阅读说明：本技术 锌离子载体及其用途 (Zinc ionophore and use thereof ) 是由 M·沃克尔 C·麦科德维特 M·范艾特兹特恩 A·麦克万 于 2018-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及锌(II)盐与锌离子载体的组合在恢复在先耐药性致病菌对抗生素的敏感性中的用途。还描述了使耐药性致病菌对抗生素重新敏感的方法,所述方法包括施用锌离子载体与(II)盐的组合；和治疗细菌感染的方法,所述方法包括施用锌离子载体与锌(II)盐的组合,同时和/或顺序地施用治疗有效量的抗生素。(The present invention relates to the use of a combination of a zinc (II) salt and a zinc ionophore to restore the sensitivity of previously drug resistant pathogenic bacteria to antibiotics. Also described is a method of resensitising a drug-resistant pathogen to an antibiotic, the method comprising administering a zinc ionophore in combination with (II) a salt; and methods of treating bacterial infections comprising administering a combination of a zinc ionophore and a zinc (II) salt, simultaneously and/or sequentially with a therapeutically effective amount of an antibiotic.)

具体实施方式

和附图来描述本发明。然而，应当理解，以下描述的特殊性并不取代如前所述的本发明的一般性。

实施例

材料和方法

材料

硫酸锌和氯化锌购自Sigma-Aldrich(Castle Hill，NSW，Australia)。锌离子载体氯碘羟喹(CQ)也购自Sigma-Aldrich。锌离子载体PBT2和RA-HQ-12由Mark von Itzstein教授的小组(Glycomics Institute，Griffith University，Queensland，Australia)合成。抗生素购自Sigma-Aldrich(Castle Hill，NSW，Australia)。

PBT2和RA-HQ-12合成

PBT2根据US20080161353A1、按照如下合成路径合成。

最初，通过在1,4-二噁烷中将1与二氧化硒加热进行5,7-二氯-2-甲基-8-醇(1)的甲基侧链的氧化，以定量收率得到醛2。然后使所得的粗产物与在1,2-二氯乙烷和三乙胺中的二甲胺盐酸盐进一步反应，得到产物，将所述产物通过用三乙酰氧基硼氢化钠处理原位还原，得到PBT2的游离胺，为油状物。用HCl酸化游离胺时，得到PBT2盐酸盐，收率为81％。纯度>95％(¹H和¹³C NMR分析)。

根据WO2017/053696(University of Florida Research FoundationIncorporated)第114、115和121页中描述的方法制备RA-HQ-12。

通用合成方法

购自商业来源的试剂和干燥溶剂无需进一步纯化即可使用。使用烘干的玻璃器皿在氩气气氛下进行无水反应。使用薄层色谱法(TLC)在预先涂有硅胶60F254(E.Merck)的铝板上监测反应。在254nm的UV光下观察显影后的板，然后在涂布EtOH(5％v/v)中的H₂SO₄溶液并加热后可视化。使用蒸馏溶剂在硅胶60(0.040-0.063mm)上进行快速色谱。用BrukerAvance 400MHz光谱仪分别在400和100MHz处记录¹H和¹³C NMR光谱。相对于作为内部参比物的残留溶剂峰，以百万分之份数报告化学位移(δ)[CDCl₃：7.26(s)，¹H；77.0(t)，¹³C]。使用电喷雾电离模式下，使用正电离模式用Bruker Daltonics Esquire 3000ESI上记录低分辨率质谱(LRMS)。通过¹H和¹³C NMR判断终产物3的纯度>95％。

5,7-二氯-8-羟基-2-喹啉甲醛(2)

