿病、高脂血症等，单独或共同作为非酒精性脂肪性肝病的易感因素，其可能与下列几个环节有关：1)脂质的摄入异常，高脂饮食、高脂血症以及外周脂肪组织动员增多，促使有利的脂肪酸输入肝脏增多；2)线粒体功能障碍；3)肝细胞合成游离脂肪酸和甘油三酯增多；4)极低密度酯蛋白合成不足或分泌减少，导致甘油三酯运出肝细胞减少。因此，目前的临床治疗主要是从降血脂方面进行入手治疗，但是目前非酒精性脂肪肝病尚无有效的治疗药物。
炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。
溃疡性结肠炎是一种病因尚不十分清楚的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，近15年来，我国溃疡性结肠炎患病人数已超过14万，且患者年龄趋向年轻化。溃疡性结肠炎会导致大量便血、溃疡和结肠癌等病变。因此，寻找能够治疗溃疡性结肠炎的药物至关重要。目前，5-氨基水杨酸类药物、皮质类固醇、生物疗法和免疫抑制药物等已用于溃疡性结肠炎的治疗。然而，这些药物会引起呕吐、发烧、心肌炎、粒细胞减少、高血糖和骨质疏松等不良反应，从而限制了药物的使用。中药来源的大量小分子化合物如生物碱、多酚类和醌类化合物等，都被报道有抗炎症活性。因此，从中药中寻找毒副作用小的抗炎症活性成分已成为当前抗炎症研究的热点。
在溃疡性结肠炎中，巨噬细胞的数量显著增加，浸润在肠道黏膜的巨噬细胞会显著提高细胞表面的模式识别受体(PRR)TLR4的表达去直接识别通过肠道上皮屏障的肠道共生菌和抗原，如细菌细胞壁的产物脂多糖(LPS)。其二者的相互作用会导致下游NF-κB和MAPKs等信号通路的激活，从而使巨噬细胞产生各种促炎介质如NO、IL-6和TNF-α等，从而增强炎症反应。另外，巨噬细胞也会将处理后的抗原呈递给CD4+T细胞，使其向Th2效应细胞分化。由此可以看出，溃疡性结肠炎与多种免疫细胞的活化有关，而巨噬细胞介导的炎症反应在溃疡性结肠炎中起到了重要作用。
随着中医药在临床的应用越来越广泛，中药在各种疾病方面的应用也成为了研究热点，以中药为代表的天然药物是我们巨大的药物库资源，目前临床用药约有50％来源于天然的小分子化合物，即中药有效成分。因此，从中药中筛选出高效低毒的预防或/和治疗列腺癌、***癌复发、降血脂或炎症药物，进而减轻患者痛苦和改善生活质量具有非常重要意义。
西红花(学名：Crocus sativus L.)又称藏红花、番红花，是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，也是一种常见的香料。西红花具有强大的生理活性，其柱头在亚洲和欧洲作为药用，有镇静、祛痰、解痉作用，用于胃病、调经、麻疹、发热、黄胆、肝脾肿大等的治疗。西红花醛(又称藏红花醛、红花醛、藏花醛)是从西红花中提取的一种单萜醛类化合物，英文名称：Safranal，分子式：C10H14O，分子量为150.22，CAS登录号为116-26-7，化学结构式为：
发明内容
本发明的目的是提供西红花醛的新用途，以拓宽西红花醛的应用范围。
本发明所述的西红花醛的一种用途，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗***癌的药物或保健品。
进一步的，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防***癌的药物或保健品。
本发明所述的西红花醛的另一种用途，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗***癌复发的药物或保健品。
进一步的，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防***癌复发的药物或保健品。
本发明所述的西红花醛的另一种用途，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备降血脂的药物或保健品。
进一步的，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗非酒精性脂肪肝病的药物或保健品。
本发明所述的西红花醛的另一种用途，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗炎症的药物或保健品。
进一步的，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗由巨噬细胞介导的炎症的药物或保健品。
