阅读说明：本技术 空褐鳞碱类化合物在预防、治疗car-t疗法导致的细胞因子释放综合征中的应用 (Application of anopheline compound in preventing and treating cytokine release syndrome caused by CAR-T therapy ) 是由 刘茂玄 许晨光 黎琴子 曾滢 于 2019-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了空褐鳞碱类化合物在制备预防、治疗CAR-T疗法导致的细胞因子释放综合征的制剂中的应用。还提供了一种用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病的药物组合物,包括嵌合抗原受体T细胞和空褐鳞碱类化合物。本发明通过将嵌合抗原受体T细胞和空褐鳞碱类化合物联用,可以以较低的经济成本来预防和/或治疗CAR-T细胞疗法导致的CRS副作用,进而发挥出CAR-T细胞疗法的较好治疗效果。(The invention provides application of an alopecuroid compound in preparing a preparation for preventing and treating cytokine release syndrome caused by CAR-T therapy. Also provided is a pharmaceutical composition for treating malignant tumor, autoimmune disease or AIDS, comprising chimeric antigen receptor T cells and an empty limonoid base compound. According to the invention, the chimeric antigen receptor T cell and the anopheline compound are combined, so that CRS side effects caused by CAR-T cell therapy can be prevented and/or treated at a low economic cost, and a good treatment effect of the CAR-T cell therapy is further exerted.)

空褐鳞碱类化合物在预防、治疗CAR-T疗法导致的细胞因子释 放综合征中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及空褐鳞碱类化合物在预防、治疗CAR-T疗法导致的细胞因子释放综合征中的应用。

背景技术

癌症等恶性疾病是全球范围内严重危害人类健康的疾病，严重时影响生命。目前，癌症等的治疗方法包括非特异性免疫治疗、主动免疫治疗、过继性细胞免疫治疗等。其中，过继性细胞免疫治疗被认为是现有科技中有可能彻底清除癌细胞的方法。而嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术作为当前过继性细胞回输治疗技术最新的免疫细胞技术之一，它是将经过基因工程修饰的T淋巴细胞(可以表达特异性嵌合抗原受体)回输至人体，以不依赖于主要组织相容性复合体的方式活化T淋巴细胞，从而特异性地杀伤癌细胞等恶性靶细胞。CAR-T技术因对恶性细胞的靶向性、杀伤活性和持久性强而在癌症等恶性疾病的治疗方面展示出了巨大的应用前景。

虽然CAR-T细胞疗法在一些临床试验中取得了较好的效果，但同时也出现了一些较为严重的副作用，例如目前最常见的细胞因子释放综合征(CRS)，导致患者血液中某些细胞因子水平显著提高，出现发烧、心动过速、低血压等，严重时可导致患者多器官衰竭和死亡。因此，有必要抑制CAR-T细胞免疫治疗过程中细胞因子的释放，缓解/消除CRS副作用，以提高CAR-T细胞的治疗效果。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种预防、治疗CAR-T细胞免疫疗法导致的CRS的技术方案。

第一方面，本发明提供了空褐鳞碱类化合物在制备预防和/或治疗嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法导致的细胞因子释放综合征(CRS)的制剂中的应用。

本发明中，所述空褐鳞碱类化合物包括空褐鳞碱(bulbocapnine)、其互变异构体、其药学上可接受的盐或前药、以及空褐鳞碱衍生物。

其中，所述CAR-T细胞疗法包括用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病。

进一步地，所述恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***和***癌中的一种或多种，但不限于此。

进一步地，所述自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、溃疡性结肠炎和桥本甲状腺炎中的一种或多种，但不限于此。

本发明中的所述空褐鳞碱类化合物为小分子药物，价格比在发生CRS副作用后所采用的抑制细胞因子的抗体药物低很多，可以以较低的经济成本达到减轻CAR-T细胞疗法导致的CRS副作用的目的；同时，空褐鳞碱通过抑制儿茶酚胺类物质的释放，相较于抗体药物只能抑制一种细胞因子的活性而言，其可以抑制多种细胞因子的活性，从而对CRS的预防和/或治疗效果更好。

第二方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和空褐鳞碱类化合物。

可选地，所述CAR-T细胞包括靶向CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD317、BCMA、EGFR、Mesothelin、DR5、c-met、OX40、HER2中的一种或多种的CAR-T细胞。

其中，所述CAR-T细胞中的T细胞来自自体T细胞、异体T细胞或iPSC诱导的T细胞。

所述药物组合物中，所述CAR-T细胞与所述空褐鳞碱类化合物可以单独存在，也可以混合存在。作为药物组合使用时，二者可以同时给予，也可先后给予或以不同的给药方式给予。

在本发明一实施方式中，所述CAR-T细胞的给药方式为静脉注射，所述空褐鳞碱类化合物的给药方式为腹腔注射。

第三方面，本发明还提供了所述药物组合物在制备治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病的制剂中的应用。

本发明通过将CAR-T细胞和空褐鳞碱类化合物联用，可以预防和/或治疗CAR-T细胞疗法导致的CRS副作用(且不仅仅是抑制一种细胞因子的水平)，进而发挥出CAR-T细胞疗法的较好治疗效果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施方式提供了空褐鳞碱类化合物在制备预防和/或治疗嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法导致的细胞因子释放综合征(CRS)的制剂中的应用。

其中，所述空褐鳞碱的结构式如下式(Ⅰ)所示：

本发明所述的“空褐鳞碱类化合物”除了包括空褐鳞碱(bulbocapnine)之外，还可以包括其互变异构体、或其药学上可接受的盐或前药，以及包括本领域技术人员能够通过简单的化学方法(如还原、取代等方法)对其骨架上的侧链基团进行修饰，而仍然保留预防和/或治疗CAR-T细胞疗法导致的CRS的各种衍生物，这些衍生物的合成方法可以参考现有技术中的教科书。

其中，“药物学上可接受的盐”指的是由药物学上可接受的无毒酸(包括无机酸，有机酸)、无毒碱(包括无机碱，有机碱)、溶剂化物，水合物或笼合物制备的化合物的盐。

前药可在化合物的分离和纯化期间原位制备，或将纯化的化合物与合适的衍生剂分别反应来制备。例如，可在催化剂存在下，用羧酸处理将互变异构体的羟基转化为酯基。可裂解的醇前药部分的示例包括：取代或未取代的、支化的或未支化的低级烷基酯，例如乙酯，低级烯基酯，二低级烷氨基低级烷基酯，例如二甲基氨基乙酯，酰氨基低级烷基酯，酰氧基低级烷基酯(例如新戊酰氧基甲酯)，芳基酯，例如苯基酯，芳基-低级烷基酯，例如可被取代的苄基酯，例如被甲基、卤素或甲氧基取代的芳基和芳基-低级烷基酯，酰胺，低级烷基酰胺，二低级烷基酰胺，以及羟基酰胺。

空褐鳞碱是一种来源于紫堇属植物的阿朴啡(类)生物碱天然化合物，它可以通过抑制酪氨酸羟化酶的活性而限制儿茶酚胺类物质的合成，进而抑制细因子的释放，从而对CAR-T细胞疗法导致的CRS进行预防和/或治疗。

本发明中的所述空褐鳞碱类化合物为小分子药物，价格比在发生CRS副作用后所采用的抑制细胞因子的抗体药物低很多，可以以较低的经济成本达到减轻CAR-T细胞疗法导致的CRS副作用的目的；同时，空褐鳞碱通过抑制儿茶酚胺类物质的释放，相较于抗体药物只能抑制一种细胞因子的活性而言，其可以抑制多种细胞因子的活性，从而对CRS的预防和/或治疗效果更好。

本发明所述的CAR-T细胞包括靶向各种不同恶性疾病靶点的CAR-T细胞，如：靶向CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD317、BCMA、EGFR、Mesothelin、DR5、c-met、OX40、HER2等中的一种或多种。

其中，所述CAR-T细胞中的T细胞来自自体T细胞、异体T细胞或iPSC诱导的T细胞。

其中，所述CAR-T细胞疗法包括用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病。

进一步地，所述恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***和***癌中的一种或多种，但不限于此。

进一步地，所述自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、溃疡性结肠炎和桥本甲状腺炎中的一种或多种，但不限于此。

本发明实施方式还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和空褐鳞碱类化合物。所述药物组合物用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病，也可以用于预防和/或治疗嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞疗法导致的细胞因子释放综合征(CRS)。

可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体优选为对本发明的空褐鳞碱类化合物是化学惰性的，并且在使用条件下无有害的副作用或毒性。

