肉桂醛在制备用于治疗卵巢上皮癌药物中的应用及其药物制剂
阅读说明：本技术 肉桂醛在制备用于治疗卵巢上皮癌药物中的应用及其药物制剂 (Application of cinnamaldehyde in preparing medicine for treating ovarian epithelial cancer and medicinal preparation thereof ) 是由 蓝婷 王悦 王忠诚 穆春艳 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了肉桂醛在制备用于治疗卵巢上皮癌药物中的应用及其药物制剂,属于生物医药领域。实验结果显示,肉桂醛能通过逆转EMT过程抑制卵巢上皮癌细胞增殖、迁移和侵袭,从而抑制卵巢上皮癌的生长。肉桂醛对正常卵巢上皮细胞毒性较小,说明对正常人体细胞伤害较小；肉桂醛并非直接通过杀死卵巢上皮癌细胞,而是通过逆转EMT过程来抑制卵巢上皮癌细胞增殖、迁移和侵袭,因此不易产生耐药性；肉桂醛对裸鼠移植的卵巢上皮癌生长有明显的抑制作用,这在新型抗卵巢上皮癌药物的研发中具有很好的应用前景。本发明拓宽了肉桂醛的应用领域,为肉桂醛在制备治疗卵巢上皮癌药物方面的临床应用提供了实验依据,具有良好的应用前景和巨大的潜在价值。(The invention discloses application of cinnamaldehyde in preparation of a medicine for treating ovarian epithelial cancer and a medicinal preparation thereof, and belongs to the field of biological medicines. The experimental result shows that the cinnamaldehyde can inhibit the proliferation, migration and invasion of the ovarian epithelial cancer cells by reversing the EMT process, thereby inhibiting the growth of the ovarian epithelial cancer. Cinnamaldehyde has less toxicity to normal ovarian epithelial cells, which indicates that the cinnamaldehyde has less damage to normal human body cells; the cinnamaldehyde does not directly kill the ovarian epithelial cancer cells, but inhibits the proliferation, migration and invasion of the ovarian epithelial cancer cells by reversing the EMT process, so that drug resistance is not easy to generate; the cinnamaldehyde has an obvious inhibiting effect on the growth of the ovarian epithelial cancer transplanted to the nude mouse, and has a good application prospect in the research and development of novel anti-ovarian epithelial cancer drugs. The invention widens the application field of the cinnamaldehyde, provides experimental basis for the clinical application of the cinnamaldehyde in the aspect of preparing the medicine for treating the ovarian epithelial cancer, and has good application prospect and great potential value.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及肉桂醛在制备用于治疗卵巢上皮癌药物中的应用及其药物制剂。