进一步的，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗结肠炎的药物或保健品。
进一步的，是指以西红花醛或其水合物、药学上可接受的盐、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备预防或/和治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品。
所述西红花醛可通过化学合成或从植物中提取得到；作为优选方案，所述西红花醛从西红花中提取分离得到。
本发明所述的药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。
本发明所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
本发明所述药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。例如，所述药物为口服剂型时，可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
本发明中所述术语的定义如下：
术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明的研究结果显示：西红花醛可抑制静止期人***癌细胞增殖，可抑制静止期人***癌细胞LNCaP的重新增殖，可推迟静止期人***癌细胞重新进入细胞周期的时间，可影响静止期人***癌LNCaP细胞周期相关蛋白表达，说明西红花醛对***癌及***癌复发具备显著的预防和治疗作用；西红花醛在体外可显著降低肝细胞内脂肪含量，可显著抑制大鼠非酒精性脂肪肝形成，说明西红花醛具有降血脂作用及治疗非酒精性脂肪肝的作用；西红花醛可显著抑制巨噬细胞RAW 264.7介导的炎症反应，说明西红花醛对炎症具有显著的治疗作用；因此，本发明所述的西红花醛可望用于制备预防或/和治疗***癌或***癌复发的药物或保健品、降血脂的药物或保健品、预防或/和治疗炎症的药物或保健品。
附图说明
图1为西红花醛(Safranal)抑制静止期人***癌细胞LNCaP重新增殖的统计分析图；
图2为西红花醛(Safranal)推迟静止期人***癌细胞LNCaP重新进入细胞周期的流式分析图；
图3为西红花醛(Safranal)影响静止期人***癌LNCaP细胞周期相关蛋白表达的免疫印迹分析图；
图4为不同浓度西红花醛(Safranal)分别作用BRL 3A细胞24小时和48小时的细胞活力图；
图5为西红花醛(Safranal)作用BRL 3A细胞24小时后TG含量检测图；
图6为西红花醛(Safranal)作用BRL 3A细胞后油红O含量检测图；
图7为血清及肝组织生化实验结果；
图8为大鼠肾脏HE染色；
图9为大鼠肝脏油红O染色；
图10为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中NO的生成图；
图11为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中iNos和COX-2的蛋白表达图；
图12为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中TNF的生成及蛋白表达图；
图13为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中IL-6的生成及蛋白表达图；
图14为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中NF-B和MAPK信号通路图；
图15为西红花醛(Safranal)对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的体重影响图；
图16为西红花醛(Safranal)对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的病情活动指数影响图；
图17为西红花醛(Safranal)对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：考察西红花醛(Safranal)抑制静止期人***癌细胞LNCaP的重新增殖能力
1.1实验材料
人***癌细胞LNCaP购自美国ATCC细胞库。
RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素，SYBR GREEN购自美国Invitrogen公司。
1.2实验方法
