阅读说明：本技术 一种适合酸性土壤的硅酸盐细菌筛选方法及在马铃薯种植中的应用 (Silicate bacteria screening method suitable for acid soil and application of silicate bacteria in potato planting ) 是由 毛露甜 廖淑恩 林桂格 周星宇 陆镇樟 罗胜祥 于 2020-04-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种适合酸性土壤的含硅酸盐细菌筛选方法,其步骤包括：从自然环境中分离出硅酸盐细菌；分离出解钾能力最强的单个菌株；对硅酸盐细菌进行耐酸性培养筛选,筛选出在pH值5.0-5.5培养基中繁殖能力最强的硅酸盐细菌落；重复上述第二步和第三步步骤,直到筛选出解钾能力性状稳定的单个菌株为止。运用本发明筛选的硅酸盐细菌,可以保证所筛选的硅酸盐细菌,在pH值为5.0-5.5土壤中繁殖良好。本发明公开了运用上述方法筛选的硅酸盐细菌在马铃薯种植中的应用。(The invention discloses a method for screening silicate-containing bacteria suitable for acid soil, which comprises the following steps: separating silicate bacteria from the natural environment; separating out a single strain with the strongest potassium-resolving capability; performing acid-resistant culture screening on silicate bacteria, and screening out a silicate fine colony with the strongest reproductive capacity in a culture medium with a pH value of 5.0-5.5; repeating the second step and the third step until a single strain with stable potassium-solubilizing ability is screened out. The silicate bacteria screened by the method can ensure that the screened silicate bacteria can be well propagated in the soil with the pH value of 5.0-5.5. The invention discloses application of silicate bacteria screened by the method in potato planting.)

一种适合酸性土壤的硅酸盐细菌筛选方法及在马铃薯种植中 的应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料技术领域，尤其涉及一种适合酸性土壤的硅酸盐细菌筛选方法及在 马铃薯种植中的应用。

背景技术

马铃薯是一种粮菜兼用作物，它适应范围广、经济效益高且营养丰富。目前，国内许多 地区都把发展马铃薯产业列入增加农民收入的重要内容之中。马铃薯的种植，高产喜肥，对肥 料的需求较大，产量与土壤营养条件密切相关，特别是钾，在整个生长发育进程中需求量都比 较大。然而，国内马铃薯的平均单位面积产量还低于世界平均水平，这可以通过施用微生物肥 料得以改善，其单位面积产量还将有较大提升空间。

微生物肥料是以特定微生物的生命活动导致作物得到特定肥料效应的一种制品，可分为固 氮菌肥肥料、磷细菌肥料、硅酸盐细菌肥料和复合微生物肥料等。使用微生物肥料，不仅可以 降低生产成本及提高肥料利用率，其中所含的功能微生物还可以抑制或防治土壤传播病害，促 进难溶性矿质营养释放，促进作物生长，提高作物品质及调节生态系统平衡等功效。近几年我 国的微生物肥料行业迅速发展，现登记的微生物肥料产品数量已达1000个以上，使用面积在 一亿亩以上，且这一数字还呈加速上升趋势。

微生物肥料应用于农业生产中，有着一般化学肥料不能媲美的优势：(1)不污染环境， 对人、畜等动物无毒无害；(2)修复土壤；(3)提高农作物产量和品质；(4)成本低廉；(5)肥效持久。

目前，能有效分解硅酸盐矿物的是硅酸盐细菌，也叫硅酸盐解钾菌或钾细菌，主要包括胶 质芽孢杆菌Bacillus siliceous、环状芽胞杆菌Bacillus circulans、扭脱芽胞杆菌Bacillus extorquens 等。硅酸盐细菌是土壤中的一种特殊功能菌，能有效分解土壤中的硅酸盐矿物，将土壤中难溶 性钾转化成可被植物直接吸收利用的速效钾，从而补充土壤中钾素，同时还能缓解由于过量使 用化肥对土壤和环境造成的危害。

