阅读说明：本技术 一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用 (Biomarker for detecting diabetic retinopathy, detection kit and application ) 是由 颜标 李秀苗 蒋沁 朱君雅 孙亚男 姚进 姚牧笛 钟宇玲 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学检测技术领域,尤其涉及一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用。本发明利用实时荧光定量PCR技术,通过检测血清中LncRNA AQP4-AS1的相对含量,为糖尿病视网膜病变提供了新的检测标记物和预后评估方法,本发明提供的试剂盒具有创伤性小和操作简单等特点。(The invention belongs to the technical field of biomedical detection, and particularly relates to a biomarker for detecting diabetic retinopathy, a detection kit and application. The invention provides a novel detection marker and a prognosis evaluation method for diabetic retinopathy by detecting the relative content of LncRNA AQP4-AS1 in serum by utilizing a real-time fluorescent quantitative PCR technology, and the kit provided by the invention has the characteristics of small wound, simple operation and the like.)

一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用。

背景技术

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的并发症之一，也是主要的致盲性眼病之一，其发病率逐年增长，现已成为全球公共卫生问题和社会经济负担。DR发病早期即出现视网膜血管损伤，表现为血视网膜屏障破坏、血管通透性增加、内皮细胞增生、周细胞丢失、基底膜增厚和新生血管的形成。病程后期可出现玻璃体积血、黄斑缺血水肿、视网膜脱离等并发症，从而造成视功能严重受损。

目前，糖尿病视网膜病变的治疗方式主要是激光、药物和手术三大类。激光治疗包括全视网膜光凝、局部光凝和格栅光凝。局部药物干预手段包括糖皮质激素治疗和玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子；手术治疗主要为玻璃体切割法。然而，目前这些方法都无法从根本上解决微血管无灌注和缺血缺氧等问题，并且具有治疗的局限性和副作用。因此，针对糖尿病视网膜病变的诊断和干预，找到灵敏且应用方便的检测标记物，具有十分重要的临床意义。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200nt的RNA分子，可以在多种层面调控基因的表达，如表观遗传调控、转录调控和转录后调控。LncRNA参与基因组印记、染色体修饰、转录激活、转录干扰和核内转运等多种重要的生理过程。已有大量研究证明，LncRNAs在人类多种疾病中发挥重要的调控作用，包括眼科疾病、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等。鉴于IncRNA的特征和疾病相关性，其有望成为诊断的标志物和预后评估的标记。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用，公开了LncRNA AQP4-AS1在正常人和糖尿病视网膜病变患者血清中的表达情况，包括实时荧光定量PCR检测LncRNA AQP4-AS1的方法，为糖尿病视网膜病变的诊断和预后评估提供了生物学基础，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种基于实时荧光定量PCR技术检测糖尿病视网膜病变的生物标记物，所述标记物为LncRNA AQP4-AS1，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述标记物的检测引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

一种糖尿病视网膜病变实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2×(包括Ex Taq酶，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，TB Green)100μL，AQP4-AS1特异性的qRT-PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管，AQP4-AS1特异性的qRT-PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管，GAPDH定量PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管，GAPDH定量PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管。

进一步地，所述AQP4-AS1特异性的qRT-PCR上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ ID NO:5所示；GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。RNA反转录随机引物为GAPDH定量PCR引物序列。

进一步地，所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random 6mers)，1管，浓度：50μM，50μL/管，反转录酶(200U/μL)50μL，dNTP Mixture(10mM each)50μL，反转录buffer 50μL。

具体为：5×PrimeScript^TM Buffer，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I、Oligo dTPrimer(50μM)、Random 6mers(100μM)，RNase free ddH₂O。

进一步地，所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizolreagent，1管，2000μL/管；氯仿，1管，500μL/管；无水乙醇，1管，8000μL/管；DEPC ddH₂O，1管，1000μL/管；ddH₂O，1管，2000μL/管；异丙醇，8000μL/管。

如上述的生物标记物在制备糖尿病视网膜病变诊断试剂中的应用。特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测糖尿病视网膜病变诊断试剂中的应用。

如上述的生物标记物在制备糖尿病视网膜病变治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行糖尿病视网膜病变治疗后的预后评估试剂中的应用。

正常病人的ΔCt范围：4.2-6.1。若待测样本的ΔCt在正常人的ΔCt范围内，或者大于该ΔCt范围，认为待测样本为阴性病人；若ΔCt小于该ΔCt范围，认为其为阳性病人。

本发明确定了LncRNA AQP4-AS1表达量的改变，与糖尿病性视网膜病变的发生存在显著的相关性。最后选用LncRNA AQP4-AS1作为糖尿病视网膜病变诊断的生物标记物。包括如下步骤：

