阅读说明：本技术 原儿茶醛在抑制CtBP1中的应用 (Application of protocatechualdehyde in inhibiting CtBP1 ) 是由 李福伦 邓禹 徐志建 郭婉军 华亮 朱圣杰 郭冬婕 冯心怡 李斌 于 2019-11-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及原儿茶醛在制备CtBP1抑制剂中的应用,功能研究表明,PA可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。此外,我们发现在乳腺癌细胞中,PA可提高CtBP1的靶基因P21和E-cadherin的表达水平,同时能够降低P21和E-cadherin启动子区域的CtBP1结合强度。然而,在我们采用CRISPR/Cas9构建的CtBP1基因敲除的乳腺癌细胞中,PA不能对P21和E-cadherin的表达水平产生影响。另外,在CtBP1基因敲除的乳腺癌细胞中可观察到对PA诱导的增殖和迁移的抑制作用的抵抗。我们的研究结果表明,PA可直接与CtBP1结合,其抗癌活性的分子机制之一是靶向CtBP1,表明PA是一种潜在的CtBP1抑制剂。(The invention relates to application of protocatechualdehyde in preparation of a CtBP1 inhibitor, and functional research shows that PA can inhibit proliferation and migration of breast cancer cells. In addition, we found that in breast cancer cells, PA can increase the expression level of target genes P21 and E-cadherin of CtBP1, and can reduce the CtBP1 binding strength of P21 and E-cadherin promoter regions. However, in the breast cancer cells with CtBP1 gene knockout constructed by using CRISPR/Cas9, PA can not influence the expression level of P21 and E-cadherin. In addition, resistance to inhibition of PA-induced proliferation and migration was observed in CtBP1 knock-out breast cancer cells. Our research results show that PA can be directly combined with CtBP1, and one of molecular mechanisms of the anticancer activity of PA is targeting CtBP1, which shows that PA is a potential CtBP1 inhibitor.)

原儿茶醛在抑制CtBP1中的应用

技术领域

本发明涉及药物的新适应症技术领域，具体地说，是原儿茶醛在抑制CtBP1中的应用。

背景技术

羧基末端结合蛋白(C-terminal-binding proteins,CtBP)是进化上保守的转录辅抑制因子。有研究表明CtBP与肿瘤发生和进展相关，CtBP能促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)并作为凋亡拮抗剂，参与对多个肿瘤抑制基因的抑制。上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达缺失是多种上皮性肿瘤EMT的特征性分子事件，CtBP介导的E-cadherin抑制显示其在促进肿瘤EMT中的重要作用，EMT是导致肿瘤细胞恶性特征的一个步骤：失去肿瘤的细胞黏附分子、获得迁移和侵蚀表型、凋亡抗性等。

脊椎动物的CtBP由CtBP1基因和CtBP2基因编码，表达产生CtBP1和CtBP2两种蛋白。C端结合蛋白1(C-terminal binding protein 1，CtBP1)作为一种转录辅阻遏物，可在多种癌症中过表达。CtBP1可通过抑制诸多肿瘤抑制因子，从而能够促进癌细胞增殖，迁移，侵袭和抗细胞凋亡。

原儿茶醛(Protocatechuic aldehyde，PA)，化学名为3,4-二羟基苯甲醛，源于活血化瘀药物(如丹参、四季青叶、鼠尾草)的水溶性提取物。由于原儿茶醛的抗氧化活性来自其邻二酚的母核，因此它具有多种生理活性，如扩张动脉、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、抗脂质过氧化和清除自由基等作用。