静止期LNCaP细胞的获得以及诱导其重新回到细胞周期的方法：去血清培养人***癌细胞LNCaP 7天，获得静止期LNCaP细胞，通过重新用含血清的培养基培养LNCaP细胞，刺激其重新回到细胞周期。
静止期人***癌细胞LNCaP(1×105个细胞/孔)接种于96孔板中，并保留同样的细胞数作为细胞基数(Baseline)置于-80℃冰箱；培养基为含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640；分别加入浓度梯度为0.05mM、0.1mM、0.5mM的Safranal于96孔板中，作用72小时后，每孔加入100μl含0.01％SYBR GREEN，20％细胞裂解液的染色试剂，避光孵育1小时对DNA进行染色；并将保留的Baseline加入100μl的染色试剂，加入96孔板中一同孵育。
使用酶标仪在激发光485/20nm，发射光528/20nm下检测荧光值，用excel计算不同的生长抑制率(Growth Inhibition Values，简称GI Values)；GI Values＝1-[(治疗组的平均值-Baseline)/(control的平均值-Baseline)]×100；当细胞的生长抑制率达到50％时Safranal的浓度即为GI 50值，同理GI 25，GI 75，GI 90；实验数据均用平均值±标准误差表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准；本实验中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001代表与同时间点的DMSO组进行比较有显著的统计学差异。
1.3实验结果
图1为西红花醛(Safranal)抑制静止期人***癌细胞LNCaP重新增殖的统计分析图，从图1可见：在静止期LNCaP细胞重新进入细胞周期的过程中，以不同浓度的Safranal作用72小时后，能抑制静止期LNCaP细胞重新增殖的活性，其中0.1mM作用72小时能够显著性地抑制静止期LNCaP细胞的再次增殖，此外在0.5mM作用72小时后，可以看到细胞的DNA含量已经低于Baseline，说明Safranal在静止期LNCaP细胞重新进入细胞周期的过程可以诱导细胞的死亡；并且，与DMSO处理的对照组相比，随着Safranal剂量增加，SYBR Green荧光强度降低，表明细胞数目减少，说明safranal能够剂量依赖性地抑制LNCaP的重新增殖；以上结果可以证明，在静止期LNCaP细胞重新进入细胞周期的过程中，Safranal能够浓度依赖性地抑制静止期人***癌细胞LNCaP的重新增殖。
表1 Safranal抑制静止期***癌LNCaP细胞重新增殖的抑制率(72小时)
抑制率
Safranal(mM)
GI 25
0.10±0.075
GI 50
0.13±0.039
GI 75
0.19±0.135
GI 90
0.24±0.061
结合表1和图1可见：Safranal具有抑制静止期人***癌细胞重新增殖的作用，表明Safranal具有潜在的预防***癌复发的作用，可以作为手术治疗或放化疗后的药物或保健品，也可以作为预防或/和治疗***癌复发的药物或保健品，也可以作为预防或/和治疗***癌的药物或保健品。
实施例2：考察西红花醛推迟静止期人***癌细胞重新进入细胞周期的时间的影响
2.1实验材料
RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。
碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)和RNase A购自于美国Sigma公司。
2.2实验方法
静止期人***癌细胞LNCaP(5×105个细胞/个)接种于直径为6cm培养皿中。培养基含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640。根据实施例1中表1得到的结果，在细胞中用GI 50和GI 90(GI 50：0.13mM；GI 90：0.24mM)浓度的Safranal处理细胞32小时，32小时后收集流式细胞的样本。收集样本时，用胰酶消化细胞，并用-20℃的75％乙醇固定后4℃过夜，然后用含有RNase A和PI的磷酸盐缓冲液染色，并用流式细胞分析仪检测，利用FlowJo软件进行分析。本实验中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001代表与同时间点的DMSO组进行比较有显著的统计学差异。
2.3实验结果