背景技术
卵巢癌作为最致命的妇科肿瘤之一，在全球范围内每年约有239000被诊断为卵巢癌，并且有152000人死于此病及其并发症，上皮性卵巢癌是卵巢癌的主要类型。由于缺乏有效的早期筛查手段，大多数卵巢癌病人被确诊时已经处于晚期。目前临床上对于卵巢上皮癌的一线治疗方法包括外科手术以及辅助化疗手段，被诊断为Ⅲ期或Ⅳ期卵巢上皮癌的患者五年生存率不到25％，尽管大多数患者在治疗初期对治疗药物敏感，但最终都会发展为化疗耐药。
目前临床上用于卵巢上皮癌治疗的药物主要包括铂类药物、紫杉醇类药物、贝伐单抗以及多腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyADPribosepolymerase,PARP)抑制剂等分子靶向药物，但仍然存在不良反应较多、耐药、广谱抗癌、价格昂贵等缺点，且目前卵巢上皮癌在世界范围内的总体生存率并没有显著提高。因此，探究一种新的治疗卵巢上皮癌的新型天然药物非常重要。
发明内容
本发明的目的在于提供肉桂醛在制备用于治疗卵巢上皮癌药物中的应用及其药物制剂，为进一步开发针对卵巢上皮癌的药物提供重要的数据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
提供肉桂醛在制备治疗卵巢上皮癌药物中的应用。
所述肉桂醛(Cinnamaldehyde)是存在于肉桂茎皮中的一种天然产物，是一种醛类有机化合物，其CAS号为104-55-2，分子式为C9H8O，分子量为132.16，黄色粘稠状液体，难溶于水，沸点为253℃(常压)，其结构如下所示：
优选的，所述药物用于抑制卵巢上皮癌细胞的上皮间质转化过程。
优选的，所述肉桂醛的用量为20mg/kg。
另一方面本发明还提供一种用于治疗卵巢上皮癌的药物制剂，包括(1)有效量的作为活性成分的肉桂醛，(2)选择性的药学上可接受的载体。
优选的，所述药物剂型为胶囊剂、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂或注射剂。
上皮间质转化((Epithelial-mesenchymal transition，EMT)：是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。该过程具体是指发生在胚胎发生、伤口愈合、炎症、肿瘤进展以及纤维化过程中的一种可逆性的分化转化过程，EMT被认为与肿瘤的进展密切相关，包括向细胞外基质的侵袭能力与向远处器官转移能力的增强，使癌症逐步转变为高级别恶性肿瘤，实验发现在上皮性肿瘤中逆转制EMT过程可以有效抑制癌症的进展。
细胞和动物实验结果显示，肉桂醛能够通过逆转EMT过程抑制卵巢上皮癌细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制卵巢上皮癌的生长，说明肉桂醛可以作为抗癌药物治疗卵巢上皮癌。另外，肉桂醛对正常卵巢上皮细胞毒性较小，说明对正常人体细胞伤害较小；而且肉桂醛并非直接通过杀死卵巢上皮癌细胞，而是在有效的浓度剂量下通过抑制卵巢上皮癌细胞的 EMT过程来实现发明目的，因此不易产生耐药性；并且肉桂醛对裸鼠移植的卵巢上皮癌生长有明显的抑制作用，这在新型抗卵巢上皮癌药物的研发中具有很好的应用前景。
本发明以抑制卵巢上皮癌细胞EMT过程为切入点，有针对性的筛选出一种低毒、不易产生耐药性、对卵巢上皮癌细胞EMT过程及卵巢上皮癌细胞生长起抑制作用的天然药物。肉桂醛是存在于肉桂茎皮中的一种天然产物，在卵巢上皮癌的治疗中尚未见报道，将其作为新型抗卵巢上皮癌天然药物具有较好的潜在临床价值。本发明拓宽了肉桂醛的应用领域，为肉桂醛在制备治疗卵巢上皮癌药物方面的临床应用提供了实验依据，具有良好的应用前景和巨大的潜在价值。
附图说明
图1为卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)中分别加入不同浓度的肉桂醛之后的蛋白质印迹分析结果显示图；(A)SKOV3；(B)A2780；图中，E-cad代表E-钙粘蛋白、N-cad 代表N-钙粘蛋白、Vimentin代表波形蛋白、Snail代表转录因子Snail，这四种作为EMT标志蛋白，β-actin为肌动蛋白，作为内参使用，CA代表肉桂醛；
图2为卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)中分别加入不同浓度的肉桂醛之后的的免疫荧光分析结果显示图；(A)SKOV3；(B)A2780；图中，E-cad代表EMT标志蛋白 E-钙粘蛋白、N-cad代表EMT标志蛋白N-钙粘蛋白、DAPI代表4'，6-二脒基-2-苯基吲哚、Merge代表将E-cad/N-cad与DAPI融合到一起的图像、CA代表肉桂醛；
图3为正常卵巢上皮(IOSE80)和卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)中分别加入不同浓度肉桂醛后通过CCK8检测细胞的增殖能力统计图；(A)IOSE80的细胞增殖统计图； (B)SKOV3的细胞增殖统计图；(C)A2780的细胞增殖统计图；图中，CA代表肉桂醛， callviability代表细胞的增殖能力；
图4为卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)中分别加入不同浓度肉桂醛后通过划痕实验检测的划痕板表观图和划痕面积统计图；(A)A2780的划痕板表观图；(B)A2780的划痕面积统计图；(C)SKOV3的划痕板表观图；(D)SKOV3的划痕面积统计图；图中， CA代表肉桂醛，Realitive Cell viability代表细胞的迁移能力；
图5为卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)中分别加入不同浓度肉桂醛后通过Trans-well 法检测侵袭细胞的染色结果图和数量统计图；(A)SKOV3和A2780的入侵细胞染色结果图；(B)SKOV3的入侵细胞数量统计图；(C)A2780的入侵细胞数量统计图；图中， CA代表肉桂醛，numbers ofmigratedcells代表细胞的侵袭能力；
图6为卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)中分别加入不同浓度肉桂醛后通过流式细胞术检测细胞凋亡数量统计图；(A)SKOV3和A2780的流式图；(B)A2780中细胞凋亡数量统计图；(C)SKOV3中细胞凋亡数量统计图；图中，CA代表肉桂醛，7-AAD和 Annexin-APC代表荧光通道，Q2象限代表早期凋亡细胞，Q4象限代表晚期凋亡或坏死细胞；apoptosis代表细胞凋亡百分数；
图7为在裸鼠体内成瘤实验中，经不同浓度肉桂醛处理后，各组间裸鼠体重随时间变化差异曲线图；图中，weight代表裸鼠体重，Cinnamaldehyde代表肉桂醛；
图8为在裸鼠体内成瘤实验中，经不同浓度肉桂醛处理后，各组间裸鼠肿瘤重量差异相关附图；(A)小鼠腹腔内肿瘤实物图；(B)肿瘤重量数据示意比较图；图中，tumorweight代表肿瘤重量，CA代表肉桂醛；
图9为在裸鼠体内成瘤实验中，经不同浓度肉桂醛处理后，各组间裸鼠肝脏组织肿瘤转移情况的代表图；图中，CA代表肉桂醛。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂盒材料均为市购。
Western-blot检测法：蛋白免疫印迹法，是应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学中时常会用到的一种实验方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量的分析方法，是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，并且通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
BCA反应工作液：BCA是bicinchoninicacid(二奎林甲酸蛋白)的缩写，BCA法是一种广为使用的蛋白定量法，其中用到的BCA反应工作液是试剂A(BCA碱性溶液)和试剂 B(硫酸铜溶液)的混合液，试剂A与试剂B的比例为50：1。
loadingbuffer：Western-blot检测法中使用的上样缓冲液，用于显示电泳的进程以及使样品沉到点样孔中而不漂浮起来。
Acr-Bis：丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺溶液。