近年来随着人们对原儿茶醛的研究报道越来越多，其新的药理作用被陆续发现。XuY等发现PA进行尾静脉推注能降低盲肠结扎和穿孔诱导发生败血症大鼠的致命性，其保护机制是通过HMGBl和NF-jB信号通路来阻断发炎部位。而Zou Z等首次证明PA具有抗HBV作用，不但能有效抑制离题细胞株HBV复制，而且能有效抑制在体DHBV的复制。Gao J等发现PA能通过调控DJ-1基因保护人神经母细胞瘤细胞。中国专利文献CN201910615961.6公开了原儿茶醛在制备细菌群体感应系统的抑制药物中的应用。中国专利文献CN 201610711489.2公开了原儿茶醛在治疗急性肾损伤药物中的应用。但关于PA对于CtBP1的作用机制，目前还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和技术不足，提供一种原儿茶醛在制备CtBP1抑制剂中的应用。

本发明的又一目的，是提供一种原儿茶醛在抑制与CtBP1过表达相关的细胞增殖和迁移和/或治疗CtBP1过表达的疾病的药物中的新用途。

本发明的再一目的，是提供一种CtBP1抑制剂。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

原儿茶醛在制备CtBP1抑制剂中的应用。

在得知本发明的原儿茶醛对CtBP1的抑制效果以后，本领域技术人员可采用多种常规方法来将其他含有原儿茶醛的原料加工成合成或半合成的原儿茶醛的可药用的盐和酯、选择性取代的类似物或者包含原儿茶醛的一种或多种化合物的组合，还包括原儿茶醛的衍生物。所述的加工包括但不限于：粉碎、水提取、有机溶剂提取等。更具体的，所述的加工例如包括步骤：称取、粉碎、煎煮等。

优选地，所述原儿茶醛作为药物的单一活性成分或与其他CtBP1抑制剂共同作为活性成分。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

原儿茶醛在制备抑制与CtBP1过表达相关的细胞增殖和迁移和/或治疗CtBP1过表达的疾病的药物中的应用。

优选地，所述原儿茶醛作为药物的单一活性成分或与其他药物共同作为活性成分。

优选地，所述CtBP1过表达的疾病为肿瘤。

本发明还公开了原儿茶醛在设计、开发、制备针对CtBP1过表达的相关抑制剂或将之作为生化试剂、分析试剂或检测试剂中的应用，或原儿茶醛作为研究CtBP1过表达调控的细胞信号通路及其相关靶蛋白生物学功能的新方法和技术方面的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种CtBP1抑制剂，所述抑制剂的活性成分包括治疗有效量的原儿茶醛。

优选地，所述药物还包括与原儿茶醛同时施用后对抑制与CtBP1过表达相关的细胞增殖和迁移和/或治疗CtBP1过表达的疾病的药物有积极作用的成分和/或使原儿茶醛稳定性提高的药学上可接受的载体。

优选地，所述的药学上可接受的载体包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂

“药学上可接受”是指并非在生物学上或其它方面实质上不希望的物质，即可将所述物质给药于个体，而不会导致任何实质上不希望的生物影响或以有害的方式与包含这种物质的组合物的任何组分相互作用。

“载体”也被称为“赋形剂”，包括药剂学中的任何常用赋形剂，并应基于相容性和希望的剂型的释放分布性质来选择。示例性载体物质包括，例如，乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂或助溶剂等。“药学上接受的载体”可包括，例如，***胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、糊精-麦芽糖复合剂、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。可采用本领域公知的方法，将所述药物组合物制备成为口服制剂，如片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸或口服液体等。

功能研究表明，PA可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。此外，我们发现在乳腺癌细胞中，PA可提高CtBP1的靶基因P21和E-cadherin的表达水平，同时能够降低P21和E-cadherin启动子区域的CtBP1结合强度。然而，在我们采用CRISPR/Cas9构建的CtBP1基因敲除的乳腺癌细胞中，PA不能对P21和E-cadherin的表达水平产生影响。另外，在CtBP1基因敲除的乳腺癌细胞中可观察到对PA诱导的增殖和迁移的抑制作用的抵抗。我们的研究结果表明，PA可直接与CtBP1结合，其抗癌活性的分子机制之一是靶向CtBP1，表明PA是一种潜在的CtBP1抑制剂。

