阅读说明：本技术 柠檬醛在抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌生长中的应用 (Application of citral in inhibition of growth of multidrug-resistant providencia rettgeri ) 是由 钱卫东 付玉婷 刘淼 李靖原 王文静 李鑫辰 黄杰 刘婉婷 于 2019-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了柠檬醛在抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌生长中的应用,根据柠檬醛对耐氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素的人源雷氏普罗威登斯菌,具有较好的体外杀灭作用,能够抑制耐雷氏普罗威登斯菌的生长,且最低杀菌浓度为0.5mg/mL,最小抑菌浓度为0.25mg/mL；本发明提供植物提取物柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的抑菌作用,可缓解或解决多重耐药雷氏普罗威登斯菌的耐药性增加问题,为临床抗细菌治疗及新型药物研发提供理论依据。(The invention discloses an application of citral in inhibiting the growth of multidrug-resistant providencia rettgeri, wherein the human providencia rettgeri which is resistant to ampicillin, ampicillin/sulbactam, cefazolin, cefotetan, ceftriaxone, ceftazidime, tobramycin, piperacillin tazobactam, ciprofloxacin, levofloxacin, amikacin, compound sulfamethoxazole, cefepime, ertapenem, imipenem, aztreonam and gentamycin has a better in-vitro killing effect according to the citral, the growth of the providencia rettgeri can be inhibited, the minimum bactericidal concentration is 0.5mg/mL, and the minimum bacteriostatic concentration is 0.25 mg/mL; the invention provides the bacteriostatic action of the plant extract citral on the multidrug-resistant providencia rettgeri, can relieve or solve the problem of drug resistance increase of the multidrug-resistant providencia rettgeri, and provides a theoretical basis for clinical antibacterial treatment and novel drug research and development.)

柠檬醛在抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌生长中的应用

技术领域

本发明属于医药和食品安全技术领域，涉及柠檬醛在抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌生长中的应用。

背景技术

雷氏普罗威登斯菌属肠杆菌科,可致泌尿道感染和其他的肠道外感染,并引起许多医院感染的爆发流行，同时也是食物伴侣菌，极易在食品的加工、运输、销售等过程中大量繁殖而导致肠道感染和食物中毒。除此之外，国内外还有该菌引起的旅行者腹泻、眼部感染、菌血症、***等相关报道。近年来，多重耐药雷氏普罗威登斯菌的临床分离率也逐步上升，国外已有多篇文献报道雷氏普罗威登斯菌属可产生IMP-1型金属β-内酰胺酶以及各种β-内酰胺酶。另有国内文献报道，临床分离出的雷氏普罗威登斯菌被证实可产KPC-2型碳青霉烯酶，警示我国需对产碳青霉烯酶的少见细菌进行严密监测，并采取感染控制措施以阻断耐药基因在细菌之间传播。由于碳青霉烯类抗生素是迄今已知抗菌药物中抗菌谱最广、抗菌作用最强的一类抗生素，因此多重耐药雷氏普罗威登斯菌引起的感染给临床治疗工作带来了极大的挑战。

由于许多国家在临床上对抗生素的滥用，导致多重耐药雷氏普罗威登斯菌耐受性和检出率也在不断增加。在面对细菌耐药性增强的问题上，利用传统化学合成的方法开发具有抗菌活性的新药物难度大周期长，而中草药是新药发现的重要来源，其天然产物结构和类别复杂多样，具有抗菌、消炎等多种药理活性，其中天然植物精油因其具有安全、低毒、广谱抗菌，不会产生耐药性等优点，因此有望成为化学合成抗菌剂的优选天然替代品。

柠檬醛(Citral)是一种重要的单帖化合物，存在于柑橘油、柠檬油、柠檬草油、山苍子油等多种芳香植物精油中，具独特的柠檬香味，是香料，食品和制药行业的常用原料。先前的研究表明，柠檬醛具有杀虫，驱避，抗菌，抗氧化等生物活性(刘艳,苏群,陈尚钘,陈金珠,范国荣.柠檬醛的生物活性研究进展[J].江西林业科技,2013(01):43-46.)。该文献(戴锦铭.山苍子精油对大肠杆菌O157:H7抗菌机制研究及在果蔬汁中的应用[D].江苏大学,2019.)阐述了柠檬醛与大肠杆菌O157:H7的DNA发生嵌入结合作用，破坏DNA结构，从而具有对大肠杆菌的显著抗菌效果。除此之外，Mesquita等人报道了柠檬醛对金黄色葡萄球菌具抗菌活性，其MIC为0.5mg/mL，并且具有清除生物被膜的潜力。(Porfírio EmanuelaMesquita,Melo Hider Machado,PereiraMatheus Gomes,Cavalcante TheodoraThays Arruda,Gomes Geovany Amorim,de Carvalho Mário Geraldo,Costa RenataAlbuquerque,Júnior Francisco Eduardo

Catunda.In Vitro Antibacterialand Antibiofilm Activity of Lippia alba Essential Oil,Citral,and Carvoneagainst Staphylococcus aureus.[J].TheScientificWorldJournal,2017,2017.)。同时，蒋立科等人(蒋立科,罗曼.柠檬醛抗黄曲霉作用的分子机理[J].生命科学研究,2005(S1):81-94.)表明柠檬醛对黄曲霉有明显的抗菌效果，不仅能改变黄曲霉细胞膜的形态结构、物理学特性及其生物学功能，而且使细胞膜产生脂质过氧化损伤，进入细胞后，作用于细胞器，使其产生损伤及区域性分布。柠檬醛也具有抗癌，治疗心血管疾病，止咳平喘等作用。另有报道表明(康慎敏,刘志远,孟宇杰,程晓萌,涂俊宏,温啓吾,郭都,石超.柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌环境压力耐受能力及抗生素敏感性的影响[J].食品科学,2019,40(18):152-160.)柠檬醛可降低阪崎克罗诺肠杆菌的多种环境压力耐受并增强菌体对抗生素的敏感性。然而，现有文献尚未报道柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌具有抑菌作用。