在55℃下向二氧化硒(1.75g，15.80mmol)在1,4-二噁烷(80mL)中的搅拌悬浮液中，在3h期限内以逐滴的方式添加5,7-二氯-2-甲基-喹啉-8-醇(2.0g，8.77mmol)在1,4-二噁烷(20mL)中的溶液。添加完成后，加热温度升至80℃，维持加热过夜。然后将反应混合物冷却至室温，用C盐床过滤出不溶性固体。真空浓缩滤液，用***(10mL x 3)洗涤残余物，得到2.10g(定量收率)的醛2，为黄色粉末，其未经进一步纯化即用于下一步。

5,7-二氯-2-((N,N-二甲基氨基)甲基)喹啉-8-醇HCl盐(3，PBT2 HCl)

向粗醛2(2.0g，8.26mmol)和二甲胺盐酸盐(730mg，8.96mmol)在1,2-二氯乙烷(100mL)中的搅拌溶液中以逐滴方式加入三乙胺(1.25mL，8.96mmol)。将该混合物在室温(RT)下搅拌5min，然后在5min内逐步加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.4g，11.32mmol)。然后将该混合物在RT搅拌过夜。反应完成时，将该反应混合物用二氯甲烷(200mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(100mL x 3)洗涤。然后用无水Na₂SO₄干燥有机层，真空浓缩，得到PBT2的游离胺碱的油状产物。将油状产物与水(100mL)研磨，用***(100mL×4)萃取。合并醚萃取液，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。向获得的残余物中加入10mL浓HCl(38％HCl)，真空浓缩该混合物。用二氯甲烷(50mL x 3)洗涤所得残余物，得到2.30g PBT-HCl盐，为淡黄色粉末(81％收率)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ2.32(s，6H，2NCH₃)，3.78(s，2H，CH₂)，7.51(s，1H，H-6)，7.61(d，J＝8.7Hz，1H H-4)，8.39(d，J＝8.6Hz，1H，H-3)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)：δ45.64(NCH₃)，45.64(NCH₃)，65.46(CH₂)，115.51(C-7)，120.35(C-5)，122.26(C-3)，124.07(q碳)，127.76(C-6)，133.83(C-4)，138.16(q碳)，147.98(C-8)，158.93(C-2)；LRMS[C₁₂H₁₂Cl₂N₂O](m/z)：(+ve离子模式)272.0[M+H]⁺。

方法

细菌菌株、培养基和生长条件

使GAS HKU16、MRSA USA300、VRE RBWH1、肺炎克雷伯菌菌株MS6771、大肠杆菌菌株MS8345和肺炎链球菌菌株23F生长在Todd-Hewitt肉汤(THB)或具有1％酵母提取物的琼脂(THY)[Todd，E.W.&Hewitt，L.F.A new culture medium for the production ofantigenic streptococcal haemolysin.J.Path.Bact.35，973-974(1932)]或阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(MHB)[Mueller，J.H.&Hinton，J.A Protein-free Medium forPrimary Isolation of the Gonococcus and Meningococcus.Proc.Soc.Exp.Diol.andMed 48，330-333(1941)]或琼脂(对于HKU16和肺炎链球菌补充了2.5％溶解马血(LHB))中。使细菌定期生长在37℃和环境气氛中。

先前已经描述了肺炎克雷伯菌菌株MS6771和肺炎链球菌菌株23F(Zowawi HM，Forde BM，Alfaresi M，Alzarouni A，Farahat Y，Chong TM，Yin WF，Chan KG，Li J，Schembri MA，Beatson SA，Paterson DL.Stepwise evolution of pandrug-resistancein Klebsiella pneumoniae.Sci Rep.2015 5:15082.doi:10.1038/srep15082；BarnesDM，Whittier S，Gilligan PH，Soares S，Tomasz A，Henderson FW.Transmission ofmultidrug-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae in group day care：evidence suggesting capsular transformation of the resistant strain in vivo.JInfect Dis.1995 171:890-6)。大肠杆菌菌株MS8345为MCR-1耐药性临床分离物，由Prof.D.L.Paterson，University of Queensland Centre for Clinical Research提供。