附图说明

图1是PA与CtBP1结合图示。其中，A为PA与CtBP1的对接模式，CtBP1在模式图中，a为PA，b为苯丙酮酸酯，短划线为距离；B为使用MST测定法检测PA与CtBP1的结合亲和力图。

图2A为分别用0.1％DMSO或100μMPA处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞的生长曲线，*表示P<0.05；B为通过划痕试验检测乳腺癌细胞的迁移能力图像，显示了经过或未经过PA处理的划痕。条形图中显示的划痕闭合面积的百分比是来自三份实验数据的平均值±标准差，*表示P<0.05；C为通过transwell实验检测乳腺癌细胞迁移能力，从3个随机选择的显微镜视野计算迁移的细胞数，条形图中显示的结果是来自三份实验数据的平均值±标准差，*表示P<0.05。

图3A为在48小时加药处理后，各组细胞P21和E-cadherin mRNA的表达；B为经过48小时PA处理后，P21和E-cadherin蛋白表达水平；C为CtBP1染色质免疫共沉淀图，*表示P<0.05。

图4A为Crispr-Cas9构建的MDA-MB-231和MCF-7CtBP1敲除细胞Sanger测序，证实2个敲除细胞系中的CtBP1的第2个CDS外显子的第57和第58个核苷酸之间具有核苷酸'A'***；B为乳腺癌细胞敲除CtBP1后P21和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平，*表示P<0.05；C为MDA-MB-231和MCF-7细胞中CtBP1的完全敲除增加了PA处理的乳腺癌细胞的IC50值；D为过划痕试验检测CtBP1敲除MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移能力图像，E为通过transwell实验检测CtBP1敲除MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移能力图像；F为DMSO组/100μMPA组的覆盖面积和迁移细胞比率，通过组的平均值计算；G为CtBP1敲除细胞中的P21和E-cadherin蛋白表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1方法与材料

1.1细胞培养试剂

将敲除或未敲除CtBP1基因的MDA-MB-231和MCF-7细胞培养于含有10％FBS的适当培养基中，细胞培养箱条件设置为：37℃，5％CO₂下。原儿茶醛购自Sigma(Cat N.OD108405，St.Louis，MO，USA)并溶解在DMSO中。

1.2基于结构的网络药理学计算筛选

从Protein Data Bank检索到4个分辨率优于2.50的CtBP1结构(PDB代码：1MX3,4LCE，4U6Q和4U6S)。使用OPLS_2005力场，使用Epik 3.4(

LLC，纽约，纽约，美国)对Ligprep 3.6(

LLC，New York，NY，USA)预处理8000种内部化合物，以在pH7.0±2.0下产生适当的质子化状态。选择4U6S中的底物苯基丙酮酸盐以限定对接网格。基于默认参数，8000个内部化合物与4个CtBP1结构的计算机对接由Glide 6.9(

LLC，New York，NY，USA)以标准精度(SP)进行。基于对接构象的人工检查，选择PA用于进一步的体外分析。

1.3微量热涌动检测

应用微量热涌动检测(Microscale thermophoresis，MST)以确定CtBP1与PA的结合亲和力。通过使用整体蛋白标记试剂盒(NanoTemper Technologies Cat N.O L001，Germany)用荧光染料标记重组人CtBP1蛋白(Abnova Cat N.O H00001487-P01，Taiwan，China)。在含有20mM Tris，0.3M Nac1，5％甘油，3％DMSO和0.05％Tween-20的PH7.4缓冲液中进行测定。蛋白标记完成后，将样品加载到Monolith NT.115(NanoTemperTechnologies，Germany)标准玻璃毛细管中。在MST实验期间，3.15μM标记的CtBP1保持恒定，而PA的浓度连续1：2稀释，总共制备16个梯度稀释的PA，从最大终浓度0.66mM到最小浓度0.05nM，并与标记的CTBP1混合。上样结束后，在Monolith NT.115装置中进行上机检测。