发明内容

本发明的目的在于提供提供柠檬醛在抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌生长中的应用，从现存的药用植物资源库入手，挖掘潜在的耐药菌抑制剂，为开发新型抗生素替代物和解决耐药阴沟肠杆菌的多重耐药困境提供实践基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

柠檬醛在抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌生长中的应用。

进一步的，多重耐药雷氏普罗威登斯菌为人源雷氏普罗威登斯菌。

进一步的，雷氏普罗威登斯菌的耐药性是通过微量二倍稀释法确定的。

进一步的，多重耐药雷氏普罗威登斯菌耐受的抗生素选自氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、呋喃妥因、氨曲南、庆大霉素中的多种。

进一步的，多重耐药雷氏普罗威登斯菌选自耐氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素的人源雷氏普罗威登斯菌。

进一步的，柠檬醛对所述人源雷氏普罗威登斯菌的最小抑菌浓度为0.25mg/mL，最低杀菌浓度为0.5mg/mL。

进一步的，柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌具有体外杀灭作用，以及抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌的体外生长。

柠檬醛在制备抗多重耐药雷氏普罗威登斯菌的药物中的应用。

进一步的，多重耐药雷氏普罗威登斯菌为人源雷氏普罗威登斯菌。

进一步的，多重耐药雷氏普罗威登斯菌选自对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素中多种抗生素耐药的雷氏普罗威登斯菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明基于柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的作用的研究，利用柠檬醛抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌的生长，为多重耐药雷氏普罗威登斯菌抑制剂的研究开发和应用提供新的思路，在医药领域具有广泛的应用价值。

本发明进一步明确了柠檬醛对耐抗生素氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、呋喃妥因、氨曲南、庆大霉素的人源雷氏普罗威登斯菌耐药性的抑制作用，有效缓解或解决多重耐药雷氏普罗威登斯菌的耐药感染问题，降低致死率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明的内容，并非对本发明的限定。

柠檬醛，英文名Citral，分子式为C₁₀H₁₆O，相对分子质量为152.23，呈浓郁柠檬香味的无色或微黄色液体。存在于柑橘油、柠檬油、柠檬草油、山苍子油、白柠檬油、马鞭草油等植物精油中。CAS号是5392-40-5，沸点是228-229℃，分子结构是：

1、雷氏普罗威登斯菌的药敏实验

本发明以5株雷氏普罗威登斯菌为出发菌株，选用氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、呋喃妥因、氨曲南、庆大霉素等18种常用抗生素进行药敏实验。

挑取培养16h的纯菌落均匀溶解于3mL无菌生理盐水中，调节其浊度与0.5麦氏比浊管等浊。利用二倍稀释法将抗生素、菌液及TSB液体培养基加入96孔培养板中过夜培养，利用酶标仪测定抗生素对雷氏普罗威登斯菌的最小抑菌浓度。不同浓度的药液组别均作三个平行，确保实验数据的可信度。抑菌结果根据美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定，判定标准见表1。实验结果见表2，结果显示，编号为1^#的雷氏普罗威登斯菌可以耐受的抗生素最多，其能够耐受17种抗生素，对1种抗生素敏感，因此将1^#作为进一步的实验研究对象。

表1.美国临床试验室国家标准化管理委员会(CLSl2017)标准判定结果

表2.抗生素对雷氏普罗威登斯菌最小抑菌浓度结果

由表1和表2可知，柠檬醛对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢曲松、头孢他啶、妥布霉素、哌拉西林他唑巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、氨曲南、庆大霉素的多重耐药雷氏普罗威登斯菌的抑制作用较好。

2、柠檬醛对多重耐药菌株的抑制作用

为充分考虑用药安全，本发明以柠檬醛单一活性成分为研究对象，以雷氏普罗威登斯菌的标准菌株ATCC31052作为参考，进行耐药性抑制作用的研究。挑取培养16h的纯菌落均匀溶解于3mL LB液体培养基中，调节其浊度与0.5麦氏比浊，并用酶标仪测定其OD600值。用二甲基亚砜配制浓度为2mg/mL的柠檬醛作为药液，利用试管二倍稀释法将药液、菌液及LB液体培养基加入96孔培养板中过夜培养，以不同浓度的药液组别作三个平行实验，确保实验数据的可信度。

利用酶标仪测定柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的最小抑菌浓度。并将最小抑菌浓度下的培养液置于无菌的LB液体培养基中继续培养，利用酶标仪测定柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的最低杀菌浓度，实验结果见表3。

表3.柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的抑制结果

由表3可知，柠檬醛对多重耐药雷氏普罗威登斯菌的MIC为0.25mg/mL，MBC为0.5mg/mL。

根据以上实验结果，结合中草药解决耐药病原菌的耐药性特点，可通过获得活性单品成分柠檬醛，直接针对临床主要的多重耐药雷氏普罗威登斯菌发挥抑制作用，可有效缓解或解决多重耐药雷氏普罗威登斯菌的耐药感染问题，为抑制多重耐药雷氏普罗威登斯菌提出新的思路，具有重要的指导意义。