铜绿假单胞菌菌株253-43-C和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)菌株42-A为黏菌素耐药性临床分离物。它们得自JanBell，Australian Centre of Microbial ResistanceEcology(ACARE)，University of Adelaide，Australia。如上所述使微生物生长在Todd-Hewitt肉汤(THB)或琼脂具有1％酵母提取物(THY)或阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(MHB)中。

滴落试验(Drop test assay)

从过夜培养物中稀释细菌，得到在THY中的起始OD₆₀₀为0.01。一旦细菌生长至OD₆₀₀为0.6，则将培养物在PBS中连续稀释，然后将5μL稀释液(未稀释的、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)各自在含或不含锌(400μM)和/或PBT2(1μM)的THY琼脂板上铺板。将板在37℃下温育过夜。滴落试验以生物学一式三份进行。

电感耦合等离子体质谱法(ICP MS)

将细菌的过夜培养物在45mL MHB(+/-2.5％LHB)中稀释至OD₆₀₀为0.05，并生长至对数中期。在8℃下以7,000x g收获细胞7min。将沉淀重悬于含有5mM EDTA的20mL PBS中，并在8℃下以7,000x g再次沉淀7min。重复洗涤两次以上，然后将沉淀重新悬浮在不含EDTA的20mL PBS中。在8℃下以7,000x g再次收获细胞7min，然后用PBS洗涤沉淀。离心后，将沉淀重新悬浮在1mL PBS中，并转移到Eppendorf管中。在8℃下以18,000x g将细胞沉淀7min，除去上清液，并将沉淀在96℃下干燥过夜。称重干燥的沉淀以确定干细胞重量，将其重悬于1mL的35％HNO₃中，并谨慎地加热至96℃下60min。涡旋后，将样品以18,000x g离心25min以沉淀细胞碎片。为了进行ICP分析，将200μL上清液稀释入1.8mL双蒸H₂O中。用Agilent7500cx ICP-MS(Adelaide Microscopy，University of Adelaide)分析样品。分析生物学一式三份样品。

最小抑菌浓度(MIC)测定

根据CLSI指南(“Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Testsfor Bacteria That Grow Aerobically”，Clinical and Laboratory StandardsInstitute)[Clinical and Laboratory Standards Institute.M100 PerformanceStandards for Antimicrobial Susceptibility Testing，第27版，(2017)]，通过肉汤微量稀释测定MIC。MIC测定在96-孔板中进行，每孔的总体积为100μL。对于MRSA、VRE、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌，在MHB中进行测定，对于GAS和肺炎链球菌，使用MHB+2.5％溶解的马血(LHB)。用直接菌落悬浮液制备细菌接种物，目标在于每孔2-8 x 10⁵菌落形成单位(CFU)/mL细菌。将抗生素/化合物在96-孔板上连续稀释两倍，最后一列不含抗生素/化合物。将接种物添加到含有抗生素/化合物的平板中，并在35+/-2℃下温育16-24h。将MIC测定为没有可见生长的抗生素/化合物的最低浓度。MIC测定以生物学一式三份进行。

耐药性发生研究

抗生素/化合物的耐药性的发生基本上如先前所述进行[(Ling，L.L.等人A newantibiotic kills pathogens without detectable resistance.Nature 520，388，doi:10.1038/nature14303(2015)]。为了研究在亚抑菌浓度的PBT2和锌存在下GAS、MRSA和VRE的耐药性发生情况，使细菌在30天内连续传代，作为对照，将抗生素环丙沙星用于GAS、MRSA，并且将氯霉素用于VRE。最初，按照CLSI指南在微量滴定板中通过肉汤微量稀释测定PBT2-锌或抗生素的MIC。将过夜温育后仍显示生长的最高抗生素或PBT2-锌浓度以1/250稀释入新的微量滴定板中，该滴定板含有两倍稀释的抗生素或PBT2-锌。重复此过程30天。以生物学一式三份进行测定。

