阅读说明：本技术 荜茇酰胺促进自噬及治疗口腔鳞状细胞癌的用途 (Application of piperlongumine in promoting autophagy and treating oral squamous cell carcinoma ) 是由 许小鸿 陈树伟 黄帅 郅程 苏涛 于 2020-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明意外发现荜茇酰胺具有上调自噬启动基因Beclin-1和LC3表达的作用,并且发挥促进自噬,抑制口腔鳞状细胞癌增殖和迁移的作用,具有治疗口腔鳞状细胞癌的效果。(The invention unexpectedly discovers that the piperlongumine has the effect of up-regulating the expression of autophagy initiating genes Beclin-1 and LC3, plays the roles of promoting autophagy and inhibiting the proliferation and migration of oral squamous cell carcinoma, and has the effect of treating the oral squamous cell carcinoma.)

荜茇酰胺促进自噬及治疗口腔鳞状细胞癌的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，更具体地涉及荜茇酰胺促进自噬及治疗口腔鳞状细胞癌的用途。

背景技术

口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)是一种常见的头颈部恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的3％，口腔恶性肿瘤的90％，具有浸润性生长、局部转移、高复发率及预后差等特点，恶性肿瘤排名第6。OSCC作为危害人类健康和生命常见的恶性肿瘤之一，严重影响患者的生存质量和精神状态。随着治疗OSCC的不断发展，手术切除联合放疗、新辅助化疗、靶向生物治疗等在诊断和临床治疗方面取得了巨大进展，总体OSCC患者生存率略有提高，3年生存率到达50％-75％，5年生存率约为50％，但是仍有60％以上的患者病情不能得到有效的控制，术后生存率低于50％。因此，为提高OSCC患者的预后和生存率，寻求早期诊断和靶向抑制其发生进展及转移是防止和治疗OSCC的关键。

荜茇酰胺(Piperlongumine，CAS#:20069-09-4)属生物碱类化合物，是胡椒科植物的生物活性成分，具有抗血小板凝集、抗焦虑、抗抑郁等多种药理学作用。已有研究发现，荜茇酰胺对***癌、结肠癌、肺腺癌、肝癌和黑色素瘤等恶性肿瘤具有显著的抑制作用，关于荜茇酰胺通过调控口腔鳞癌自噬从而抑制口腔鳞癌迄今未见有关报道。

自噬是一种在生物进化过程中高度保守且于真核细胞中广泛存在的生命现象，它是真核生物和哺乳动物体内一种非常重要的生理过程和不可或缺的代谢方式，自噬参与机体的多种生理病理过程，它对细胞的整个生命周期包括细胞生长、增殖、衰老及凋亡都有着重要的影响。自噬的主要特征是大量的自噬体和溶酶体出现在细胞质内，二者融合形成的自噬溶酶体对胞质内多余的或受损的长寿命蛋白及细胞器等大分子物质进行降解并释放出糖类、脂肪酸、氨基酸等小分子物质供机体重新吸收利用，来完成细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新；自噬同样具有能动性，当外界环境变化如在饥饿、应激、损伤等情况下其会通过多种调节机制进行自我抑制或自我促进来维持细胞的内稳态。研究表明，自噬活性的改变与肿瘤的发生发展有关，一方面，自噬通过清除反应性活性氧簇、受损的细胞器及蛋白质，维持细胞内环境稳定，从而抑制肿瘤的发生，发挥对肿瘤的抑癌作用，自噬活性的缺失可以导致肿瘤细胞内环境紊乱、DNA突变，促进癌细胞恶性进展。其中，Beclin-1和LC3是自噬启动基因，上调自噬启动基因将有助于治疗自噬异常相关疾病。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于：1.提供荜茇酰胺在制备自噬促进剂的新用途；2.提供荜茇酰胺治疗口腔鳞状细胞癌的新用途；3.Beclin-1作为口腔鳞状细胞癌诊断标志物的用途；4.LC3作为口腔鳞状细胞癌诊断标志物的用途。

本发明的技术方案包括以下任意一项：

本发明提供荜茇酰胺在制备自噬促进剂中的用途。

进一步的，荜茇酰胺通过上调Beclin-1和/或LC3发挥自噬促进剂的作用。

进一步的，LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。

本发明提供荜茇酰胺在制备口腔鳞状细胞癌药物中的用途。

进一步的，荜茇酰胺抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移。

进一步的，荜茇酰胺促进口腔鳞状细胞癌细胞自噬。

进一步的，荜茇酰胺上调Beclin-1和/或LC3。

本发明提供Beclin-1作为口腔鳞状细胞癌诊断标志物的用途。

本发明提供LC3作为口腔鳞状细胞癌诊断标志物的用途。

进一步的，LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。

本发明取得的技术效果：

本发明意外发现荜茇酰胺具有上调自噬启动基因Beclin-1和LC3表达的作用，并且发挥促进自噬，抑制口腔鳞状细胞癌增殖和迁移的作用，具有治疗口腔鳞状细胞癌的效果。

附图说明

图1：免疫组化检测口腔鳞状细胞癌组织中Beclin-1和LC3蛋白表达情况，其中，图A为Beclin1在癌旁非肿瘤组织呈强阳性表达，图B和C为Beclin1在舌鳞癌组织表达强度减弱；图D为LC3在癌旁非肿瘤性组织中呈阳性表达，图E和F为LC3在舌鳞癌组织中表达下调；

图2：Western检测PPLGM处理口腔鳞状细胞癌细胞对Beclin-1和LC3蛋白表达的影响；

图3：PPLGM处理口腔鳞状细胞癌细胞对自噬的影响；

图4：划痕实验检测PPLGM处理口腔鳞状细胞癌细胞对迁移的影响；

图5：MTT法检测不同浓度PPLGM处理口腔鳞状细胞癌不同时长的细胞增殖情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

下述实验例中所使用的实验方法或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

例1.口腔鳞状细胞癌中自噬启动基因Beclin-1和LC3的表达

1.1 Beclin-1和LC3蛋白检测

先组织切片65℃热处理1h后，置二甲苯脱蜡2次每次5min；将切片依次用100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇和纯水水化，每次1min；取出后滴加3％过氧化氢室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶；将切片置于盛有EDTA pH9.0修复液的容器中，高压锅高压修复10min；取出切片后用免疫组化笔包围组织并用PBS缓冲液漂洗3min，甩干后滴加山羊血清封闭液(试剂A)室温孵育20min；去除试剂A滴加用抗体稀释液稀释好的一抗工作液4℃孵育过夜；去除一抗后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴入生物素标记的二抗工作液(试剂B)，室温孵育20min；弃去试剂B后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液(试剂C)，室温孵育10min；弃去试剂C后用PBST缓冲液漂洗3次每次5min，甩干后滴加DAB显色液，室温孵育1min～5min；将切片浸入自来水中终止显色，苏木素染液复染1min，自来水清洗后用盐酸酒精分化5s；将切片用75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇梯度脱水，每次3min，再置37℃干燥箱处理30min，环保树脂封片剂封片。

以上待检组织来源于广医二院病理科留档口腔鳞状细胞癌及癌旁非肿瘤组织的石蜡标本

1.2检测结果

如图1所示，Beclin1在癌旁非肿瘤组织呈强阳性表达(图1A)，在舌鳞癌组织表达强度减弱(图1B和1C)；LC3在癌旁非肿瘤性组织中呈阳性表达(图1D)，但在舌鳞癌组织中表达下调(图1D和1E)。可见，口腔鳞癌组织自噬启动基因Beclin-1和LC3表达水平显著低于癌旁非肿瘤组织。因此，检测Beclin-1和LC3的试剂可以独立的作为口腔鳞癌诊断试剂。

例2.荜茇酰胺促进口腔鳞状细胞癌中Beclin-1和LC3蛋白的表达

2.1荜茇酰胺处理

分别用3μM和6μM的荜茇酰胺(简称PPLGM)处理口腔鳞状细胞癌细胞Cal27和UM1，作为荜茇酰胺处理组，以DMSO为正常对照组。

2.2 Beclin-1和LC3蛋白检测

取约100mg的待测细胞，在液氮中用研钵碾碎，加入RIPA裂解液冰上裂解30min，收集裂解液，4℃，12,000g离心15min，收集上清，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，向上清液加入体积量1/4的5×上样缓冲液，沸水浴10min后，冰浴5min。使用SDS PAGE蛋白电泳系统，上样量为30μg总蛋白，电泳参数为10％分离胶、5％浓缩胶，100V电泳90min至溴盼蓝指示剂迁移至底部后，进行电转移，使用0.45μm的PVDF膜，300mAl冰浴电转90min。电转结束后，膜使用5％脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3遍5min，加入一抗(1:1000)，4℃孵育过夜，TBST漂洗3遍5min，加入封闭液稀释的二抗，室温孵育1h，TBST漂洗3遍5min，加入ECL发光液，置于压片夹中X光底片感光1min至20min，经显影定影处理：免疫印迹检测以GAPDH为对照。

2.3检测结果

如图2所示，相对正常对照组，荜茇酰胺处理组Beclin-1、两种LC3、表达水平均显著增加。可见，荜茇酰胺促进口腔鳞状细胞癌中Beclin-1和LC3蛋白的表达，因此荜茇酰胺可以作为自噬促进剂。

例3.荜茇酰胺促进口腔鳞状细胞癌自噬

3.1荜茇酰胺处理

用10μM的荜茇酰胺(简称PPLGM)处理口腔鳞状细胞癌细胞Cal27，作为荜茇酰胺处理组，以DMSO为正常对照组。

3.2自噬检测

胰酶消化细胞，离心，先将细胞块固定在2.5％戊二醛和0.1％四氧化锇的PBS溶液中保存在4℃中过夜；用乙醇梯度脱水，用环氧树脂浸透并切成薄片。固定切片后进行染色，通过电镜观察细胞自噬小体形成情况。

3.3划痕实验

细胞接种到六孔板中，孔中加入约5×10⁵个细胞，37℃5％CO₂培养至融合度100％，用枪头或无菌牙签在每孔中间划一道痕，划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，更换新鲜培养基继续培养，在0，24，48h取出细胞，显微镜线观察并拍照。

3.4实验结果

如图3和图4所示，与正常对照组相比，荜茇酰胺处理组出现自噬小体，细胞迁移下降。因此荜茇酰胺可以作为自噬促进剂，并且能够抑制口腔鳞状细胞癌迁移。

例4.荜茇酰胺抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖

4.1 MTT检测细胞增殖

将口腔鳞状细胞癌细胞Cal27和UM1用0.25％胰蛋白酶消化后，以细胞浓度3×10⁴个/mL均匀接种于96孔培养板，每孔100μL，细胞贴壁后分别加入6、12、24μM的荜茇酰胺(简称PPLGM)，并设立DMSO对照组，每组设6个复孔，分别于24h、48h、72h，通过加入MTT试剂10μL，37℃恒温箱孵育4h，每孔加入150ul二甲基亚砜，用多功能酶标仪检测各孔的吸光值A(490nm)，以观察随着时间的变化，荜茇酰胺对细胞增殖的影响。

4.2检测结果

如图5所示，PPLGM能够显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。因此，荜茇酰胺可作为口腔鳞状细胞癌药物。