近年来在农业技术应用过程中出现了许多生态问题，对农业可持续发展构成了严重威胁， 如农药、化肥的过量使用，重金属、难降解有机物对土壤生态环境的污染和破坏，从而导致土 壤中的微生物种类和数量双线下降、土壤结构被彻底破坏、农作物产量和品质下降和病虫害增 加等恶劣问题，继而增加化肥和农药的使用量，导致进一步加剧对土壤生态系统的破坏，形成 恶性循环。土壤的污染会导致某些有害成分在粮食等作物中积累，影响粮食的品质，并通过食 物链危害人类健康。为了从根本上修复土壤生态系统，使用微生物肥料是关键措施，而硅酸盐 细菌又是微生物肥料的重要组成部分，因此对硅酸盐细菌的研究势在必行，这对于绿色种植、 土壤修改、环境保护和生态农业都具有十分重要的意义。

据资料显示，目前我国的钾肥产量占全世界的0.34％，而消耗量却达全世界的14.7％，可 见我国钾肥资源非常短缺，主要依赖进口，且供需日趋紧张，特别是华南地区。利用科学合理 地施用钾肥，补充土壤中的钾素，缓解钾肥供需矛盾，保护农业生态环境，维持农业高产、稳 产等生物学途径刻不容缓。

目前硅酸盐细菌肥料所使用的硅酸盐细菌筛选方法为，在pH范围在7.0左右培养基中， 筛选中解钾能力强的硅酸盐细菌单个菌株，再繁殖扩增。

但是，大部分农作物种植地的土壤pH值并不是标准的7.0,有些农作物在微酸性土壤中 生长得更好，pH范围在7.0左右培养基筛选出的解钾能力强的硅酸盐细菌，可能因在酸性土 壤中繁殖能力差而导致硅酸盐细菌肥料效果不佳。

例如，马铃薯适宜在微酸性土壤中生长。据研究当土壤pH值在4.8-7.0时，马铃薯生长 发育比较正常。当土壤pH值在5.0-5.5时最适宜马铃薯的生长发育。然而，硅酸盐细菌虽然在 pH 5.0～9.0可以生长，但其最适pH范围在7.0左右(何琳燕等，不同土壤中硅酸盐细菌生 理生化特征及其解钾活性的研究，土壤，2004,36(4):434～437)。由于在最适宜马铃薯生产的 微酸性土壤中，硅酸盐细菌繁殖能力不佳，导致现有硅酸盐细菌菌肥应用在马铃薯种植中时， 解钾效果不佳。

此外，土壤的温度、盐度和重金属离子浓度也会硅酸盐细菌的繁殖能力差或解钾能力， 同时，植物生产的重要元素还包括磷和氮，在钾、磷、氮营养失衡的情况下，单纯解钾能力高 的硅酸盐细菌，未必能带来作物高产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合酸性土壤的硅酸盐细菌筛选方法及该方法在马铃薯种植 中的应用，具体方案为：

一种适合酸性土壤的含硅酸盐细菌筛选方法，其步骤包括：

第一步、分离：从自然环境出分离出硅酸盐细菌；

第二步、纯化：分离出解钾能力最强的单个菌株；

第三步、耐酸性筛选：对硅酸盐细菌进行耐酸性培养筛选，筛选出在pH值5.0-5.5培养基 中繁殖能力最强的硅酸盐细菌落；

第四步、重复上述第二步和第三步步骤，直到筛选出解钾能力性状稳定的单个菌株为止。

可选的，第二、第三、第四步任一步之前，还包括细菌种类选择，所选的硅酸盐细菌种类 为胶质芽孢杆菌。

可选的，第四步之前，还包括硅酸盐细菌产胞外多糖能力筛选，筛选出产胞外多糖能力最 强的硅酸盐细菌菌落。

可选的，第四步之前，还包括硅酸盐细菌耐温能力筛选，筛选出15～20℃的繁殖能力最 强硅酸盐细菌菌落。

可选的，第四步之前，还包括硅酸盐细菌耐温度能力筛选，筛选出15～20℃的繁殖能力 最强的硅酸盐细菌菌落。

可选的，第四步之前，还包括耐盐度能力筛选，筛选出0.2～0.3％的盐度下繁殖能力最强 的硅酸盐细菌菌落。

可选的，第四步之前，还包括耐重金属离子能力筛选，筛选出在一定浓度重金属离子环境 下繁殖能力最强的硅酸盐细菌菌落。

所述的重金属离子为Pb²⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺、Cu²⁺中的一种或几种；

所述重金属离子浓度为5、10、15、20、30、40、50、80和100mg/L中的一种(以纯Pb²⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺和Cu²⁺合计)。