细菌时间-杀伤测定

使细菌在THY中生长至对数中期，然后稀释至仅在THY中或含有PBT2(GAS为2μM，MRSA和VRE为6μM)和/或ZnSO₄(GAS为400μM，MRSA和VRE为600μM)的OD₆₀₀为0.05。为了确定细菌的存活数量，在0、1、2、4、6和24小时取出等分试样，将其在PBS中连续稀释并铺在THY琼脂平板上。在37℃温育过夜后，对活菌进行计数。在生物学一式两份中进行时间杀灭测定。

鼠伤口感染模型

对于伤口感染，使用4-7周龄的雌性BALB/c小鼠，并使其居留在单独的笼中[Pandey，M.等人A synthetic M protein peptide synergizes with a CXC chemokineprotease to induce vaccine-mediated protection against virulent streptococcalpyoderma and bacteremia.J Immunol 194，5915-5925，doi:10.4049/jimmunol.1500157(2015)]。实验前，用Nair(Church&Dwight)将小鼠的颈部剃毛并去除残留的毛发。在感染当天，通过吸入甲氧基氟烷麻醉小鼠，并使用金属锉刀(metal file)在剃毛后的皮肤上形成一小块浅表划痕。为了进行感染，将5x10⁶-2x10⁷ CFU GAS或5x10⁵-2x10⁶ CFU MRSA/VRE涂在已划伤的皮肤上。接种物通过皮肤吸收后(约10分钟)，仅用软膏(Pharmacy Choice水性霜剂)或含PBT2和/或锌和/或抗生素的软膏(GAS为四环素；VRE为万古霉素)治疗小鼠。每天用软膏治疗小鼠两次，总计施加9次治疗。每次治疗由约25-30mg软膏组合，并包含5mM PBT2和/或50mM ZnSO₄(MRSA和VRE)或50mM ZnCl₂(GAS)。对于包括抗生素的实验，该软膏包含2mMPBT2和/或25mM ZnSO₄和/或1.5％四环素或万古霉素。治疗四天后，对小鼠实施安乐死，切除有划痕的皮肤，并通过涡旋30秒在PBS中洗涤两次。然后使用FastPrep仪器(MPBiomedicals)在裂解基质F管中将皮肤匀浆，并铺板在THY板上以测定活菌(对于GAS，将匀化物在具有10μg/mL新霉素的THY上铺板，对于MRSA和VRE在具有10μg/mL氨苄西林的THY上铺板)。每个治疗组包含6只小鼠，并使用非配对t-检验(非参数)计算统计学显著性。

鼠全身感染模型

对于全身感染，通过腹膜内注射使雌性CD1小鼠感染1.4x10*5CFU的肺炎克雷伯菌菌株52.145ΔmgrB(Kidd等人AKlebsiella pneumoniae antibiotic resistancemechanism that subdues host defences and promotes virulence，EMBO MolMed.2017Apr；9(4)：430-447.doi:10.15252/emmm.201607336)。感染后四小时，每天腹膜内注射(共3天期限)处理小鼠组(n＝10)。每次处理均由PBT2(1.67mg/kg)和硫酸黏菌素(0.05mg/kg)的组合组成，该组合由dH₂0中的100μL 2％(v/v)DMSO组成。给阴性对照小鼠施用在dH₂0中的100μL 2％(v/v)DMSO。监测存活5天。

RNA分离

使用

Pro Blue试剂盒(MP Biomedicals)和SV总RNA分离系统(Promega)分离RNA。简言之，在PBT2和/或ZnSO₄存在或不存在下，使细菌在MHB中生长至对数中期(OD₆₀₀ 0.4-0.5)(对于GAS为+2.5％LHB)。将两个体积的RNAprotect(Qiagen)添加到培养物中，然后将样品在4℃下以5,000x g离心25min，以使细胞沉淀。将干燥的沉淀在-80℃下储存过夜，然后重悬于1mL RNA pro溶液中(

