一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其应用

文档序号：1083459 发布日期：2020-10-20 浏览：26次 >En<

阅读说明：本技术 一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其应用 (Detection kit for polymorphism of gene related to individualized medication and application thereof ) 是由廖南清梁浩袁志兵张林峰于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于指导个体化用药相关基因SNP的特异性引物探针组合,所述引物探针组合包括针对rs16960228、rs1801253、rs12750834、rs776746基因SNP的特异性引物探针组合。本发明还提供了包括了所述引物组合的试剂盒及其应用。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种同时检测rs16960228、rs1801253、rs12750834、rs776746四个基因多态性,并能准确区分杂合子与纯合子的方法,并提供了一种用于同时指导美托洛尔、氢氯噻嗪、缬沙坦、氨氯地平的个体化用药相关基因SNP的分型试剂盒及应用,本发明检测耗时短,操作简便,结果精确可靠,适合临床推广应用。(The invention relates to a specific primer probe combination for guiding SNP (Single nucleotide polymorphism) of related genes for personalized medicine, which comprises specific primer probe combinations aiming at SNP of rs16960228, rs1801253, rs12750834 and rs776746 genes. The invention also provides a kit comprising the primer combination and application thereof. The invention has the beneficial effects that: the invention provides a method for simultaneously detecting four gene polymorphisms of rs16960228, rs1801253, rs12750834 and rs776746, and accurately distinguishing heterozygotes and homozygotes, and provides a typing kit for simultaneously guiding related gene SNPs of individualized medication of metoprolol, hydrochlorothiazide, valsartan and amlodipine and application thereof.)

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，具体的涉及一种用于降压药物个体化用药指导的基因多态性检测的引物、探针组合，试剂盒及其应用。

背景技术

高血压作为心脑血管病最重要的危险因素，流行态势严重，其主要并发症如卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病等的致残致死率高，严重消耗医疗和社会资源，给家庭和社会造成沉重负担，已成为我国一项重要的公共卫生问题。

遗传背景是不同个体对于药物反应差异性大的重要影响因素。药物进入人体内，经过吸收、转运、代谢、效应及清除的过程发挥作用，携带不同基因型的患者在药物作用过程中可能呈现反应的程度不同，表现为药物反应性的个体差异。

高血压合理用药指南（第2版）指出，药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险的重要工具。通过检测药物代谢酶和药物靶点基因，可指导临床医生针对特定患者选择合适的降压药物和给药剂量，提高降压药物治疗的有效性和安全性。

目前，降压药物种类多样，大部分临床医生制订治疗方案主要根据患者的年龄、体重、高血压程度、有无并发症等，凭经验试验性地选择药物种类和剂量。药物基因组学的应用将从分子水平和微观层面为用药提供有效的参考。精准的用药指南就是要将个体的基因型考虑在内，量身定制用药方案，避免用药不当，真正做到精准的个性化用药。

蛋白激酶C-α（PRKCA）基因是丝氨酸-苏氨酸特异性蛋白激酶C家族成员，参与细胞生长、分化和凋亡等多种生物学事件，涉及不同细胞信号通路，如血管平滑肌收缩和血管内皮生长因子通路，也是心肌收缩的调节因子。其rs16960228 SNP是氢***降压效果的重要预测因子，AA型高血压患者氢***的降压效果比GG型基因型效果更好。

β1-肾上腺素受体（ADRB1）是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，为G-蛋白偶联型受体，参与人体对血压的调节，其基因的多态性与高血压和抗高血压药物的疗效和安全性密切相关。Arg389Gly（rs1801253）位于细胞内羧基端，影响配体介导的腺苷酸环化酶活性及G蛋白偶联功能，进而影响心率和血压。研究表明，Arg389是高血压的易感基因，基因型为Arg389纯合子的人群更易发展为原发性高血压。Arg389比Gly389强3-4倍的信号转导能力，活力更持久，且对激动剂的反应更敏感，因此Arg389Arg基因型高血压患者可能需要更高剂量的β-阻滞剂才能达到与Arg389Gly或Gly389Gly基因型患者相同的治疗效果。Arg389Arg基因型的患者在接受低剂量的β-阻滞剂比高剂量的增加双倍的死亡风险，而Gly389携带者在接受高剂量或低剂量β-阻滞剂时在死亡风险上无明显差异。