1.4蛋白质印迹分析

采用含有1X蛋白酶抑制剂的RIPA150裂解缓冲液(Cat N.O 04693116001；Sigma，St.Louis，MO，USA)裂解细胞。然后，通过SDS-PAGE分离总细胞裂解物样品并转移至PVDF膜(Cat N.O162-0177；Bio-Rad，CA，USA)，将膜与一抗和二抗孵育。使用增强化学发光试剂(Cat N.O34577；Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)检测信号。用于蛋白印迹分析的一抗是兔抗P21(Cat N.O2947；Cell Signaling Technology，USA)，兔抗CtBP1(Cat NOab129181；Abcam，Cambridge，UK)，鼠抗GAPDH(Cat N.O60004-1-Ig ProteinTech，Wuhan，China)和兔抗E-Cadherin(Cat N.O20874-1-AP；ProteinTech，Wuhan，China)。

1.5定量RT-PCR

Trizol(Cat N.O 15596026；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)用于提取总RNA。通过cDNA合成试剂盒(Cat N.O K1622；Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)将100ng总RNA用于逆转录成cDNA。通过以下引物检测E-cadherin和P21表达：

E-cadherin正向引物：5'-GCAGCCAAAGACAGAGCGGAAC-3'，

E-cadherin反向引物：5'ACCCACCTCAATCATCCTCAGCA-3'；

P21正向引物：5'-GCTATTTTGTCCTTGGGCTG-3'，

P21反向引物：5'ATTAGCGCATCACAGTCG-3'；

18S表达用作内部对照，序列为：

18S正向引物：5'-TGACGGAAGGGCACCACCAG-3'，

18S反向引物：5'GCACCACCACCCACGGAATC-3'。

相对表达水平通过用内部对照标准化来计算。

1.6染色质免疫共沉淀(ChIP)

将经过或未经过100uM PA处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞用于ChIP测定。将80％汇合的细胞用1％甲醛交联15分钟，然后用0.125M甘氨酸终止。细胞沉淀在裂解缓冲液中进行超声破碎处理。用CtBP1抗体(Cat N.O ab129181；Abcam，Cambridge，UK)和蛋白A珠(CatN.O 26159；Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)沉淀片段化的DNA。将沉淀的蛋白质/DNA复合物与另外的350mM NaCl在65℃下反向交联6小时。然后纯化DNA片段并用于PCR分析。用于检测E-cadherin和P21启动子的引物如下。

E-cadherin正向引物：5'-GGCGTCGGAACTGCAAAGCA-3'，

E-cadherin反向引物：5'-GGAGCGGGCTGGAGTCTGAA-3'。

P21正向引物：5'-TCTTTTCAGCTGCATTGGG-3'，

P21反向引物：5'-TTGGAGAATGAGTTGGCAC-3'。

Line1用作内部对照，引物序列为：

Line1正向引物：5'-GCGCAAGGGGTCAGGGAGTT-3'，

Line1反向引物：5'-CTCGTGGTGCGCCGTTTCTT-3'。

1.7MTT测定

MTT测定法用于检测细胞生长和IC₅₀。MTT测定试剂盒购自Sigma(CatN.O11465007001；Sigma，St.Louis，MO，USA)并按照制造商的推荐实验方案进行。每个测定重复三次。

1.8CRISPR/Cas9介导的CtBP1敲除

我们通过慢病毒介导的敲除方式构建CtBP1敲除细胞。在实验中使用的sgRNA序列是：

正向5'-CACCGGTCCGACCTCCGATCATGAA-3'；

反向5'-AAACTTCATGATCGGAGGTCGGACC-3'。

将经过处理的sgRNA寡聚物连接到从Addgene(质粒#52961)获得的lentiCRISPR载体中。将构建完成包含CtBP1 sgRAN的lentiCRISPR载体用包装质粒psPAX2和pMD2转导到293T细胞中以产生慢病毒。用慢病毒感染MDA-MB-231和MCF-7细胞24小时，然后用1μg/ml嘌呤霉素筛选14天。将筛选的细胞以1个细胞/孔接种到96孔板中。在单细胞扩增至克隆形成后，取部分细胞通过蛋白质印迹法验证CtBP1表达水平。将没有CtBP1蛋白表达的克隆送至Sanger测序以进一步确认。

1.9细胞划痕实验

将6孔板中的细胞培养于含有或不含PA的培养基中。通过200μl移液管在单层细胞中产生均匀的划痕。培养MAD-MB-231 24小时或培养MCF-7细胞48小时后，通过Image-J软件测量愈合区域的百分比。该测定重复三次。

1.10Transwell试验

将转染的1X105细胞接种在含有无血清DMEM培养基的聚碳酸酯transwell小室(Cat N.O 353097；Corning Costar，USA)的上侧，并且用含有10％FBS的DMEM培养基填充transwell小室的下侧。对于MDA-MB-231细胞，将50μM或100μM PA加入小室上侧培养48小时。对于MCF-7细胞，将50μM或100μM PA加入小室上侧培养72小时。孵育后，用棉签除去留在小室上侧的细胞。用1X PBS洗涤小室2次，并用95％乙醇将穿过的细胞固定在小室的下侧20分钟。固定的细胞用0.1％结晶紫进行染色。图像由Olympus LX73显微镜拍摄。(OlympusCorporation，Tokyo，Japan)

2实验结果

2.1PA直接与CtBP1结合

如图1所示，PA直接与CtBP1结合，结合亲和力为612nM±13.7nM。

2.2PA抑制乳腺癌细胞的生长和迁移

如图2所示，用0.1％DMSO处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞相对生长率逐渐增大，用100μM PA处理的细胞，生长受到抑制(图2A)；通过划痕试验检测乳腺癌细胞的迁移能力，对于MDA-MB-231和MCF-7细胞，PA在50μM浓度下均表现出抑制作用(图2B)；通过transwell实验检测乳腺癌细胞迁移能力，从3个随机选择的显微镜视野计算迁移的细胞数，结果与划痕试验检测结果一致(图2C)。

2.3PA下调MDA-MB-231和MCF-7细胞中P21和E-cadherin的表达

实验结果如图3所示，在48小时加药处理后显示，PA以剂量依赖性方式上调P21和E-cadherin mRNA的表达以及P21和E-cadherin蛋白表达水平(图3A、B)；CtBP1染色质免疫共沉淀测定显示，PA处理降低了P21和E-cadherin的启动子区域的CtBP1结合强度。

(图3C)

2.4CtBP1敲除增加对PA的抵抗

实验结果如图4所示，Crispr-Cas9构建的MDA-MB-231和MCF-7CtBP1敲除细胞，Sanger测序证实2个敲除细胞系中的CtBP1的第2个CDS外显子的第57和第58个核苷酸之间具有核苷酸'A'***(图4A)；乳腺癌细胞敲除CtBP1，可增加P21和E-cadherin mRNA和蛋白表达水平(图4B)；MDA-MB-231和MCF-7细胞中CtBP1的完全敲除增加了PA处理的乳腺癌细胞的IC50值(图4C)；CtBP1敲除在MDA-MB-231和MCF-7细胞中显示出对PA诱导的迁移抑制的抵抗。50μM PA对敲除细胞没有任何抑制作用，但100μMPA仍显示轻微抑制(图4D、E)；与CtBP1表达细胞相比，100μM PA抑制CtBP1敲除细胞迁移的作用降低。相对抑制效果由DMSO组/100μMPA组的覆盖面积或迁移细胞比率表示，通过组的平均值计算(图4F)。CtBP1敲除细胞中的P21和E-cadherin蛋白表达水平对PA处理无应答(图4G)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。