Pro Blue试剂盒)。将样品转移至裂解基质B中，并在FastPrep仪器(MP Biomedicals)中进行处理。在4℃下以13,000x g离心15min后，将上清液转移至新管中，并在室温下温育5min。加入300μl氯仿，并将混合物涡旋10秒。在室温下温育5min后，将上层相移至包含200μl冷的95％EtOH的新管中。将样品在冰上放置至少5min，然后转移到SV总RNA分离系统旋转柱中。根据制造商的说明对样品进行处理，并用110μl无核酸酶的水洗脱。为了确保完全去除DNA，然后使用无TURBO DNA试剂盒(Thermo Fisher Scientific)根据制造商的说明进一步纯化RNA。

实时PCR

使用SuperScriptIII第一链合成试剂盒(Invitrogen)将1μg分离的RNA转化成cDNA。按照制造商的说明，使用SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)进行实时PCR。使用ViiA7实时PCR系统(Life Technologies)，应用以下条件下进行测定：95℃10min，95℃持续15秒和60℃1min的40个循环，和95℃2分钟、60℃15秒和95℃15秒的最终解离循环。相对基因表达通过ΔΔCT方法、使用proS(GAS)，rrsA(MRSA)和23S(VRE)用作参比基因来计算。所有实验均以生物学一式三份进行，并以技术一式三份测定。用于实时PCR的引物在表A中给出(如下)。

表A.用于实时PCR的引物

RNASeq分析

在Australian Genome Research Facility进行RNASeq分析。使用Ribo-零链方案制备文库。简言之，用Ribo Zero去除rRNA，将RNA片段化(热和二价阳离子)，并用SuperScript II逆录酶(Invitrogen)进行第一链cDNA合成。对于第二链cDNA合成，将该链用dUTP“标记”。进行DNA片段的3'腺苷酸化，然后对衔接子连接进行测序(利用衔接子和DNA片段的T-A配对)。通过PCR扩增文库(仅扩增“未标记的”第一链)。使用Agilent的Bioanalyser DNA 1000芯片或TapeStation D1K TapeScreen系统评价文库。在标准化(2nM)和合并之前，使用qPCR定量各个文库。合并文库并通过使用TruSeq PE Cluster Kitv3试剂的Illumina cBot系统聚类，然后在使用110 TruSeq SBS试剂盒v3试剂的IlluminaHiSeq 2500系统上进行测序(101读数为1，9个循环指数读数)。使用HiSeq 2500超高通量测序系统(Illumina)对文库进行测序，以产生100个碱基配对的末端读数。每个样品平均产生4500万次读数，并使用STAR比对器(aligner)的2-通道方法(具有默认参数)对猪参比基因组(Sscrofa10.2)作图。这些读数的80％独特地命中参比基因组。用Picard的MarkDuplicates工具(http://broadinstitute.github.io/picard)表示一式两份的读取。使用Degust(http://victorian-bioinformatics-consortium.github.io/degust/)分析差异基因表达，并使用R-Studio[RStudio Team.Integrated Development forR..RStudio，Inc.，Boston，MA(2015)]生成数字。

VRE测序

为了确定RBWH1的完整基因组序列，使用Pacific Biosciences RS II平台进行了长读、单分子实时(SMRT)测序。使用HydroShear Plus(Digilab)剪切基因组DNA，并使用DNA模板制备型试剂盒2.0(Pacific Biosciences)制备文库。使用XL聚合酶和测序试剂盒C2(Pacific Biosciences)对单一SMRT细胞进行测序。过滤长读数鉴定出的147,593个读物，其具有平均聚合酶读数长度为4.8kb。为了有助于基因组装配验证，还在Illumina Next-seq上对RBWH1进行测序，以产生读数长度为150个碱基的配对末端读段。使用Unicyclerv0.4进行重新组装，其中使用PacBio SMRT分析v2.3.0生成的校正后的PacBio长读数。将该组件手动环化以生成染色体序列。