Tris-HCI缓冲液：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
SDS缓冲液：十二烷基硫酸钠缓冲液。
ddH20：doubledistilledwater的缩写，即双蒸水，是将经过一次蒸馏后的水再次蒸馏所得到的水。
EP管：微型离心管，实验室耗材，是一种小型的离心管，与微型离心机配套使用，用于微量试剂的分离。
TEMED：四甲基乙二胺，用于配制SDS-PAGE胶。
Marker：蛋白标记，预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。
PVDF膜：聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
TBST：含有Tris-Hcl、NaCl和Tween20，是蛋白免疫印迹法中常用的一种缓冲液。
DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA 强力结合的荧光染料，常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
本发明中肉桂醛购自Aladdin公司。
抗体：一抗包括：p-AKT、p-PI3K、p-mTOR、AKT、PI3K、mTOR、β-actin，购自affinity公司；二抗包括：HRP标记的羊抗兔二抗、HRP标记的羊抗鼠二抗，购自affinity公司；羊抗兔荧光二抗、羊抗鼠荧光二抗，购自Thermo公司。
正常人源卵巢上皮细胞(IOSE80)和人源卵巢上皮癌细胞(SKOV3、A2780)从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购买。
雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2007-0001。将小鼠置于湿度为50±10％，温度为23±2℃的标准条件下，昼夜各12h适应生存。小鼠可自由饮水与进食。所有的动物管理与处理方案都经徐州医科大学动物伦理委员会批准。所有实验都是按照《管理和使用动物行为道德准则》的建议进行。
实施例一：肉桂醛抑制EMT活性的检测
1.western-blot检测法中A2780与SKOV3分别分为4组，实验分组如下：
实验组1：0ug/ml肉桂醛
实验组2：5ug/ml肉桂醛
实验组3：10ug/ml肉桂醛
实验组4：20ug/ml肉桂醛
免疫荧光检测法中A2780与SKOV3分别分为3组，实验分组如下：
实验组1：0ug/ml肉桂醛
实验组2：10ug/ml肉桂醛
实验组3：20ug/ml肉桂醛
2.细胞处理
A2780与SKOV3细胞贴壁后，密度80％左右时向各组中加入相应浓度的肉桂醛处理48h。
3.采用Western-blot检测法(蛋白质免疫印迹方法)对各组细胞进行后续的处理和检测，具体方法为：
A、蛋白质提取及浓度测定
(1)细胞：培养细胞的六孔板置于冰上，吸掉培养基，每孔加入100ul细胞裂解液，冰上静置3-5min，用细胞刮将细胞刮下，收集细胞裂解液于1.5ml离心管中，在混旋仪上振荡20s，冰上静置30min；
(2)将静置后的EP管置于低温离心机内，4℃离心(15000rpm×18min)；
(3)轻轻吸取上清液于另一标好的EP管内，即得到总蛋白溶液；
(4)检测蛋白浓度：各样本取5ul蛋白溶液加入20ul ddH20稀释5倍，取10ul于96孔板中，每个样品做2个复孔；
(5)在96孔板的最前一列中加入蛋白标准品A-H，浓度由高到低；
(6)避光条件下配制BCA反应工作液(A：B＝50：1)混匀，每孔加入100ul工作液，轻轻震荡混匀，用锡纸包裹避光37℃温箱内孵育30min；
(7)酶标仪检测562nm波长下各孔光密度(OD)值及蛋白样品的浓度；
(8)未使用蛋白分装后于-80℃保存。
B、蛋白变性
根据所需的蛋白量及实验上样次数计算加入的蛋白液体积。以每孔30ug总蛋白需上样 4次以便检测不同的试验指标进行电泳为例，计算所需蛋白溶液体积(ul)＝(30ug蛋白/ 蛋白浓度)×5，再补ddH20至15ul×5＝75ul，再加入3ul×5＝15ul的6×loadingbuffer (6×loadingbuffer：β-疏基乙醇＝9：1)，封好口，沸水中煮5min，4℃保存。