第一步：样本准备：收集增殖性糖尿病视网膜病变患者的血清标本和正常人血清标本，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点LncRNA AQP4-AS1在糖尿病视网膜病变患者以及正常人血清中的表达差异。

本发明的另一目的在于分析AQP4-AS1作为糖尿病视网膜病变的预后效果评估的可行性。实验步骤包括：

第一步：样本准备：收集增殖性糖尿病视网膜病变患者治疗前后的血清标本，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点LncRNA AQP4-AS1在糖尿病视网膜病变患者治疗前后血清中的表达差异。

Lnc RNA AQP4-AS1作为水通道蛋白4(AQP4)的反义长链非编码RNA，可以调控AQP4的表达。AQP4-AS1主要表达在视网膜Müller细胞终末端。AQP4-AS1可以通过调节AQP4的表达来调控Müller细胞的功能，继而间接影响内皮细胞和视网膜神经节细胞的功能，在糖尿病视网膜血管和神经病变中发挥重要的作用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用实时荧光定量PCR技术，通过检测血清中LncRNA AQP4-AS1的相对含量，为糖尿病视网膜病变提供了新的检测标记物和预后评估方法，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、创伤性小和操作简单等特点。

本发明证明通过定量PCR技术，检测患者血清中LncRNA AQP4-AS1的表达来实现糖尿病视网膜病变的诊断是完全可行的。

本发明的试剂盒还适用于：根据患者年龄、病史以及局部体征初步怀疑为糖尿病视网膜病变的患者。

用本发明的试剂盒分别检测若干已知的糖尿病视网膜病变患者及若干的正常患者血清中LncRNA AQP4-AS1含量，以此作为标准。再用相同的方法测定未知患者血清中LncRNA AQP4-AS1含量，对照上述标准数据，判定是否在相应的数值范围内，作为一种中间数据(无法依据该数据做出直接诊断结论)，再进一步进行并结合其他检测数据对患者情况进行判断。

本发明的试剂盒是首次利用定量PCR方法，通过检测血清中LncRNA AQP4-AS1含量，以辅助糖尿病视网膜病变的诊断和预后评估，具有创伤性小和操作性强的特点，使得LncRNA AQP4-AS1成为生物标记物，有助于对糖尿病视网膜病变发生和患者的预后进行科学地判断。

附图说明

图1是实施例1糖尿病视网膜病变患者血清中定量PCR检测结果；横坐标代表不同患者血清标本，纵坐标代表LncRNA AQP4-AS1的表达水平；

图2是实施例2糖尿病视网膜病变治疗前后，血清标本的定量PCR检测结果，横坐标代表糖尿病视网膜病变血清标本，纵坐标代表LncRNA AQP4-AS1的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用，具体如下各实施例所示。本发明中的RNA提取及逆转录等过程可参照市场购买的试剂盒操作。

实施例1 LncRNA AQP4-AS1在糖尿病视网膜病变诊断中的应用

血样本及处理：收集200例糖尿病视网膜病变患者的血清标本和200例正常人的血清匹配作为对照。总RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

实验过程：

步骤一、获得待检血液样本

样本为糖尿病视网膜病变患者和非糖尿病病人的加促凝剂的血液样本。

步骤二、从待检血液样本中提取RNA

a)血清样本或冷冻血清取0.25ml样本移至离心管中，加1ml Trizol，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。

b)加入氯仿(样品液+TRIzol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖，剧烈振荡15sec，室温静置5min；

c)4℃离心，12,000g×15min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；

d)向上清液中加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

e)4℃离心，12,000g×10min，一般在离心后，试管底部会出现沉淀，弃上清。

f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

g)加入1ml无水乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

h)室温晾干加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10-15min)，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀。

i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

步骤三、将获得的RNA逆转录成cDNA

采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，将逆转录反应体系按照试剂盒提供的体系(25μL)配置如下：5×PrimeScript^TM Buffer 4μL，PrimeScript^TM RT EnzymeMix I 1μL、Oligo dT Primer(50μM)1μL、Random 6mers(100μM)4μL，total RNA 2μL，RNasefree ddH₂O 13μL。按如下程序反转为cDNA：37℃15min，85℃，5sec，得到的cDNA于-20℃中保存。

步骤四、实时荧光定量PCR

PCR反应体系(50μL)，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq，按照说明书提供的体系配置如下：SYBR Premix Ex Taq 25μL，特异性的qRT-PCR的上游引物和下游引物各1μL(特异性识别AQP4-AS1或GAPDH)，待测样品cDNA 2μL，RNase free ddH₂O补足至50μL。

PCR条件：

92℃5min，(92℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec，40个循环)，72℃，5min。

引物序列：AQP4-AS1特异性的上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ IDNO:5所示；GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

五、数据分析

对同一样本分别进行目标RNA和内参RNA实时荧光定量PCR检测，以内参的表达量为基准，对目标RNA进行归一化处理，随后对目标RNA的相对表达量采用本领域通用的ΔCt法分析：将所有血清样本的目的基因AQP4-AS1的Ct值减去自身内参基因GAPDH的Ct值，得到所有血清样本的Delta Ct值(ΔCt)，公式表达为ΔCt＝Ct(目的基因AQP4-AS1)-Ct(内参基因GAPDH)。实验重复三次，对结果进行统计分析，通过比较糖尿病视网膜病变患者的血清样本和正常人的血清样本中的AQP4-AS1的表达差异，判断待测病人的疾病易感性。

六、结果判断

通过实时荧光定量PCR的方法检测靶点AQP4-AS1的表达水平并得出正常人的ΔCt范围：4.2-6.1，见表1。比较待测样本的ΔCt，分析糖尿病视网膜病变患者和正常人的组间差异。进一步分析各个样本数值是否在正常人的范围内，若待测样本的ΔCt在正常人的ΔCt范围内，或者小于该ΔCt范围，认为待测样本为糖尿病视网膜病变阴性；若ΔCt大于该ΔCt范围，认为其为糖尿病视网膜病变阳性。结果如图1所示。图1为实时荧光定量PCR分析LncRNA AQP4-AS1在糖尿病视网膜病变患者和正常人血清中的表达差异(各从200例中选取的50例典型病例)，结果表明AQP4-AS1在糖尿病视网膜病变患者血清中表达明显上调。

表1：各组样本ΔCt范围

	PDR	正常人
			AQP4-AS1 Ct均数-GAPDH Ct均数	15.6-33.5	4.2-6.1

根据上述结果，分别收取经临床影像学诊断确诊的200例糖尿病视网膜病变和200例非糖尿病视网膜病变患者血清样本，进行AQP4-AS1血清含量分析。评价基于检测AQP4-AS1血清含量的准确度和灵敏度，结果如表2所示，血清样本准确度为87.8％，灵敏度为91.5％。表明LncRNA-AQP4-AS1可作为糖尿病视网膜病变诊断的生物学标记物用于糖尿病视网膜病变的诊断。

表2：LncRNA-AQP4-AS1作为生物标记物进行糖尿病视网膜病变诊断的结果

实施例2 LncRNA AQP4-AS1作为预后评估标记的可行性应用

步骤一、获得待检血液样本

收集抗新生血管治疗前后的200例糖尿病视网膜病变患者的血清。

步骤二、从待检血液样本中提取RNA

a)血清样本或冷冻血清取0.25ml样本移至离心管中，加1ml Trizol，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。

b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖，剧烈振荡15sec，室温静置5min；

c)4℃离心，12,000g×15min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；

d)向上清液中加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

e)4℃离心，12,000g×10min，一般在离心后，试管底部会出现沉淀，弃上清；

f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

g)加入1ml无水乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

h)室温晾干加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10-15min)，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀。

i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

步骤三、将获得的RNA逆转录成cDNA，采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagentKit，按照试剂盒提供的体系(25μL)配置如下：5×PrimeScript^TM Buffer 4μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer(50μM)1μL、Random 6mers(100μM)4μL，total RNA2μL，RNase free ddH₂O 13μL。按下面程序反转为cDNA：37℃15min，85℃5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

步骤四、实时荧光定量PCR

PCR反应体系(50μL)，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq，按照说明书提供的体系配置如下：SYBR Premix Ex Taq 25μL，特异性的qRT-PCR的上游引物和下游引物各1μL(特异性识别AQP4-AS1或GAPDH)，待测样品cDNA 2μL，RNase free ddH₂O补足至50μL。

PCR条件：

92℃，5min，92℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec，40个循环，72℃，5min。

五、数据分析

基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数，其中参照基因选择GAPDH；分别确定糖尿病视网膜病变患者治疗前后的ΔCt范围。

六、结果判断

计算出待测样本的ΔCt，分析其在抗新生血管治疗前后的变化情况。结果如图2所示：收集抗新生血管治疗前后的糖尿病性视网膜病变患者的血清；采用Trizol试剂提取总RNA，通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA；通过实时荧光定量PCR的方法检测靶点LncRNA AQP4-AS1的表达水平(如图2所示)。图2为实时荧光定量PCR分析LncRNA AQP4-AS1在抗新生血管治疗前后糖尿病视网膜病变患者血清中的表达差异(各从200例中选取的50例典型病例)，结果表明AQP4-AS1在接受抗新生血管治疗后的糖尿病视网膜病变患者血清中表达明显下调，说明AQP4-AS1有望成为评估抗新生血管治疗疗效及预后情况的靶标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院