图2为西红花醛(Safranal)推迟静止期人***癌细胞LNCaP重新进入细胞周期的流式分析图，图中，7SW是指7天饥饿培养后得到的静止期癌细胞对照组，FBS是指用含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养的增殖期癌细胞对照组，从图2可见：与DMSO对照组相比，随着Safranal剂量的增加，细胞重新回到细胞周期的速度减慢，具体体现为：LNCaP细胞在DMSO处理32小时后，G0/1期的细胞明显减少，S和G2/M期的细胞显著增多，说明LNCaP细胞在32小时时已经重新进入细胞周期；GI 50浓度处理后的LNCaP细胞，G0/1期的细胞虽明显少于静止期细胞组，但仍显著高于DMSO处理组，表明GI 50浓度处理后的LNCaP细胞重新进入细胞周期的进程明显减慢；而GI 90浓度处理32小时后依然处于静止状态；以上结果可以证明，Safranal能够推迟静止期LNCaP细胞重新进入细胞周期。
本实验证明Safranal具有推迟静止期人***癌细胞重新进入细胞周期的作用，表明Safranal具有潜在的预防***癌复发的作用，可以作为手术治疗或放化疗后的药物或保健品，也可以作为预防或/和治疗***癌复发的药物或保健品，也可以作为预防或/和治疗***癌的药物或保健品。
实施例3：西红花醛影响静止期人***癌LNCaP细胞周期相关蛋白表达
3.1实验材料
RPMI1640，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。
预染蛋白标记物购自美国Fermentas公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂三联试剂盒、BCA蛋白浓度试剂盒和ECL发光液购自上海威奥生物科技有限公司；脱脂奶粉购自上海光明乳业有限公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF)购自美国Millipore公司；其他试剂为上海国药集团分析纯。
3.2实验方法
静止期人***癌细胞LNCaP(5×105个细胞/孔)接种于直径为6cm培养皿中；培养基含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640；根据实施例1中表1得到的结果，在细胞中用GI 50和GI 90(GI 50：0.13mM；GI 90：0.24mM)浓度的Safranal处理细胞24小时，其间每隔12小时收集一次Western Blot的样本；收集样本时，用胰蛋白酶消化细胞，离心弃上清后置于1.5mL离心管中，-80℃保存；然后用含有1％蛋白酶抑制剂、PMSF和去磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液吹打、涡旋、裂解细胞，4℃离心后取上清至0.6ml离心管中；采用BCA法测定蛋白浓度，取40μg蛋白样品与loading buffer混合，99℃金属浴煮蛋白8分钟，离心；运用SDS-PAGE单向电泳技术分离蛋白，并采用半干式快速转膜仪进行转膜；转膜结束后，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭90分钟，用TBST洗膜3次，10分钟一次；并用含3％BSA的TBST稀释所需的一抗(稀释比例参考说明书或预实验结果)，将PVDF膜泡入抗体中，4℃摇床上孵育过夜；第二天，用TBST洗膜3次，10分钟一次；用含5％脱脂奶粉的TBST稀释二抗(稀释比例参考说明书或预实验结果)；将PVDF膜泡入抗体中，室温摇床上孵育90分钟；再用TBST洗膜3次，10分钟一次；最后，将ECL的A液和B液混合，滴加在膜上，放入机器曝光。
3.3实验结果
图3为西红花醛(Safranal)影响静止期人***癌LNCaP细胞周期相关蛋白表达的免疫印迹分析图；图中，7SW是指7天饥饿培养后得到的静止期癌细胞对照组，FBS是指用含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养的增殖期癌细胞对照组，从图3可见：Cyclin D1/3，Cyclin E1，CDK4/6/2的表达水平在静止期的LNCaP细胞中显著下降；当细胞重新进入细胞周期的过程中，这些蛋白的表达量重新上升；Cyclin-CDK复合物被激活并磷酸化Rb，增加了E2F1蛋白的表达，促使静止期细胞重新进入G1期；而以GI 50和GI 90浓度的Safranal处理的LNCaP细胞，GI 90显著有效地抑制了Cyclin D1/3，CyclinE1，CDK4/2蛋白表达的增加，减少了p-Rb蛋白，抑制了E2F1的增加，但对Cyclin D1/3的作用不明显；以上结果可以证明，在静止期LNCaP细胞重新进入细胞周期的过程中，Safranal调控了cyclin/CDK-pRb-E2F1通路，从而抑制静止期人***癌细胞LNCaP的重新增殖。