本发明还包括上述方法筛选得到的硅酸盐细菌在马铃薯种植中的应用，具体为用上述方法 筛选的硅酸盐细菌用制备马铃薯专用菌肥。

进一步，所述的马铃薯专用菌肥载体为菌糠。

进一步，所述的马铃薯专用菌肥包括粉状钾长石或粉状伊利石中的任一种或二种的混合。

综上所述，运用本发明筛选的硅酸盐细菌，可以保证所筛选的硅酸盐细菌，在pH值为5.0～ 5.5土壤中繁殖良好；进一步，选用胶质芽孢杆菌，可以保证硅酸盐细菌有强的解钾能力同时 兼有解磷和固氮功能，让作物营养更均衡；进一步，通过硅酸盐细菌产胞外多糖能力筛选，选 出产胞外多糖能力最强的硅酸盐细菌，有利于其在根际土定植；进一步，可选的让硅酸盐细菌 进行耐温(15～20℃)、耐盐(0.2～0.3％)和耐重金属离子浓度筛选步骤，可以适应不同温 度、盐度、重金属离子浓度种植环境下，筛选出的高解钾能力硅酸盐细菌具有更强的环境适应 力。运用本发明筛选的硅酸盐细菌，特别适用于马铃薯种植(最适土壤pH值在5.0-5.5时、最 适生长温度15-20℃)，在马铃薯专用菌肥添加粉状钾长石和粉状伊长石，可在肥料阶段就形 成胞外多糖粘结的细菌——矿物复合体，增强硅酸盐细菌的早期的解钾能力。

附图说明

图1为本发明硅酸盐细菌在硅酸盐细菌培养基上的菌落形状特征图；

图2为本发明实施例2硅酸盐细菌芽孢染色效果图；

图3为本发明实施例2PCR产物电泳图；

图4为本发明实施例2系统发育树；

图5为本发明实施例2遗传距离矩阵图；

图6为本发明实施例4绘制的葡萄糖标准曲线；

图7为本发明实施例5一种硅酸盐细菌不同浓度重金属环境下的生长曲线；

图8为本发明实施例7速效钾施肥后各组的速效钾含量变化曲线图；

图9为本发明实施例7硅酸盐细菌30d马铃薯植株的促生效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 但不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：硅酸盐细菌的分离、纯化：

硅酸盐细菌广泛存在于各种土壤中，于作物种植地采集土壤，将采集到的土壤充分混匀， 取5g土壤于无菌试管中，加入45mL的无菌水，震荡15min后静置5min，从上层液体中取1ml 的混合液到含有9ml无菌水的试管中，制成10^-1的土壤悬液，然后依次稀释成10^-2，10^-3，10^-4， 10^-5，将10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，5个稀释度的土壤稀释液涂布于硅酸盐细菌培养基上， 倒置于30℃的培养箱内，培养2d，选择水滴状，透明凸起、粘着、有拉丝的菌落进行鉴定， 分粘着而有弹性的菌落进行划线分离纯化。重复3～4次，镜检纯度，直到获得纯的单菌落， 斜面4℃保存备用。

图1为采用上述分离和纯化方式得到的一株菌(命名为K2)的菌落形状特征图；

所述硅酸盐细菌培养基成分为：

实施例2：硅酸盐细菌的鉴定

1、硅酸盐细菌生理生化鉴定

将纯化后的菌株K1、K2、K3、K4进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色，结果见表1和图 2。其中菌株K2为革兰氏阳性菌，有椭圆芽孢，具厚的大荚膜。其他3株菌为革兰氏阴性菌，虽 都具荚膜，但无芽孢。鉴于芽孢菌抗逆性强，是筛选微生物肥料功能菌的一个重要考量指标， 所以下面重点研究菌株K2。

表1.4株硅酸盐细菌的革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色

注：+为阳性，-为阴性

K2菌株的API生理生化鉴定

参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》和《常见细菌系统鉴定手册》，对K2菌株的糖醇利 用等30项生理生化指标进行测定。该菌能发酵利用葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等糖类，并能 利用甘油、甘露醇、肌醇等醇类，但不能利用甘露糖、鼠李糖、乳糖、***糖和赤藓糖醇等 糖醇物质；具有明胶酶活性，但不具有β-半乳糖苷酶、脲酶、色氨酸脱氨酶等酶活性；不产 H2S，不产吲哚物质，不能利用柠檬酸，但能产3-羟基丁酮。K2菌株的API50CH糖醇发酵试验和 API20E部分生理学特性结果见表2。

表2菌株K2的API鉴定部分生理生化特性

注：+为阳性，-为阴性

2、16S rDNA序列分析法鉴定硅酸盐细菌K2

⑴用改良CTAB法提取菌体DNA。

⑵菌株16S rDNA的扩增

采用通用扩增引物：F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，R:5’-AAG GAG GTGATC CAG CCG CA-3’，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

反应体系：0.25μL Taq DNA聚合酶,5μL 10×PCR反应缓冲液，1μL dNTPs(10mM)，1μL上游引物，1μL下游引物，2μL模板DNA,ddH2O补足50μL。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃终延伸10min。

⑶PCR产物检测

取扩增产物5μL与1μL LoadingBuffer混合，点样，5V/cm 1％琼脂糖凝胶电泳30min， 在凝胶成像分析仪下观察，若出现1500kb左右的单一条带，说明已成功扩增目标16S rDNA 序列。

⑷扩增产物测序

将PCR扩增产物送交华大基因广州测序部进行测序。

⑸序列分析

将测得到的16S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。从NCBI的 GenBank中找一到两个同科的，再找一到两个同目的，再找一到两个同纲的细菌的序列，把序 列全部下载下来，以FSATA形式整合在TXT文档中，应用ClustalⅩ1.8和MAGA 5.1软件构建 系统进化树并分析。

硅酸盐细菌菌株K2的16S rDNA的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测到大小约1.5kb的 条带(如图3)

对硅酸盐细菌菌株K2的16S rDNA扩增产物的进行测序，测得的条带长度为1225kb，序 列为：

AGGGGCCCGCCTATACATGCCAGTCGAGCGGAGCACTTCGGTGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAAGACCGGATAGCTGGTTTCGGTG CATGCCGGAATCATGAAACACGGGGCAACCTGTGGCTTACGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGCGG GGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGCAAGCCTGACGGAGCAACGCC GCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAATGTCGTGGAGAGTAACTGCTCT GCGAATGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCA AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGGTGTTTAAGCCCGGGGCT CAACCCCGGTTCGCACCGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGCGCG AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGG GGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTAAACACAATAAGCACTCGGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAA CTCAATGGATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAAGCAACGCGAAGACCTTA CCAGGTCTTGACATCCTTCTGAAGCCCTAGAGATAGGCCCTCCTTCGGGACGAGGTGACAGTGGTGCATGCTG TCGTCACTCTGTCCGTGAAATGTAGGTTAAGTCCCGCACCAGCGCACCCTTGACTTTAGTGCAGCTGAATGGGA CTCTAATGACTGCCGGGCAACGGAGGAGGGGGATGACGTAAATCACTTGCCTTAGACCTGCTAACACGTATCCA TGCGTAACGGAGCATCCGGATGAAGTACTGATCGTCAGTCGATACGAGCTCAATCCTGTGCAGTAGA

所测定序列递交GenBank数据库，使用Blast程序进行同源性比较，结果显示，该菌株K1PCR 扩增的序列与Paenibacillus mucilaginosus(GenBank编号为JF810844.1)的基因序列相似性达 96％，所以该菌株很有可能为Paenibacillus mucilaginosus。该序列与GenBank中下载的硅酸盐 细菌不同属之间的序列，使用Clustal X软件进行比对，利用MEGA软件建立系统发育树(图4) 和遗传距离矩阵图(图5)。

如图4所示，K2菌株与P.mucilaginosus(Paenibacillus mucilaginosus)的置信度为99，说 明K2菌株与Paenibacillus mucilaginosus同源关系可信，可能为同一个种。

如图5所示，K2菌株与其他15个不同种属的序列相比，K2菌与P.mucilaginosus的遗传距 离是0.000000为最小，说明K2菌与P.mucilaginosus是同一个种。

经菌落形态、个体形态、生理生化试验和16S rDNA序列分析，鉴定K2菌株为Paenibacillus mucilaginosus(胶质类芽孢杆菌)。

实施例3：硅酸盐细菌解钾能力测试

将分离到的硅酸盐菌株K2加入到液体发酵培养基中(菌液：培养基为5:250)，配解钾培 养基按95ml分装并加入0.5g准确称取的钾矿粉于250ml三角瓶中，121℃灭菌20分钟，加入 5ml接种液到解钾培养基中，设无接种的空白对照，摇床培养箱调转速为150r/min，分别在 20℃，15℃不同温度下各培养7d，培养液经2000r/min离心5min，保留上清液，利用火焰分 光光度计测速效钾含量。

所述硅酸盐细菌发酵培养基：

通过挑取四个菌株的解钾综合能力进行的测定，通过表2可以看出硅酸盐细菌的解钾能力 随着温度的变化而变化，各个菌株在不同温度下，其解钾能力并不相同，菌株K2在15℃和 20℃解钾能力最强，最适合应用于在15℃—20℃环境生长的作物。

表3各硅酸盐菌株在发酵培养基中不同温度下的解钾能力

实施例4：硅酸盐细菌产胞外多糖能力测定

1、胞外多糖测定

(1)葡萄糖标准曲线的制备(苯酚-硫酸法)：

a)精确称量在干燥箱60℃干燥24小时的分析纯无水葡萄糖20mg，加少量蒸馏水溶解后， 定量转移至500ml容量瓶中，定容至刻度，终浓度为40mg/L。

b)分别吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml葡萄糖标准液到5支试管中，各用蒸馏水补足到2.0ml， 以不含葡萄糖的2.0ml蒸馏水作空白。

c)向各试管中加入6％苯酚1.0ml，浓硫酸5ml，静置l0min后，摇匀，30度水浴20min。 在490mn处用可见分光光度计测吸光度。

d)以横坐标为葡萄糖糖浓度，纵坐标为吸光值绘制标准曲线(图6)

(2)挑取一环活化的菌落接种到装有待测指标的发酵液中，于25℃的摇床内培养3d， 利用分光光度计测定其吸光值，对应上述吸光值绘制标准曲线，换算出胞外多糖含量值。

根据公开文献，硅酸盐细菌产胞外多糖能力与硅酸盐细菌解钾能力正相关，即硅酸盐细菌 产胞外多糖能力越强，则解钾能力越强。其机理包括：硅酸盐细菌产生的胞外多糖物质使矿物 颗粒与细胞物质纠结在一起，进而形成细菌—矿物复合体，复合体的形成促使细菌细胞与矿物 颗粒进一步接触，甚至可在小分子如培养基中水分子的帮助下，使矿物晶格层间域增大，从而 有助于钾离子的释放。细菌—矿物复合体对有机酸及一些无机离子具有明显的吸附作用，矿粉 颗粒与被吸附的有机分子发生作用并产生化学解钾作用乖。(连宾等，硅酸盐细菌解钾作用机 理的综合效应，矿物学报，2002年6月第22卷第2期)。

目前，对硅酸盐细菌胞外多糖能力的研究集中于不同碳源对同一个菌种胞外多糖产量的影 响，并没有用于硅酸盐细菌的筛选。

实施例5：硅酸盐细菌的条件筛选

对鉴定为硅酸盐细菌、生长良好的不同菌落进行编号，在不同条件下的培养基中培养，选 择出繁殖能力最强的硅酸盐细菌。

1、耐温能力筛选：硅酸盐细菌培养基分别设置为出15℃和20℃度下恒温培养，用HCl 和NaOH调节pH值为5.3，加入不同编号的菌落，选择生产最快的菌落(取温度15℃和20℃ 下生长速度的平均值进行比较)；

2、耐盐度能力筛选：将NaCl加入到硅酸盐培养基中配成质量比分别为0.2％和0.3％二个 浓度，灭菌后倒平板。加入不同编号的菌落，恒温培养(优选的温度为15℃至20℃)，选择 生长最快的菌落(取盐度0.2％和0.3％下生长速度的平均值进行比较)；

3、耐重金属离子能力筛选：将硅酸盐细菌培养基中分别加入Pb²⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺、Cu²⁺中的一种或几种，所述重金属离子浓度为5、10、15、20、30、40、50、80和100mg/L中的 一种，筛选出在特定种类和浓度重金属离子环境下生产最快的菌落。