PBT2充当针对GAS菌株HKU16、MRSA菌株USA300和VRE临床分离物RBWH1的抗菌剂的可能性

使用临床和实验室标准协会指南(Clinical and Laboratory StandardsInstitute guidelines)进行抗菌敏感性测试[Clinical and Laboratory StandardsInstitute.M100 Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting，第27版，(2017)]，研究了PBT2用作抗菌剂针对GAS菌株HKU16(Tse，H.等人Molecular characterization of the 2011 Hong Kong scarlet fever outbreak.JInfect Dis 206，341-351，doi:10.1093/infdis/jis362(2012)]、MRSA菌株USA300[Diep，B.A.等人Complete genome sequence of USA300，an epidemic clone of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Lancet 367，731-739，doi:10.1016/S0140-6736(06)68231-7(2006)]和VRE临床分离物RBWH1的潜力。

在所使用的浓度下，PBT2和锌(II)离子(以氯化锌的形式)均未显示出抗菌活性。然而，PBT2+氯化锌的组合对每种革兰氏阳性病原体(图1A和表B)均表现出抗菌活性，并且发现其作用方式实际上具有杀菌作用(图1B)。

表B PBT2和锌对***病原体具有活性

MIC值是根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。

研究了各病原体对PBT2+氯化锌的组合产生耐药性的能力。在亚抑制浓度下PBT2+氯化锌存在下，连续传代30天期限后，未发现任何革兰氏阳性病原体的耐药性突变体(图1C)。伤口感染模型用于研究PBT2+锌处理的功效[Pandey，M.等人A synthetic M proteinpeptide synergizes with a CXC chemokine protease to induce vaccine-mediatedprotection against virulent streptococcal pyoderma and bacteremia.J Immunol194，5915-5925，doi:10.4049/jimmunol.1500157(2015)]。PBT2+锌(II)离子(ZnCl₂或ZnSO₄形式)的应用显著降低感染部位上的细菌载量(图1D)。

每种革兰氏阳性病原体响应于亚抑制浓度的PBT2+锌(II)离子的转录组的变化

通过分析各革兰氏阳性病原体各自的转录组序列响应于亚抑制浓度的PBT2+锌(II)离子，研究了PBT2+锌(II)离子处理的作用机制。通过实时RT-PCR观察并证实重金属稳态基因转录的变化(图2A和2B)。

尽管对PBT2+锌(II)离子处理的细菌转录响应包括重金属外排系统的诱导，但是正如通过电感耦合等离子体质谱法评价的，细菌胞内锌离子浓度显著升高(图2C)。此外，亚抑制浓度的PBT2+锌(II)离子也破坏了几种主要毒力和代谢系统的转录(图2A和2B)。

锌(II)离子使致病菌对不同抗生素类别重新敏感

鉴于由PBT2+锌(II)离子的组合诱导的细菌系统的显著转录变化，使用耐四环素-和耐大环内酯GAS菌株HKU16和多药耐药性菌株MRSA USA300和VRE RBWH1和肺炎链球菌菌株23F研究这种破坏是否增强在耐药性细菌病原体中的抗生素敏感性。还检查了革兰氏阴性肺炎克雷伯菌MS6771和MCR1-阳性大肠杆菌菌株MS8345的耐药性。在仅有抗生素存在下，MS6771、MS8345、23F、HKU16、USA300和RBWH1表现出对几种抗生素的耐药性。单独添加PBT2或锌(II)离子通常不会影响抗生素耐药性。然而，添加亚抑制浓度的PBT2+锌(II)离子会导致耐药性细菌菌株变得对以下抗生素敏感：肺炎克雷伯菌MS6771变得对黏菌素、多黏菌素B、四环素、替吉环素和多西环素敏感，但对阿米卡星不敏感(表1)；MCR1-阳性大肠杆菌菌株MS8345变得对黏菌素和多黏菌素B敏感(表2)；肺炎链球菌菌株23F变得对青霉素、四环素和氯霉素敏感(表3)；GAS菌株HKU16变得对四环素、多黏菌素B和黏菌素敏感(表4)；VRE RBWH1变得对万古霉素、四环素、多黏菌素B和黏菌素敏感(表5)；而MRSA USA300变得对苯唑西林、红霉素、氨苄西林、多黏菌素B和黏菌素敏感(表6)。在这些实验中，使用氯碘羟喹替代PBT2时，观察到相似的结果(表1-6)。另外，对于革兰氏阴性病原体肺炎克雷伯菌MS6771和MCR1-阳性大肠杆菌菌株MS8345，PBT2和黏菌素或PBT2和多黏菌素B的组合也导致对黏菌素或多黏菌素B敏感(表1-2)。在这些实验中，使用氯碘羟喹(CQ)代替PBT2时，观察到相似的结果(表1-2)。