肾素基因(REN) G1051A可能影响肾素的酶活性，从而与原发性高血压有关联性。G/G基因型的血浆肾素活性明显高于A/A和G/A基因型，故G/G基因型可能致相对高的肾素酶活性从而使血压升高，而A/A基因型可能致相对低的肾素酶活性从而使血压降低。

CYP3A5基因（rs776746），属于人类细胞色素P450 酶系，其多态性会使药物在人体中出现不同的血药浓度，从而影响降压疗效。目前已有研究证实CYP3A5 的突变基因型CYP3A5 * 3可产生剪切突变，生成不稳定蛋白质，形成突变纯合子GG型，该基因降低了肝脏及肠中的CYP3A5 的表达，可引起钙拮抗剂的代谢减慢，导致体内血药浓度升高，进而药物的毒性也相应增加。氨氯地平则是主要经CYP3A5 代谢的药物之一。

利用基因检测技术对高血压患者的基因多态性进行解读，根据个体与药物治疗相关基因的遗传多样性制定不同的治疗方案，实现药物治疗个体化具有重要的临床意义。根据检测的结果选择合适的降压药物，调整患者的用药剂量，既可以使药物发挥最佳的疗效，最大限度地防止毒副反应的发生，也可以避免药物的资源浪费。

目前市场上的基因检测多采用传统基因多态性检测方法，如酶切，限制性片段长度多态性分析（restriction fragment lengt hpolymorphism，RFLP），变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC），直接测序等。这些传统方法或不能定性，或耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。到目前为止，市场上还没有针对降压药物个体化用药基因快速检测的试剂盒，综上，开发一种快速，高效、精确的用于指导降压药物安全用药的基因检测试剂盒，具有重大的临床意义及社会意义。

发明内容

本发明提供了一种同时检测PRKCA（rs16960228）、ADRB1（rs1801253）、REN（rs12750834）、CYP3A5（rs776746）位点基因多态性的引物对和探针对，具体序列如下：

PRKCA基因rs16960228位点：

PRKCA-F 5’-3’：AGCTGTGGGCTGGATTCTGT

PRKCA-R 5’-3’：ATGCTGGTCACTCTCCTCTTTCTG

PRKCA-A 5’-3’：TAAGGTCACACATAAAG

PRKCA-G 5’-3’：TAAGGTCACACGTAAAG

ADRB1基因rs1801253位点：

ADRB1-F 5’-3’：AGCCCCGACTTCCGCA

ADRB1-R 5’-3’：GTCTCCGTGGGTCGCGT

ADRB1-G 5’-3’：CCTTCCAGGGACTG

ADRB1-C 5’-3’：CCTTCCAGCGACTG

REN基因rs12750834位点：

REN-F 5’-3’： GAATGCCTCCCAAGATTGATG

REN-R 5’-3’： CCTTAGAACACCAAAGCAGGCTTA

REN-T 5’-3’： CTGTAAGTGCCCTCAG

REN-C 5’-3’： CTGTAAGTGCCCCCAGA

CYP3A5基因rs776746位点：

CYP3A5-F 5’-3’： GATGAAGGGTAATGTGGTCCAAA

CYP3A5-R 5’-3’： TGCTCTACTGTCATTTCTAACCATAATCT

CYP3A5-C 5’-3’： AGGGAAGAGATACTG

CYP3A5-T 5’-3’： AAGAGATATTGAAAGACA。

本发明提供了一种同时检测rs16960228、rs1801253、rs12750834、rs776746 基因多态性的试剂盒，该试剂盒组成如下表：

本发明所述试剂盒中PCR混合液引物对的浓度为 0.20μM；探针对的浓度为 0.12μM。

本发明所述试剂盒采用多重PCR-荧光探针法，用于PCR扩增反应体系为：36.5μlPCR混合液、0.5 μl的DNA聚合酶、3μl模板DNA，总体积40μl。扩增程序为：95℃，5分钟，1个循环；95℃，45秒钟，58℃，1分钟，40个循环；38℃，5 秒钟，1个循环。