4、耐重金属离子能力筛选：

(1)配制LB液体培养基，分别添加PbCl₂，CdCl₂，K₂Cr₂O₇，HgI₂，CuSO4，使Pb²⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺、Cu²⁺各个离子浓度梯度为5、10、15、20、30、40、50、80和100mg/L(以纯Pb²⁺、 Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺和Cu²⁺计)，另以不含任何重金属离子的LB液体培养基作对照，将预培养的 菌液按10％的接种量分别接种于上述培养基中，置于摇床(180r/min)上恒温(25℃)摇瓶 培养1d。

(2)用紫外分光光度计，于600nm波长测其光密度，绘制不同编号硅酸盐细菌在不同 浓度重金属环境下的生长曲线，筛选出在特定种类和浓度重金属离子环境下生产最快的菌落。

图7为本发明某种硅酸盐细菌(自编号K2)不同浓度重金属环境下的生长曲线。

图7中，5条OD₆₀₀值线的平均高度比较：Hg²⁺<Cd²⁺<Cu²⁺<Cr²⁺<Pb²⁺，且所有OD₆₀₀值 线随着重金属离子浓度的增加而下降。当重金属离子浓度大于50mg/L时，Hg²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺的OD₆₀₀值3条线加速下降。

经实验发现，5种重金属对硅酸盐细菌K1的毒性顺序为Hg²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺>Cr²⁺>Pb²⁺。同一种重金属离子随着浓度的增加，对硅酸盐细菌的抑制作用增加。当重金属离子浓度大于 50mg/L时，Hg²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺3种金属离子对菌株产生强烈的抑制作用。说明，在一定范围内， 硅酸盐细菌K2对重金属离子的抗逆性良好，能在重金属污染的土壤中发挥其解钾、促生等作 用。

实施例5：胶质芽孢菌剂固氮、解磷、解钾能力试验

将实施例1-5分离、纯化和筛选方法得到的胶质芽孢杆菌K2菌株，与地衣芽孢杆菌、枯 草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解磷芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌分别在无氮培养 基、无机磷培养基、有机磷培养基、硅酸盐细菌发酵培养基培养，胶质芽孢杆菌均能在4种选 择性培养基上生长，表明具有一定的固氮、解磷和解钾能力，与现有文献记载一致，提示用本 发明记载的分离、纯化和筛选方法得到的胶质芽孢杆菌，也同时具备硅酸盐细菌共有的固氮、 解磷和解钾能力。

表4固氮、解磷、解钾试验结果

注：“+”代表在平板上菌落生长良好、“-”表示无菌落生长

实施例7：硅酸盐细菌在马铃薯种植中的应用

马铃薯专用菌肥的制备：

(1)液体型菌肥

解钾菌组：硅酸盐细菌K2接种于LB液体培养基中，25℃摇床培养1d，将其OD₆₀₀值调至0.5(稀释10倍)左右，制成解钾菌菌液。

混合菌组：将解磷菌、硅酸盐细菌K2、固氮菌3种菌同时接种于LB液体培养基中同上条 件摇床培养，调整OD₆₀₀值至0.5，制成混合菌菌液。

空白对照组：LB液体培养基无需接种，同上摇床培养作空白对照。

(2)以菌糠为载体的颗粒型菌肥

解钾菌组：将经过培养的解钾菌菌液与经紫外线灭菌的菌糠混匀，比例为1L菌液：2.5kg 菌糠，置于遮光、潮湿环境下发酵培养5d，制成解钾菌菌糠。

混合菌组：将经过培养的混合菌菌液与经紫外线灭菌的菌糠混匀，比例为1L菌液：2.5kg 菌糠，置于同上条件，制成解钾菌菌糠。

空白对照组：将经过培养的LB培养基与经紫外线灭菌的菌糠混匀，比例为1L培养基：2.5kg 菌糠，置于同上条件，制成空白对照组。

马铃薯盆栽试验

试验分组情况。1.液体型解钾菌试验：直接将菌液施于种植袋土壤中，设3个处理组(解 钾菌组、混合菌组和空白对照组)，每组5个重复；2.颗粒型解钾菌试验：将菌糠与种植袋中 的土壤混匀，分组情况同上，每组设5个重复，两组均于2014年月12月2日播种，2015年1 月1日施菌肥。施肥，拔草、松土、浇水、喷药等常规管理一致，定期采马铃薯根际土和叶片 测各项数据和相关指标，比较组间的差异。

表5马铃薯盆栽试验设计

组别	添加物质
		液体型解钾菌组	加入50mL解钾菌菌液
液体型混合菌组	加入50mL混合菌菌液
		液体型空白对照组	加入50mL LB培养基
颗粒型解钾菌组	加入250g解钾菌菌糠
		颗粒型混合菌组	加入250g混合菌菌糠
颗粒型空白对照组	加入250gLB培养基菌糠

1、马铃薯根际土硅酸盐细菌活菌数量测定

土壤悬液制备：盆栽试验两批解钾菌组每袋各取10g土样放入盛有90mL无菌水(带玻 璃珠)的锥形瓶中，振荡约20min，静置1min，制成10^-1稀释液。用移液枪取1mL10^-1稀释液至有9mL无菌水的试管中，吹打3次，制成10^-2稀释液；用10倍稀释法依次制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等5个不同的稀释度。

接种：取10^-3、10^-4、10^-5稀释度的菌液0.1mL分别加在硅酸盐细菌分离培养基平板上， 涂布均匀。

培养：25℃倒置培养4-5d。

计数：以菌落数在30～300的平板进行计数。

结果：

施液体型菌肥的根际土的硅酸盐细菌数量比施颗粒型菌肥的增长迅速，在20d时数量达到 最高点，但活菌数下降较快，提示定植效果没有颗粒型菌肥好。施颗粒型菌肥的根际土的硅酸 盐细菌数量增长较慢，在30d达到最高点，且比液体菌肥的活菌数高，之后较长时间稳定在高 活菌状态，提示颗粒型菌肥的硅酸盐细菌定植效果液体型好，有利于在大田推广使用。结果见 表4。

说明两种菌肥都能增加根际土硅酸盐细菌的数量，其中液体型菌肥比颗粒型菌肥见效快， 但有效期只有30d左右。而以菌糠为载体制备的颗粒型菌肥整体效果比液体型菌肥好，活菌数 量高，效果较持久，使用有效期超过40d。

表6施液体菌肥和颗粒型菌肥的根际土硅酸盐细菌数量变化(个/g)

2、马铃薯根际土的主要理化指标测定

(1)采样及样品制备

一个混合土样以取土1kg左右为宜，去除植物根系、石块等，样品及时放在样品盘上摊成 薄薄的一层，置于干净整洁的室内通风处自然风用，木棍或塑料棍碾压，采用四分法匀样，过 2mm孔径筛的土样供pH值、速效钾等有效养分项目测定。过0.25mm孔径筛的土样供有机质、 全氮等项目的测定。

(2)速效钾的测定

根据农业部《测土配方施肥技术规范》耕地地力评价样品分析项目测定方法，速效钾采用 乙酸铵浸提——火焰光度法(NYT889-2004)测定。

表7施液体菌肥和颗粒型菌肥的根际土速效钾含量(mg/kg)

结果：

施液体型菌肥和颗粒型菌肥均能明显提高根际土的速效钾含量，20d前，液体菌肥组速效 钾含量高于颗粒型，20d后颗粒型菌肥组解钾效能高于液体菌肥，且颗粒型菌肥在30d时达到 最高，总体看，颗粒型菌肥比液体菌肥对速效钾的提高效果更显著，解钾菌组比混合菌组提高 速效钾效果更明显，结果见表5。说明硅酸盐细菌K2有较强的解钾能力，能有效提高马铃薯 根际土的速效钾含量。颗粒型比液体型持续解钾能力强，推测这与颗粒型载体提高了功能菌的 定植效率有关。(见图8)

(3)有机质含量的测定

根据农业部《测土配方施肥技术规范》耕地地力评价样品分析项目测定方法，有机质采用 重铬酸钾——硫酸溶液——油浴法(NY/T1121.6-2006)测定。

结果：施液体型菌肥和颗粒型菌肥均能明显提高马铃薯根际土的有机质含量，各实验组有 机质含量均第30d达到最高值，之后稍有下降。颗粒型菌肥比液体菌肥对有机质的提高效果更 显著，混合菌组比解钾菌组效果明显，结果见表8。

说明硅酸盐细菌K2能提高马铃薯根际土的有机质含量。颗粒型比液体型更有利于增加土 壤有机质的含量，因为菌糠作为颗粒型菌肥的载体本身也是有机物。

表8施液体菌肥和颗粒型菌肥的根际土有机质含量(％)

(4)有效磷含量的测定

根据农业部《测土配方施肥技术规范》耕地地力评价样品分析项目测定方法，有效磷采用 碳酸氢钠浸提——钼锑抗比色法(NY/T1121.7-2014)测定。

表9施液体菌肥和颗粒型菌肥的根际土有效磷含量(mg/kg)

结果：

施液体型菌肥和颗粒型菌肥均能明显提高根际土的有机磷含量，各实验组均在第40d达到 最高值。颗粒型菌肥比液体菌肥对有机磷的提高效果较明显，混合菌组比解钾菌组提高有机磷 效果更明显，均明显高于空白对照组，结果见表7。提示混合菌组中的解磷菌具有较好的解磷 功效，也不排除三种功能菌有协同解磷作用。

(5)碱解氮的测定

根据农业部《测土配方施肥技术规范》耕地地力评价样品分析项目测定方法，碱解氮采用 碱解扩散法法(LY/T1229-1999)测定。

表10施液体菌肥和颗粒型菌肥的根际土碱解氮(mg/kg)

结果：

施液体型菌肥和颗粒型菌肥均能明显提高马铃薯根际土的碱解氮含量，各实验组碱解氮含 量均第30d达到最高值，之后稍有下降。颗粒型菌肥比液体菌肥效果更显著，混合菌组比解钾 菌组效果明显，结果见表8。

碱解氮包括无机态氮和结构简单能为作物直接吸收利用的有机态氮，是可供作物近期吸收 利用的速效氮。碱解氮含量的变化与有机质含量的变化趋势一致。显示有机质的熟化程度跟碱 解氮含量密切相关。碱解氮能反映近期土壤的氮素供应能力，常将它作为土壤氮素有效性的指 标，提示颗粒型混合菌肥能提高土壤氮素供给能力。

(6)pH值测定

根据农业部《测土配方施肥技术规范》耕地地力评价样品分析项目测定方法，pH值采用 玻璃电极法(NY/T1121.2-2006)测定。

上述各实验组和空白对照组在pH值上差异不大，在pH5.6—5.9之间波动，组别差异不明 显，随着施肥时间的变化pH值波动不大。这个低酸性土壤有利于马铃薯生长。

(7)马铃薯叶绿素含量测定(乙醇提取-比色法测定)

第一步：.取新鲜马铃薯叶片，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继 续研磨至组织变白。静置3～5min。

第二步：取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用 滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最 后用乙醇定容至100mL，摇匀。

第三步：取叶绿体色素提取液，测定652nm波长吸光度，以95％乙醇为空白对照。

第四步计算方法：

测定结果：

颗粒型解钾菌试验马铃薯的株高明显高于液体型解钾菌试验，且两批混合菌组都高于解钾 菌组。液体型解钾菌试验马铃薯的茎粗明显高于颗粒型，且两批混合菌组都高于解钾菌组。颗 粒型解钾菌试验马铃薯的叶绿素稍微高于液体型，且两批混合菌组都高于解钾菌组，(见图9)。

说明，以菌糠为载体制备的颗粒型菌肥的促生效果体现在株高和叶绿素含量方面，而菌液 的促生效果体现在茎粗方面。两批试验三项数据都体现出混合菌组>解钾菌组>空白对照组，证 明硅酸盐细菌K2能有效促进马铃薯的生长，且施用混合菌菌肥比单一解钾菌菌肥效果更好。

实施例8：包含粉状钾长石或粉状伊利石的马铃薯专用菌肥

将经过培养的解钾菌菌液、经紫外线灭菌的菌糠与灭菌后粉状钾长石或粉状伊长石中的任 一种或二种的混合体均匀混合，粉状钾长石或粉状伊长石以重量计占比为1％～10％，即成含粉 状钾长石或粉状伊长石的马铃薯专用菌肥，让马铃薯专用菌肥在肥料阶段就形成胞外多糖粘结 的细菌——矿物复合体，增强早期的解钾能力。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保 护范围。