表1：氯碘羟喹(CQ)或PBT2和锌离子存在或不存在下不同抗生素对肺炎克雷伯菌的MIC

MIC值根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。在PBT2+/-Zn下，从耐药性到敏感性的MIC变化以粗体突出显示。

表2：氯碘羟喹(CQ)或PBT2和锌离子存在或不存在下不同抗生素对MCR-1大肠杆菌的MIC

MIC值根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。在PBT2+/-Zn下，从耐药性到敏感性的MIC变化以粗体突出显示。

表3：PBT2和锌离子存在或不存在下不同抗生素对肺炎链球菌23F的MIC

MIC值根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。在PBT2+/-Zn下，从耐药性到敏感性的MIC变化以粗体突出显示。*没有可用的断点信息。

表4：氯碘羟喹(CQ)或PBT2和锌离子存在或不存在下不同抗生素对酿脓链球菌菌株HKU16的MIC

MIC值根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。在PBT2+/-Zn下，从耐药性到敏感性的MIC变化以粗体突出显示。

表5：氯碘羟喹(CQ)或PBT2和锌离子存在或不存在下不同抗生素对耐万古霉素肠球菌(VRE)临床分离物RBWH1的MIC

MIC值根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。在PBT2+/-Zn下，从耐药性到敏感性的MIC变化以粗体突出显示。

表6：氯碘羟喹(CQ)或PBT2和锌离子存在或不存在下不同抗生素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株USA300的MIC

MIC值根据CLSI指南通过肉汤微量稀释测定，n＝3。在PBT2+/-Zn下，从耐药性到敏感性的MIC变化以粗体突出显示。*根据CLSI指南，+2％NaCl。

表7：PBT2存在或不存在下多黏菌素抗生素黏菌素和多黏菌素B的MIC

在不存在(未经处理)或存在PBT2下进行铜绿假单胞菌菌株253-43-C和鲍氏不动杆菌菌株42-A MIC测定。根据CLSI指南，以粗体突出显示的MIC值表示抗生素敏感性断点(≤4μg/mL)。数据代表3次生物学重复样品的平均值。

RA-HQ-12+锌(II)离子与抗生素的组合对感染的功效

观察到RA-HQ-12+锌(II)离子(ZnSO₄)的组合使GAS HKU16、MRSA USA 300、VRERBWH1和肺炎克雷伯菌MS6671对多黏菌素类抗生素黏菌素和多黏菌素B重新敏感。在RA-HQ-12和ZnSO₄存在下观察到GAS HKU16对四环素的中等抗生素重新敏感(表8)。

表8：RA-HQ-12和硫酸锌的组合使革兰氏阳性和革兰氏性病原体对抗生素的多黏菌素类别重新敏感

*根据CLSI指南，在2％NaCl存在下测定苯唑西林对MRSA的MIC。其中GAS、MRSA、VRE或肺炎克雷伯菌在RA-HQ-12+锌存在下从耐药性到敏感性的MIC变化的抗生素浓度以粗体^#突出显示。在RA-HQ-12+锌存在下，MIC从耐药性到中等敏感性的变化以粗体突出显示。