<120> 一种糖尿病视网膜病变检测生物标记物、检测试剂盒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2392

<212> DNA

<213> LncRNA AQP4-AS1

<400> 1

actttctagc tgaacactca gcttcatcca ctccaggaca gctgagcgtc tggatggtgt 60

ctcaccctgt tgcccaggct ggaatacagt ggcacgatcc tggctcactg caatctccat 120

ctcccgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctctcaag tagctgggat tacagggctt 180

cagaagctga tggcatagtt atgagagggg tgaagactgc gactgcattt ccaacagacc 240

ctgaggacaa ttgggaagaa tgcgctgaat atttttgagc aatttctata tgataagcag 300

tttttagggc aagtataggt tgcactgatc ctgacctttt ggcctgagga tggaagtctt 360

cagtatctgt acaactttac tcccaagagc tggtgtagaa tgagttcctc tggccatggg 420

aggatcgcag aggggcacct gccaccagca gcccagcctc agcacttttc tcttcagcgt 480

cttcttcaag gtatttccag ttgcccgccc tgaactgttt cagaatgagg aggacacctg 540

gaggaatcta cacgtgcata gaccaatttg caaaagaacc tgtgagccaa cattattacc 600

tcagctggaa gaattaataa gcaacacgtt cacccaagaa gtatttactg agcacctact 660

atgtgcatta ttttctggtg ttggggctag ggggcaaacg actctgacaa gtctctgttc 720

tcaaggctgg agtgcagcgg cgcgatctcg gctcactgca agctccgcct cccgggttca 780

cgccattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta caggcgcccg caaccacgcc 840

cggctaattt tttgtatttt tagtagagat ggggtttcac catgttagtc aggatggtct 900

cgatttcctg accttgtgat ccgcccgccc ccgcctccca aagtgctggg attacaggcg 960

tgagccaccg cgcccggccg tagtttacat tttctaaagc gtactctgcc agccaagtgg 1020

caaacagact tgggcctctt aagagtggaa gcaggaggaa acccgaagat cctggagaga 1080

gactggtggc tggtaccagt ggagagggag caaaaaggaa aatacaggat acaatttcag 1140

gaaaaatttc ataccaattt cctgaggtaa tttctgaact cgaacatttt cagtgtcacc 1200

acattgtgtt tcctgctgaa tcaagtctac atcacttcgg tttttaaagc cttccacgat 1260

ccttccctga acactgtagt tttcactgat ggttggctgt ttcaaactcc catatgatcc 1320

atactgtatc attaataagc aagcaaggaa taacacaccc tctgctattc tgtgcagtgt 1380

ttcaggtttt tagttttctc tttcaagata gaaaatccct ttagagtagg aactcggctg 1440

gcactttctt tcacatcctg catagcactt agcaaagttc tgtacacagg gcacatgtgg 1500

aaattgctta ttgattgatt aaaagcatat atcactggca tttgtatctt cagtatttct 1560

cttgtatgaa gaagggtgat tatctgtcaa tattcattgc atcattgaac caatgtacaa 1620

tgcattaatc atcactgaag ataaccagat gaggctttat tgtaatctcc ttctattttg 1680

ctgagataat ttcacttgct ttagagttta tgaggccata agtggctccc atctgttgat 1740

gaacatattt ctaagagtca tttagtctca agtatggaat acttgagggg aagttaaatt 1800

gtaactttta tattaagtgt catcttagta acagaaccaa aattggaagc atgtgttcaa 1860

ttttggtttt tcattttcaa agctttaggt caggcaaaga attaatttca tttgtttaca 1920

aagtagatta tgcctaataa aatctatttt gtttatggtc acattttaat caatccactg 1980

ctttagaaaa tgagagaatt ctgattggct aatcattcaa catagtaaat tacattattc 2040

cacatccaca gaacactggc ctaattgcat tatccagtaa tgataaaaat attcctttta 2100

atacattttg agcaaggcat ataccagtga tgaaacaggg aagaatcttg tttattccat 2160

ccttgtttga tgatcgacca cagaatataa cataacactt ctgtgtataa gaattttttc 2220

aacattaagg ataataagga caaggtagtt ttcactggat ccttactggt actctgaatt 2280

ttcactattt gtccgcattt cttctccttc ccggaaattt gttttctgcg aaaaacaagt 2340

gctactttgt caaataaagc ttaaataaaa ttggtttcaa tttatgcata at 2392

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagacgggcg gagagaaacc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaggggtct acatggcaac t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactcagctt catccactcc ag 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcccaattg tcctcagggt c 21