本实验证明，在静止期人***癌细胞LNCaP重新进入细胞周期时，Safranal影响了一些细胞周期相关蛋白的表达水平，具有阻滞静止期人***癌细胞重新进入细胞周期的作用，表明Safranal具有潜在的预防***癌复发的作用，可以作为手术治疗或放化疗后的药物或保健品，也可以作为预防或/和治疗***癌复发的药物或保健品，也可以作为预防或/和治疗***癌的药物或保健品。
由实施例1至3的结果可知：西红花醛(Safranal)对***癌及列腺癌复发具备显著的预防和治疗作用，可望用于制备预防或/和治疗列腺癌或***癌复发的药物或保健品。
实施例4：西红花醛降脂活性的体外药效评价
4.1实验材料
大鼠肝细胞BRL 3A细胞株，购于中科院生物细胞所。胎牛血清，DMEM培养液，细胞培养PBS缓冲液，青霉素、链霉素和DMSO购于美国Gibco公司，胰蛋白酶购于吉诺生物医药技术公司；CCK-8试剂盒购买于上海碧云天生物技术公司；Trizol试剂购买于美国Ambion公司；氯仿，异丙醇，乙醇等试剂购买于国药集团化学试剂有限公司；PrimeScript TM RT反转录试剂，SYBR Green PCR Buffer购买于日本Takara公司；TG试剂盒购买于南京建成生物科技有限公司；BCA蛋白浓度试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司。
4.2实验方法
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为5x104cell/ml，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液，放入细胞培养箱中培养过夜；按照实验分组，加入对应的西红花醛(母液浓度为10-1M)，药物梯度为500μM、200μM、100μM、75μM、50μM、25μM、12.5μM、5μM、0μM。每个浓度三个复孔；放入37℃培养箱静置培养，分别作用24小时及48小时；每孔加入10ul CCK-8溶液，培养4小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度；根据细胞活力的结果，5～200μM的西红花醛作用BRL 3A 24小时对细胞活力无明显影响(各组细胞活力>90％)，因此设置后续的西红花醛的实验剂量为12.5μM，50μM,200μM；细胞铺24孔板，种板密度为2*105个/孔，分为对照组、模型组(OA 200μM，根据前期实验结果确定)、西红花醛200μM+OA 200μM组、西红花醛50μM+OA 200μM组、西红花醛12.5μM+OA 200μM组，作用24小时；将各组细胞采用PBS洗涤1次，配制细胞裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，每孔加入50ul裂解液，冰上裂解10分钟，将裂解液全部吸至1.5ml离心管中；向离心管中加入1粒磁珠，组织破碎仪破碎细胞，然后将匀浆液全部吸至另一离心管中，涡旋后不离心直接测TG(具体按说明书方法检测)；将离心管内剩余样品采用12000rpm，4℃，离心10分钟，取上清，采用BCA法测总蛋白；TG的结果以每个样品的总蛋白进行校正。
4.3实验结果
实验结果如图4至图6所示。
图4为不同浓度西红花醛(Safranal)分别作用BRL 3A细胞24小时和48小时的细胞活力图；图中，*:p＜0.05，**:p＜0.01，***:p＜0.001，从图4可见，西红花醛的浓度保持在200μM以内，BRL 3A细胞24h和48h细胞活力均大于80％，因此200μM是西红花醛对BRL 3A细胞的安全浓度。
图5为西红花醛(Safranal)作用BRL 3A细胞24小时后TG(甘油三酯)含量检测图；图中，与对照组相较，*:p＜0.05，**:p＜0.01，***:p＜0.001；与模型组相比较，#:p＜0.05，##:p＜0.01，###:p＜0.001，从图5可见，200μM油酸(OA)刺激BRL 3A细胞可以显著升高TG含量(p＜0.001)，而西红花醛给药后，在高剂量条件下(50μM和200μM)，可以显著降低TG含量(p＜0.001)。