所述药学上可接受的载体，例如，赋形剂，稳定剂、悬浮剂或稀释剂等，是被本领域的技术人员所周知的，且是公众可获取的。作为示例性的载体可以包括水、生理盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液，一元醇(如乙醇、异丙醇或十六烷醇)，二元醇类(如丙二醇或聚乙二醇)，甘油、缩酮(如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)，醚类(如聚(乙二醇)400)，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂的乙酰化脂肪酸甘油酯，例如肥皂或洗涤剂，助悬剂(例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)，或乳化剂和其它药物辅助剂。所述载体的选择部分取决于所选择的特定空褐鳞碱类化合物，以及用于施用该组合物的特定方法。

所述药物组合物中，所述CAR-T细胞与所述空褐鳞碱类化合物可以单独存在，也可以混合存在。作为药物组合使用时，二者可以同时给予，也可先后给予或以不同的给药方式给予。

例如，所述CAR-T细胞的给药方式为胃肠外给药，例如，静脉注射、动脉注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射或肌内注射。可以将CAR-T细胞溶解或悬浮在适合于胃肠外给药中可接受载体中的溶液，包括等渗无菌的注射水溶液和非水溶液。而空褐鳞碱类化合物的给药方式，包括口服、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔给药、舌下给药、喷雾鼻腔给药等。当所述空褐鳞碱类化合物以静脉注射、皮下注射、肌肉注射等方式给药时，可以将其制成注射制剂。

在本发明一实施方式中，所述CAR-T细胞的给予方式为静脉注射，所述空褐鳞碱类化合物的给予方式为腹腔注射。

在所述空褐鳞碱类化合物与CAR-T细胞联用时，可以将各种不同浓度的空褐鳞碱类化合物与各种不同浓度(或数量)的CAR-T细胞联合使用。例如，所用CAR-T细胞的密度为0.5×10⁶～5×10⁶个细胞/mL。例如为1×10⁶、2×10⁶或0.5×10⁶个细胞/mL。

此外，本发明实施方式还提供了一种治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病的方法，其为向带有恶性靶细胞的试验对象中给予本发明所述的药物组合物。

可以根据具体的试验对象来调节空褐鳞碱类化合物的浓度、CAR-T细胞的浓度(或数量)。其中，所述恶性靶细胞为所述CAR-T细胞所靶向的细胞。例如为上述恶性肿瘤、自身免疫性疾病或艾滋病所对应的细胞。

可选地，所述CAR-T细胞与所述恶性靶细胞的数量比为(2-10)：1。例如为2.5:1、5:1或10:1。

下面以一个具体的例子来说明使用空褐鳞碱类化合物治疗CAR-T细胞免疫疗法在肿瘤治疗中导致的CRS。本发明中采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

具体步骤如下：

1.将新生(0-2天)的SGM3(NSG Tg^{CMV-IL3，CSF2,KITLG}1Eav/MloySzJ)小鼠以亚致死剂量(150cGy)辐照，立即经肝内注射1×10⁵个人脐带血CD34+细胞，制备nHuSGM3人源化小鼠。使用nHuSGM3人源化小鼠T细胞来制备靶向CD19的CAR-T细胞。

2.将成年(6-8周)SGM3(NSG Tg^{CMV-IL3，CSF2,KITLG}1Eav/MloySzJ)小鼠以亚致死剂量(200cGy)辐照，立即经尾静脉注射1×10⁵个人脐带血CD34+细胞，制备HuSGM3人源化成年鼠。

3.4周后，将步骤2中的成年鼠经尾静脉注射2×10⁶个步骤1中由nHuSGM3人源化小鼠制备的靶向CD19的CAR-T细胞。

4.注射CAR-T细胞后，立即每天经腹腔注射空褐鳞碱的盐酸盐15mg/kg或等体积的PBS，连续给药3天。

5.注射CAR-T细胞后，每天称量小鼠体重，测量小鼠的体温；每两天取血一次，测量血清中人IL-6、IL-10、TNF-α的含量和小鼠血清淀粉样蛋白A的含量。连续检测以上CRS相关指标21天。

结果发现，与对患有肿瘤的成年鼠仅进行靶向CD19的CAR-T细胞治疗相比，对患有肿瘤的成年鼠同时进行靶向CD19的CAR-T细胞治疗以及空褐鳞碱的盐酸盐，其体温较低，血清中人IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子的含量较低。这表明使用空褐鳞碱类化合物对CAR-T细胞免疫疗法在肿瘤治疗中导致的CRS有显著的治疗效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。