C、SDS-PAGE凝胶电泳
(1)制备10％的聚丙烯酰胺分离胶(2块胶量)：取配胶专用瓶，分别加入以下试剂，注意混匀：ddH204ml；30％Acr-Bis3.3ml；1.5MTris-HCl缓冲液(pH8.8)2.5ml；10％SDS 缓冲液0.lml；10％过硫酸胺(AP)0.1m1l，TEMED0.004ml，混匀，用1ml枪吸取分离胶注入电泳槽的玻璃平板夹层中，注意不要形成气泡，加入胶量约2/3小玻璃板高度即可，再缓缓加入约1ml异丙醇液封压线，室温聚合30min左右；
(2)制备5％聚丙烯酰胺浓缩胶(2块胶量)：取配胶专用瓶，分别加入以下试剂，注意混匀：ddH202.7ml；30％Acr-Bis0.67ml；1.0M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)0.5ml；10％SDS缓冲液0.04ml；10％过硫酸胺0.04ml；TEMEDO.004ml，混匀；
(3)将凝好的分离胶顶部的异丙醇轻轻倒去，用滤纸吸干残存液体，将浓缩胶注入夹层顶部，插入梳子，室温聚合30min；
(4)胶凝固后，将凝胶板固定于电泳装置的上缓冲液室，加入电泳液，拔出梳子，用微量进样器吸取18ul样品溶液加至加样孔，在第一个样孔加入Marker，最后一个样孔加入1×loadingbuffer，放入以倒好1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液的电泳装置中；
(5)接通电源，浓缩胶电压为90V，电泳约30min，分离胶电压为120V，电泳直至溴酚兰抵达分离胶底部，原则上应根据目的蛋白分子量的大小，调节电压的大小和分离胶的时间；
(6)关闭电源，取下凝胶，根据Marker切取包含目的蛋白胶，供下一步的转膜用。
D、转膜(全湿法)
(1)根据裁剪的目的胶的大小剪取适当大小的PVDF膜，并在膜上剪角做标记，置于甲醇中浸湿1-3min，再转移到1×转膜缓冲液中；
(2)按负极侧-多孔滤棉-厚滤纸-胶-PVDF膜-厚滤纸-多孔滤棉-正极侧的顺序装好转膜装置，然后置入Bio-RAD电泳仪内，倒入1×转膜液，冰浴转膜，根据目的蛋白的分子量确定转膜时间，一般多用恒流350mA，转移2h，或400mA，转移1.5h；
(3)转膜结束后，将PVDF膜剪去一角以标记膜的正反面，使Marker在左侧并且由下到上为增大顺序，剪角在左上，用1×TBST溶液漂洗3次×10min；
(4)将ECL中的A、B两种液体等体积混合，均匀滴到膜上(避光)，用化学发光凝胶成像系统拍照。
E、免疫反应
(1)将漂洗后的转印膜放入5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h，并在摇床上缓慢摇；
(2)将一抗用5％脱脂奶粉封闭液稀释至适当浓度，在膜上覆盖适量的抗体，4℃孵育过夜；
(3)用1×TBST洗3次×15min，在摇床上摇动；
(4)5％脱脂奶粉封闭液稀释二抗至适当浓度，在膜上覆盖适量的抗体，室温湿盒孵育 1-2h；
(5)用1×TBST洗3次×15min，在摇床上摇动；
(6)将ECL中的A和B两种试剂等体积混合，均匀加到膜上(避光)，用化学发光凝胶图像系统拍照。
4.免疫荧光
(1)铺板及加药：选取状态良好的细胞，消化并计数，调整细胞密度，使24孔板每孔细胞总数为5×104个。待细胞贴壁后，饥饿过夜，按不同组别将DMSO处理，10ug/ml、 20ug/ml浓度的肉桂醛分别加入各个孔中，培养箱中作用1h；
(2)固定及通透：取出24孔板，用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定15min，再用PBS 洗3次，0.3％Triton-x100通透10min；
(3)封闭及孵育：用PBS洗3次，3％BSA室温封闭1～2h，用预稀释的一抗4℃过夜孵育；PBS洗3次，避光加入预稀释的荧光二抗，37℃放置1～2h；
(4)核复染：PBS洗3次，DAPI染液染8～10min，PBS洗3次，滴加抗荧光淬灭剂。
5.实验结果
本实验采用western-blot与免疫荧光检测EMT标志性蛋白：E-cad、N-cad、Vimentin、 Snail蛋白经肉桂醛处理后(0ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，20ug/ml)在卵巢上皮细胞癌A2780 与SKOV3中的表达。结果如图1-2所示，经肉桂醛处理后，随着肉桂醛浓度的逐渐上升，细胞内E-cad表达水平逐渐升高，N-cad、Vimentin、Snail表达水平逐渐下降，提示适当浓度的肉桂醛可以逆转卵巢上皮癌细胞株的EMT过程。由此可知，肉桂醛可以逆转卵巢上皮细胞癌A2780与SKOV3的EMT过程，可以作为EMT抑制剂使用。
实施例二：肉桂醛抑制卵巢上皮癌细胞的增殖、侵袭能力
1.A2780、SKOV3与IOSE80分别分为6组，实验分组如下：
实验组1：0ug/ml肉桂醛
实验组2：0.5ug/ml肉桂醛
实验组3：1ug/ml肉桂醛
实验组4：5ug/ml肉桂醛
实验组5：10ug/ml肉桂醛
实验组6：20ug/ml肉桂醛
2.CCK8实验，步骤如下：
(1)铺板及加药：选取对数生长期的细胞，消化并计数，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔板中，每孔100μL，96孔板周边加入适量PBS防止水分蒸发。细胞贴壁后，用无血清培养基饥饿过夜，按不同组别将相应量的肉桂醛分别加入各个孔中，放入培养箱培养；
(2)终止及测定：培养24h、48h、72h避光条件下每孔加入CCK-8试剂10μL，混匀后置于37℃，5％CO2的培养箱中1～2h，在酶标仪450nm处读数。
3.划痕实验，步骤如下：
(1)铺板：实验前一天，将直尺、记号笔、10μL高压过的枪头在生物安全柜内紫外照射30min，在6孔板的背面用记号笔标记横穿过孔的直线；消化细胞并接种至6孔板中，接种密度为次日贴壁细胞约为90％的融合度；
(2)划痕及加药：实验时，用无菌10μL枪头比着直尺，以相同的角度和力度划线划痕，每孔划3条直线。PBS洗2次，加入1ml含1％FBS的DMEM培养基，按不同组别将相应量的肉桂醛分别加入各个孔中，将6孔板放入培养箱继续培养；
(3)拍照与分析：分别在0h、24h、48h于相同位置拍照，测量各时间点伤口距离，实验结果通过Image J软件进行分析。
4.Trans-well侵袭实验
(1)侵袭实验包被基底膜：实验前一晚，将Matrigel基质胶从-20℃取出置于4℃过夜融化。Matrigel基质胶与预冷的无血清培养基按1∶5稀释，取100μL稀释胶加入Trans-well 小室上室，避免出现气泡，将小室放入24孔板中，置于培养箱中4～6h；
(2)铺板及加药：消化细胞并计数，用无血清培养调整细胞密度为2×105/ml，吸取200μL 细胞悬液加入小室上层，600μL完全培养基加入小室下层，将小室放入24孔板中，避免产生气泡，按不同组别将相应量的肉桂醛分别加入各小室中，放入培养箱，培养48h；
(3)固定及染色：取出小室，弃去培养基，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗3遍，结晶紫染液染色10min，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉上室未穿过的细胞；
(4)拍照及分析：取出小室，200倍倒置显微镜下拍照，随机计数五个视野细胞。
5.实验结果
本实验采用CCK8、划痕实验、transwell侵袭实验分别检测卵巢上皮癌细胞株A2780、 SKOV3与卵巢正常上皮细胞株IOSE80经肉桂醛处理后(0ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)，细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化，结果如图3-5所示。从图3中可以看出，在适当肉桂醛的浓度下，随着浓度升高，细胞的增殖能力明显被下降，并且相较于IOSE80细胞株，卵巢上皮癌细胞株对肉桂醛更加敏感，提示在适宜浓度下，肉桂醛可以抑制卵巢上皮癌的增殖能力并且对正常细胞伤害较小。从图4-5中可以看出，在适当肉桂醛的浓度下，随着浓度升高，卵巢上皮癌细胞的迁移能力和侵袭能力明显下降，提示适宜浓度的肉桂醛可以抑制卵巢上皮癌细胞的迁移能力和侵袭能力。
由上分析可知，肉桂醛能够抑制卵巢上皮癌细胞株(A2780、SKOV3)的增殖、迁移和侵袭能力，可以作为抗卵巢上皮癌药物使用。
实施例三：肉桂醛能够促进卵巢上皮癌细胞的凋亡
1.A2780与SKOV3分别分为3组，实验分组如下：
实验组1：0ug/ml肉桂醛
实验组2：5ug/ml肉桂醛
实验组3：20ug/ml肉桂醛
2.流式细胞术检测，步骤如下：