图6为西红花醛(Safranal)作用BRL 3A细胞后油红O含量检测图；图中，与对照组相比较，*:p＜0.05，**:p＜0.01，***:p＜0.001；与模型组相比较，#:p＜0.05，##:p＜0.01，###:p＜0.001，油红O脂肪染色法是利用可以特异性的着色组织内甘油三酯等中性脂肪的油红O染料，对组织细胞内的脂肪进行染色，利用油红O对BRL 3A细胞内脂肪染色后，再用DMSO溶解，最后定量测定细胞内被染色的脂肪含量的方法，从图6可见，与TG测定结果相一致，200μM油酸(OA)刺激BRL 3A细胞可以显著升高被染色的脂肪含量(p＜0.001)，而西红花醛给药后，在高剂量条件下(50μM和200μM)，可以显著降低油酸刺激产生的TG升高(50μM时p＜0.01，200μM时p＜0.001)。
本实验证明，西红花醛给药后，油酸刺激的大鼠BRL 3A肝细胞中甘油三酯含量下降；油红染色也表明西红花醛给药后肝细胞内脂肪含量下降；这些结果表明西红花醛具有降血脂的作用，可望用于制备降血脂的药物或保健品。
实施例5：西红花醛抑制大鼠非酒精性脂肪肝形成的作用研究
5.1实验材料
西红花醛(safranal)对照品(纯度＞90％)(W338907-25G-K，Sigma公司)；玉米油购买于益海嘉里食品有限公司。蔗糖，胆固醇，脱氧胆酸钠，吐温80，丙二醇，甲醛，95％乙醇等试剂购于国药集团化学试剂有限公司。TG，TC，LDL，HDL，ALT，AST试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。实验动物：本实验所采用的动物为Wistar大鼠，雄性，体重为180-200g，饲养级别为清洁级，室温20～25℃，湿度40～70％，标准饲料，动物自由饮食和饮水，光线12小时明暗自动转换。本实验所用动物购买于上海斯莱克实验动物有限公司(生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005)。
5.2实验方法
根据Zou等人研究的造模方法，采用复合高脂乳剂灌胃联合糖水喂养造成非酒精性脂肪肝模型大鼠；高脂乳剂配方：玉米油400g，蔗糖150g，奶粉80g，胆固醇100g，脱氧胆酸钠10g，吐温80 36.4g，丙二醇31.1g，复合维生素2.5g，食盐10g，矿物质混合物1.5g，蒸馏水300ml；动物分组：Wistar雄性大鼠40只，分为三组，对照组，模型组，西红花醛给药组，模型组和给药组大鼠每日灌胃高脂乳剂(10ml/kg/d)，第三周开始给药组同时给予400mg/kg/d剂量的西红花醛(与高脂乳剂混合后给药)，对照组每日灌胃(10ml/kg/d)的生理盐水，模型组和给药组同时配合18％蔗糖水溶液饲养，造模周期6周；取2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(400μl/100g体重)；将麻醉后的大鼠固定在手术台上，以75％乙醇消毒，沿左侧肋弓下行5-10mm切开一个口子，暴露大鼠腹腔，腹主动脉取血；取血后，大鼠脱脊椎处死，取肝肾等组织，取肝大叶(5mm)和右肾浸泡于4％***中固定过夜，用于后续组织包埋和切片，其他的肝组织分装收集至离心管中，液氮速冻，保存于-80℃冰箱用于后续生化测试；采用南京建成生物科技有限公司试剂盒对血清TG(甘油三酯)，TC(总胆固醇)，LDL(低密度蛋白)，HDL(高密度蛋白)，ALT(谷丙转氨酶)，AST(谷草转氨酶)及肝组织TC，TG进行检测，具体按照说明书操作。
5.3实验结果
实验结果如图7至9所示。
图7为血清及肝组织生化实验结果；图中，与对照组相比较，*:p＜0.05，**:p＜0.01，***:p＜0.001；与模型组相比较，#:p＜0.05，##:p＜0.01，###:p＜0.001)；具体的，图7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H依次为：肝脏甘油三酯(TG)、肝脏总胆固醇(TC)、血清甘油三酯、血清总胆固醇、血清低密度脂蛋白(LDL)、血清高密度脂蛋白(HDL)、血清谷丙转氨酶(ALT)、血清谷草转氨酶(AST)含量；从图7可见：模型组大鼠肝组织TC，TG以及血清TC，TG，LDL与对照组相比显著升高(p<0.001)，HDL降低不显著(p＞0.05)，说明模型组大鼠血清及脂肪含量已经显著高于对照组；模型组大鼠血清ALT,AST与对照组相比显著升高(ALT，p＜0.001；AST，p＜0.01)，说明造模过程可能会引起一定程度肝脏功能受损，由此引发血清转氨酶升高；西红花醛给药组与模型组相比，血清TG、TC、LDL明显降低(p<0.001)，同时HDL有显著升高(p＜0.01)，说明西红花醛具有较好的改善血脂升高的作用；同时，西红花醛给药组血清ALT,AST显著低于模型组(ALT，p＜0.001；AST，p＜0.05)，这也说明西红花醛具有较好的保肝降酶的作用。
图8为大鼠肾脏HE染色；图中A、B、C依次为对照组、模型组和西红花醛给药组的HE染色图；从图8可见，模型组大鼠肝细胞中含有脂滴，脂滴粒径较小当分布比较密集，而对照组和西红花醛给药组大鼠肝细胞则未发现明显成型脂滴，说明三组大鼠肾脏组织都未发现明显的炎性改变和病理变化。
图9为大鼠肝脏油红O染色；图中A、B、C依次为对照组、模型组和西红花醛给药组的油红O染色图；从图9可见，模型组大鼠肝细胞内密集分布被油红O染色的脂滴，正常组则零星分布被染色的脂滴，而西红花醛给药组则几乎看不到染色的脂滴，说明高脂乳剂灌胃后，模型组大鼠肝细胞内有大量脂滴合成，而西红花醛给药后肝细胞内脂滴明显减少，西红花醛加速了肝细胞内的脂肪代谢。
本实验证明，西红花醛可显著抑制大鼠非酒精性脂肪肝的形成，可望用于制备预防或/和治疗非酒精性脂肪肝病的药物或保健品。
实施例6：西红花醛抑制巨噬细胞介导的炎症反应
6.1实验材料
小鼠RAW 264.7细胞购自美国ATCC细胞库。
DMEM培养液，胎牛血清，青霉素和链霉素，SYBR GREEN购自美国Invitrogen公司。
6.2实验方法
采用Griess法，通过测定亚硝酸盐的含量从而检测NO含量；具体操作如下：(1)收集样品：RAW 264.7细胞接种于12孔板后，次日换液，1小时后加入DMSO和不同浓度的化合物Safranal，待药物处理相应时间后加入刺激物；刺激24小时后，吸取全部上清液并转移至EP管中，离心10000rpm，3分钟，从EP管中吸取800L上清液至新EP管中留待检测；各个实验组条件为：(1)空白组：不加化合物Safranal，不加刺激物；(2)阳性对照组：加DMSO和刺激物；(3)化合物Safranal低剂量组；(4)化合物Safranal高剂量组；ELISA实验：将样品加入酶标包被板上，弃样品后Wash Buffer冲洗3次加入酶标试剂，30分钟后加入显色剂，卵育20分钟后加入终止液，使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光值。本实验中，###p<0.001表示该组与无处理组相比存在显著性差异，**p<0.01和***p<0.001表示该组与脂多糖刺激组相比具有显著性差异。
6.3实验结果
实验结果如图10至14所示。
图10为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中NO的生成图；图中A和B分别是西红花醛抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞和BMDM中一氧化氮生成；从图10可见，RAW 264.7细胞经LPS(1μg/mL)单独作用24小时后，细胞释放NO水平显著升高，且Safranal能在不影响细胞存活率的情况下，浓度依赖性地减少LPS诱导的RAW 264.7细胞NO的生成。
图11为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中iNos和COX-2的蛋白表达图；图中A和B分别是iNos和COX-2的蛋白表达图，从图11可见，Safranal能在不影响细胞存活率的情况下，抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中iNos和COX-2的蛋白表达。
图12为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中TNF的生成及蛋白表达图；图中A和B分别是TNF的生成和蛋白表达图，从图12可见，Safranal能在不影响细胞存活率的情况下，抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中TNF的生成和蛋白表达。
图13为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中IL-6的生成及蛋白表达图；图中A和B分别是IL-6的生成和蛋白表达图，从图13可见，Safranal能在不影响细胞存活率的情况下，抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中IL-6的生成和蛋白表达。
图14为西红花醛(Safranal)抑制多糖诱导的小鼠巨噬细胞中NF-B及MAPK信号通路图；图中A和B分别是NF-B和MAPK信号通路图，实验过程中，LPS刺激细胞15分钟后，检测NF-κB通路相关信号分子p-IKKα/β、IKKα/β、p-IκBα和IκBα蛋白；刺激30分钟后，检测MAPKs通路相关信号分子p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38和p38蛋白，从图14可见，Safranal能够抑制RAW 264.7细胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化，并能抑制IκBα的降解，并且，Safranal也能够抑制ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化，而这三个激酶总蛋白表达量无明显变化。
本实验证明，西红花醛可通过抑制抑制NF-κB和MAPK信号通路相关信号分子蛋白的激活来抑制巨噬细胞介导的炎症反应，说明西红花醛对炎症具有显著的治疗作用，可望用于制备预防或/和治疗炎症的药物或保健品，尤其是用于制备由巨噬细胞介导的炎症的药物或保健品。
实施例7：西红花醛抑制小鼠结肠炎的作用研究
7.1实验材料
DSS(36,000-50,000Da)，购于美国MP Biomedicals公司。
空白对照溶液：空白对照溶液用含有0.5％吐温-80的生理盐水溶液；Safranal：称取Safranal于离心管中，计算实验所需溶液体积，向离心管中加入含0.5％吐温-80的生理盐水，涡旋混匀并超声，分装至5mL离心管中。4％多聚甲醛：称取40g多聚甲醛粉末，加入1LPBS溶液，加热至65℃过夜助溶，使用浓盐酸将PH调至7.4。
7.2实验方法
小鼠适应环境一周后，对小鼠进行称重，将小鼠随机分成四组(n＝10-14/组)；实验分组如下：(1)正常组：自由饮水，不给予DSS和药物处理；(2)3.5％DSS组：给与含3.5％DSS的饮用水，含0.5％吐温-80的生理盐水给与灌胃；(3)Safranal低剂量组；(4)Safranal高剂量组；在实验期间，每天记录个体体重和结肠炎的症状(体重下降，腹泻严重程度，便血)的变化；连续灌胃给药7天，在第8天处死动物，取出每只小鼠的结肠，用于后续的ELISA、RT-PCR、HE染色和IHC实验；测得的结肠长度为回盲肠连接处和近端直肠之间的长度；结肠组织用盐水冲洗以除去粪便残留物，并且剥离净粘附的脂肪组织。本实验中，###p<0.001表示该组与对照组相比存在显著性差异，**p<0.01和***p<0.001表示该组与葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎组相比具有显著性差异。
7.3实验结果
实验结果如图15至17所示。
图15为西红花醛(Safranal)对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的体重影响图；从图15可见，正常组小鼠体重随实验周期持续上升，与正常组小鼠相比，3.5％DSS组从第5天开始体重明显减轻，而在第8天，Safranal轻微地减轻了DSS导致的小鼠体重下降。
图16为西红花醛(Safranal)对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的病情活动指数(DAI值)影响图；从图16可见，DAI逐渐增加并在第8天达到最大值，与3.5％DSS组DAI值的增加相比，Safranal呈浓度依赖的方式显著地降低了DAI值。
图17为西红花醛(Safranal)对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠长度影响图；图中A和B分别为结肠长度的柱状图和照片图；从图17可见，模型组的结肠明显***变短，而高剂量的Safranal能明显增加结肠长度，且有显著性差异。
另外，实验期间观察发现，正常组小鼠活动正常，毛发有光泽，饮水量正常，且大便成型呈颗粒状，3.5％DSS组小鼠活动减少，毛发无光泽、竖立凌乱，粪便逐渐变松散且出现便血，实验后期饮水饮食减少，大便溏稀带血，Safranal组较3.5％DSS组症状有所缓解。
本实验结果表明，西红花醛能够改善DSS诱导的结肠炎模型小鼠的结肠炎症状，说明西红花醛对溃疡性结肠炎具有显著的治疗作用，可望用于制备预防或/和治疗溃疡性结肠炎的药物或保健品。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
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