PBT2+锌(II)离子与抗生素的组合对感染的功效

使用伤口感染模型研究了PBT2+锌(II)离子与抗生素组合对感染的功效。单独的抗生素和亚抑制浓度的PBT2+锌(II)离子都不能减少感染部位上的细菌载量。然而，组合形式的PBT2+锌(II)离子可使GAS对四环素治疗和VRE对万古霉素治疗重新敏感，由此显著减轻感染(图3)。

使用CD1小鼠的鼠全身(i.p.)感染模型研究了PBT2与黏菌素组合对高毒力的耐黏菌素肺炎克雷伯菌菌株52.145ΔmgrB的功效。这证明了PBT2+黏菌素处理可防止CD1小鼠中耐黏菌素肺炎克雷伯菌菌株52.145ΔmgrB死亡(图4)。这一观察结果为降低人中的黏菌素的剂量铺平了道路，从而有可能避免了这种药物的毒性。在亚抑制浓度的各相应化合物的存在下，连续传代30天期限后，未检测到肺炎克雷伯菌MS6671对PBT2+黏菌素的耐药性(图5)。

PBT2与锌(II)离子组合具有抗菌活性，并且在亚抑制浓度下可以逆转革兰氏阳性菌对多种重要抗生素的耐药性。基于这种作用的作用机制显然是重金属稳态的变化以及必需毒力和代谢系统的严重破坏，这可能削弱这些细菌病原体引起感染的能力。

基于该作用的作用机制显然与重金属稳态变化以及必需毒力和代谢系统的严重破坏有关，所有这些都可能削弱这些细菌病原体引起感染的能力。对抗生素耐药性的影响并不普遍。例如，红霉素耐药性在MRSA中得到逆转，而在GAS中却没有。另一方面，革兰氏阳性病原体本质上对多黏菌素和黏菌素具有耐药性(参见，Li，J.等人Colistin：the re-emerging antibiotic for multidrug-resistant Gram-negative bacterialinfections.Lancet Infect Dis 6，589-601，doi:10.1016/S1473-3099(06)70580-1(2006)，Falagas，M.E.&Kasiakou，S.K.Colistin：the revival of polymyxins for themanagement of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections.ClinInfect Dis 40，1333-1341，doi:10.1086/429323(2005)]，而PBT2+处理逆转了GAS、MRSA和VRE中的耐药性。PBT2+锌处理逆转了GAS、MRSA和VRE中的耐药性。

PBT2为对人类安全的锌离子载体，其已经进行至2期人临床试验[参见，例如Chakradhar，S.What's old is new：Reconfiguring known antibiotic to fight drugresistance.Nat Med 22，1197-1199，doi:10.1038/nm1116-1197(2016)；Lannfelt，L.等人Safety，efficacy，and biomarker findings of PBT2 in targeting Abeta as amodifying therapy for Alzheimer's disease：a phase IIa，double-blind，randomised，placebo-controlled trial.Lancet Neurol 7，779-786，doi:10.1016/S1474-4422(08)70167-4(2008)]。尽管将锌用作营养补充剂和顺势疗法药物时，已知高浓度的锌为毒性的。使用离子载体PBT2递送锌可以将功效所需的锌浓度降低至生理上可以耐受的水平[World Health Organization.Environmental Health Criteria 221：Zinc，<http://www.who.int/ipcs/publications/ehc/ehc_221/en/>(2001)]。细菌生理学失稳可能会通过挽救已变成细菌耐药性的抗生素的功能来规避抗生素耐药性。

本领域技术人员将会理解，许多改变和变型将变得显而易见。对于本领域技术人员而言显而易见的所有这类改变和变型都应被认为落入出现在之前广泛描述的本发明的精神和范围内。

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