(1)细胞接种于六孔板，密度约为80％左右，细胞贴壁后按不同组别加入相应剂量肉桂醛，处理48h；
(2)用无EDTA胰酶消化细胞(注意胰酶消化时间不能太长)，加入完全培养基终止反应，将细胞移入离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加入适量完全培养基调整细胞浓度为1x10％/ml；
(3)预冷的PBS洗涤细胞2遍，弃上清(尽量弃尽)，加入1x缓冲液100μl重悬细胞；
(4)转入流式管，设空白组、单标组、NC组和实验组进行。空白组：卵巢上皮癌细胞不加任何试剂；单标组(APC)：NC组加入5μ1APC；单标组(7-AAD)：NC组加入5μl Annexin 7-AAD；NC组和实验组分别加入5ul Annexin 7-AAD和5ulAPC；
(5)室温避光条件下，孵育15min；
(6)每管加入400μl 1x缓冲液混匀，1h内流式细胞仪检测。
3.实验结果
本实验通过流式细胞术检测经肉桂醛处理后(0ug/ml、5ug/ml、20ug/ml)，卵巢上皮癌细胞A2780与SKOV3凋亡水平，图6显示，随着肉桂醛浓度的升高，位于Q2象限 (7-AAD+APC+)与Q4象限(7-AAD-APC+)的细胞数量逐渐升高，提示肉桂醛能够提高卵巢上皮癌细胞的凋亡水平，提示肉桂醛能够提高卵巢上皮癌细胞的凋亡水平，说明肉桂醛可以促进卵巢上皮癌细胞的凋亡。由此可知，肉桂醛能够促进卵巢上皮癌细胞株A2780、 SKOV3的凋亡，可以作为抗癌药物使用。
实施例四：肉桂醛在体内对卵巢上皮癌的抑制作用
1.裸鼠被分为三组，每组5只，实验分组如下：
实验组1：PBS对照
实验组2：50mg/kg
实验组3：100mg/kg
2.裸鼠体内成瘤实验：
A、裸鼠腹腔接种肿瘤细胞
(1)待A2780细胞达80-90％左右密度时，收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基；
(2)胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中的血清；
(3)用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般腹腔接种的细胞量为 (1-5)×106个细胞/只，接种体积为0.1ml，因此细胞悬液的浓度为(1-5)×107个细胞/ml。
(4)细胞消化后应尽快接种到裸鼠腹腔，一般尽量在半小时内完成，途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢；
(5)选择的裸鼠在5-8周龄，体重18-20g左右；
(6)接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率；
(7)接种时，裸鼠趴在平坦处，抓住其背部将其倒置后，消毒皮肤，先皮下进针约0.5cm 后45°进针，注射细胞200ul，用棉球压迫5-10S；
B、裸鼠移植瘤之后药物注射
(8)接种一周后，每两天在腹腔注射PBS或相应浓度的肉桂醛大约20天，每天记录裸鼠体重；
(9)约三周后，处死裸鼠，测量肿瘤体积并记录，观察有无腹膜转移并取部分肿瘤组织浸泡于4％多聚甲醛为后续实验准备。
3.实验结果
本实验采用裸鼠体内成瘤实验检测肉桂醛在体内对卵巢上皮癌细胞株A2780生长的抑制作用。如图7所示，裸鼠致瘤成功后，经肉桂醛处理后，小鼠体重随时间缓慢增长，各实验组间无明显差异，提示肉桂醛在体内对小鼠无伤害作用。如图8所示，随着肉桂醛浓度的升高，肿瘤体积逐渐下降，提示肉桂醛在体内对卵巢上皮癌的生长有明显的抑制作用。如图9所示，对照组中，三只小鼠出现了肝脏转移，50mg/kg CA处理组中，仅一只小鼠出现肝脏转移，100mg/kg CA处理组中，组内小鼠均未出现肝脏癌症转移，提示肉桂醛可以抑制卵巢上皮癌细胞在体内的转移。由此可知，肉桂醛抑制卵巢上皮癌细胞在裸鼠体内的增殖与转移，可以作为抗卵巢上皮癌药物使用。
由上述细胞和动物实验结果说明，肉桂醛能够通过逆转EMT过程抑制卵巢上皮癌细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制卵巢上皮癌的生长，说明肉桂醛可以作为抗癌药物治疗卵巢上皮癌。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：二甲双胍在激活雌性生殖干细胞的应用