本发明的有益效果：本试剂盒采用多重PCR-荧光探针法，实现在全封闭反应体系中进行核酸扩增与检测，相对于金标法测序法和分子杂交法大幅度减少了检测时间，操作简便，灵敏度高，特异性高。本试剂盒同时检测rs16960228（G>A）、rs1801253（G>C）、rs12750834（G>A）、rs776746（G>A）四个基因多态性，并设计了野生型等位基因作为对照点，可一次检测明确杂合或纯合基因型，指导相关基因的个体化用药，尤其是美托洛尔、氢***、缬沙坦、氨氯地平的个体化用药，保障用药安全。

附图说明

图1为实施例1 PRKCA基因rs16960228位点检测阳性对照品结果图。

图2为实施例1 PRKCA基因rs16960228位点检测阴性对照品结果图。

图3为实施例1 PRKCA基因rs16960228位点检测待测样本结果图。

图4为实施例1 ADRB1基因rs1801253位点检测阳性对照品结果图。

图5为实施例1 ADRB1基因rs1801253位点检测阴性对照品结果图。

图6为实施例1 ADRB1基因rs1801253位点检测待测样本结果图。

图7为实施例1 REN基因rs12750834位点检测阳性对照品结果图。

图8为实施例1 REN基因rs12750834位点检测阴性对照品结果图。

图9为实施例1 REN基因rs12750834位点检测待测样本结果图。

图10为实施例1 ApoA5基因rs662799位点检测阳性对照品结果图。

图11为实施例1 ApoA5基因rs662799位点检测阴性对照品结果图。

图12为实施例1 ApoA5基因rs662799位点检测待测样本结果图。

具体实施方式

以下实施例仅用于进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明所述检测方法及流程，而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在本发明基础上作的任何改动或修改都属于本发明所限定的范围内。

实施例1

1.待测样本DNA提取

采集1例外周静脉血样（EDTA抗凝），样本取血液200 μl，采用天根血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取，具体操作步骤详见试剂盒说明书。

2.基因扩增试剂准备

从试剂盒中取出4管PCR混合液室温下避光解冻，旋涡振荡混匀后，8000rpm离心10s。从试剂盒中取出DNA聚合酶，8000rpm离心10s。按每反应36.5 μl PCR混合液加入0.5 μl的DNA聚合酶的比例混合，每种PCR混合液各配置3反应，共配置12个反应液, 将配制好的扩增试剂充分混匀，8000rpm离心10s，向设定的12个 PCR反应管中分别加入37μl配制好的扩增试剂，做好标记转移到样本处理区。

3.加样

配置的每种PCR反应液各有3管，分别加入3μl的样本DNA、对应的阳性质控品和对应的阴性质控品（去离子水）。

4.PCR扩增

ABI7500实时荧光定量PCR仪，设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光；PassiveReference选择none。

荧光检测通道的设定

荧光PCR仪上设定如下程序：

扩增程序的设定

5.结果分析

①所有阳性质控品CT值均<35，在控。

②所有阴性质控品CT值均>39或undetermined，在控。

③待测样本的结果如下表：

反应通道

rs16960228G

rs16960228A

rs1801253G

rs1801253C

rs12750834G

rs12750834A

rs776746G

rs776746A

CT值

26.91

undetermined

10.23

12.17

14.23

16.87

13.82

undetermined

结果分析：待测样本的基因型为rs16960228GG纯合，rs1801253GC杂合，rs12750834GA杂合，rs776746GG纯合。

用药建议：

1.rs16960228GG纯合基因型患者与AA或AG基因型患者相比，GG基因型的高血压患者使用氢***可降低舒张压。

2. rs1801253GC杂合基因型的患者与CC基因型携带者相比，对美托洛尔的反应可能较弱。

3. rs12750834GA杂合基因型的患者，对缬沙坦的反应相比GG较弱。

4. rs776746GG纯合基因型的患者，与AA或AG基因型患者相比代谢氨氯地平的能力可能会增加，药物剂量适当增加。

序列表

<110> 广西医大睿谷医学检验有限公司

<120> 一种个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA