阅读说明：本技术 一种山楂原花青素-枣多糖组合物及其制备方法 (Hawthorn procyanidine-jujube polysaccharide composition and preparation method thereof ) 是由 赵文 王颉 周茜 韩雪 白冰瑶 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种山楂原花青素-枣多糖组合物及其制备方法,属于医药和食品技术领域,所述山楂原花青素-枣多糖组合物包括如下重量份的组分：21.82～22.02份表儿茶素、13.02～13.22份原花青素B2、1.30～1.50份原花青素B5、3.46～3.66份原花青素C1和59.9～60.1份枣多糖。本发明经实验结果表明,该组合物可以协同增效显著改善高脂膳食大鼠的血脂、血糖和炎症因子水平,同时还可以提高高脂膳食大鼠的肠道菌群多样性,提高拟杆菌门以及与肥胖有关的菌(如Akkermansia)的丰度,减少厚壁菌门的丰度。(The invention provides a hawthorn procyanidine-jujube polysaccharide composition and a preparation method thereof, belonging to the technical field of medicines and foods, wherein the hawthorn procyanidine-jujube polysaccharide composition comprises the following components in parts by weight: 21.82-22.02 parts of epicatechin, 13.02-13.22 parts of procyanidine B2, 1.30-1.50 parts of procyanidine B5, 3.46-3.66 parts of procyanidine C1 and 59.9-60.1 parts of jujube polysaccharide. The experimental results show that the composition can be used for synergistically and obviously improving the blood fat, blood sugar and inflammatory factor levels of rats with high fat diet, simultaneously improving the diversity of intestinal flora of the rats with high fat diet, improving the abundance of bacteroidetes and obesity-related bacteria (such as Akkermansia) and reducing the abundance of firmicutes.)

一种山楂原花青素-枣多糖组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药和食品技术领域，尤其涉及一种山楂原花青素-枣多糖组合物及其制备方法。

背景技术

近年我国居民由于长期高脂膳食引起的脂质代谢异常、胰岛素抵抗和慢性低度系统性炎症，都已被公认为是一个严重威胁国民健康的巨大挑战。而肠道菌群除了参与机体中食物消化、肠神经调控和上皮内稳态等重要的生理过程外，近年来也被证明是机体中的一个连接食源性代谢的变化和相关的慢性疾病的媒介。越来越多的研究表明，肠道菌群的失衡，特别是其丰富度和多样性的减少，通常会导致代谢性疾病(如肥胖、糖尿病等)。因此，肠道菌群被认为是改善高脂膳食导致的脂代谢紊乱的重要环境因子。在治疗方面，与伴随副作用的化学药物治疗相比，膳食补充某些天然食物成分的方法可以更安全有效的改善慢性病情况，也更易被人们接受。

山楂和枣是我国特有的药食两用植物资源，产量高，但相关产业链短，高值化加工关键技术落后、产品附加值低。因此，深入挖掘山楂和枣的药食两用功能，开发具有预防改善慢性疾病的营养功能食品，是现阶段急需解决的问题，同时也符合国家《健康中国2030规划纲要》政策导向。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山楂原花青素-枣多糖组合物及其制备方法，本发明提供的组合物可以协同增效显著改善高脂膳食大鼠的血脂、血糖和炎症因子水平，同时还可以提高高脂膳食大鼠的肠道菌群多样性，提高拟杆菌门以及与肥胖有关的菌(如Akkermansia)的丰度，减少厚壁菌门的丰度。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种山楂原花青素-枣多糖组合物，包括如下重量份的组分：21.82～22.02份表儿茶素、13.02～13.22份原花青素B2、1.30～1.50份原花青素B5、3.46～3.66份原花青素C1和59.9～60.1份枣多糖。

优选的，包括如下重量份的组分：21.92份表儿茶素、13.12份原花青素B2、1.40份原花青素B5、3.56份原花青素C1和60份枣多糖。

在本发明中，所述枣多糖的制备方法优选包括如下步骤：

(1)将枣与水混合，得到混合物，将所述混合物与纤维素酶混合，得到待提取物，将所述待提取物在50～60℃下水浴提取5～8h，得到提取物，将所述提取物在3500～4500rpm下离心8～12min，得到上层清液；

(2)将所述步骤(1)得到的上层清液进行醇沉，得到第一沉淀物；

(3)将所述步骤(2)得到的第一沉淀物与sevage试剂混合，振荡10～20min，再3500～4500rpm离心4～6min，得到上层水相；

(4)将所述步骤(3)得到的上层水相进行醇沉1～3d，固液分离，得到溶液，将所述溶液在3500～4500rpm下离心8～12min，得到第二沉淀物；

(5)将所述步骤(4)得到的第二沉淀物进行透析，透析2～3天，然后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得枣多糖。

优选的，步骤(1)所述枣的质量与水的体积比为1g:10～15ml，所述待提取物中纤维素酶的质量百分含量为0.2～0.4％。

优选的，步骤(2)所述醇沉条件包括：所述醇沉使用的醇溶液与上层清液的体积比为3～5:1，所述醇溶液的质量百分比为80～98％，所述醇沉的温度为3～5℃。

优选的，步骤(3)所述第一沉淀物的质量与sevage试剂的体积比为1g:1-3ml。

优选的，步骤(4)所述醇沉条件包括：所述醇沉使用的醇溶液与上层水相的体积比为2～4:1，所述醇溶液的质量百分比为80～98％，所述醇沉的温度为3～5℃。

优选的，步骤(5)所述的透析袋为纤维素透析袋，截流分子量为7000D。

本发明提供了上述技术方案所述的山楂原花青素-枣多糖组合物在制备改善肠道菌群紊乱的药物中的应用。

优选的，所述肠道菌群紊乱为高脂膳食导致的肠道菌群紊乱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过动物试验和宏基因组技术分析结果表明，制备的组合物可协同增效显著改善高脂膳食大鼠的血脂、血糖和炎症因子水平，达到降低大鼠血脂、血糖和消除炎症的目的，同时还可以提高高脂膳食大鼠的肠道菌群多样性，提高拟杆菌门以及与肥胖有关的菌(如Akkermansia)的丰度，减少厚壁菌门的丰度，达到了改善高脂膳食导致肠道菌群紊乱的目的。

在本发明中首次将表儿茶素、原花青素B2、原花青素B5、原花青素C1和枣多糖按特定重量份组合制备成组合物，经特定重量份的各组分协同作用，在丰富各组分活性功能的同时，达到了改善高脂膳食导致肠道菌群紊乱的目的。

附图说明

图1为山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食大鼠肠道菌群α-多样性的改善情况；

图2为山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食大鼠肠道菌群β-多样性的改善情况；

图3为山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食大鼠肠道菌群组成(门水平、属水平)及F/B值的改善情况。

具体实施方式

本发明提供了一种山楂原花青素-枣多糖组合物，包括如下重量份的组分：21.82～22.02份表儿茶素、13.02～13.22份原花青素B2、1.30～1.50份原花青素B5、3.46～3.66份原花青素C1和59.9～60.1份枣多糖；优选包括：21.92份表儿茶素、13.12份原花青素B2、1.40份原花青素B5、3.56份原花青素C1和60份枣多糖。本发明对所述表儿茶碱、原花青素B2、原花青素B5、原花青素C1的来源没有特殊限定，采用常规市售或常规制备方法获得即可。在本发明中，所述组合物经特定量各组分的协同作用，可显著改善高脂膳食大鼠的血脂、血糖和炎症因子水平，同时还可以提高高脂膳食大鼠的肠道菌群多样性，提高拟杆菌门以及与肥胖有关的菌(如Akkermansia)的丰度，减少厚壁菌门的丰度，达到了改善高脂膳食导致肠道菌群紊乱的目的。

在本发明中，所述枣多糖的制备方法优选包括如下步骤：

(1)将枣与水混合，得到混合物，将所述混合物与纤维素酶混合，得到待提取物，将所述待提取物在50～60℃下水浴提取5～8h，得到提取物，将所述提取物在3500～4500rpm下离心8～12min，得到上层清液；

(2)将所述步骤(1)得到的上层清液进行醇沉，得到第一沉淀物；

(3)将所述步骤(2)得到的第一沉淀物与sevage试剂混合，振荡10～20min，再3500～4500rpm离心4～6min，得到上层水相；

(4)将所述步骤(3)得到的上层水相进行醇沉1～3d，固液分离，得到溶液，将所述溶液在3500～4500rpm下离心8～12min，得到第二沉淀物；

(5)将所述步骤(4)得到的第二沉淀物进行透析，透析2～3天，然后将透析袋内的溶液冷冻干燥，得枣多糖。

在本发明中，所述枣的质量与水的体积比优选为1g:10～15ml，更优选为1g:10ml，所述待提取物中纤维素酶的质量百分含量优选为0.2～0.4％，更优选为0.3％，所述待提取物的提取温度优选为50～60℃，更优选为55℃。在本发明中，所述枣与水的适宜体积比可提高枣多糖的提取率和含量，更有利于枣多糖的后续利用，同时还可减少水资源的浪费；所述纤维素酶可以将枣中的纤维素分解成多糖或单糖，适宜用量的纤维素酶可提高枣多糖的提取率；所述待提取物的提取温度升高会提高提取效率，但杂质含量较高，适宜的提取温度可提高枣多糖的纯度和提取率。

在本发明中，所述步骤(2)醇沉条件优选包括：所述醇沉使用的醇溶液与上层清液的体积比为3～5:1，所述醇溶液的质量百分比为80～98％，所述醇沉的温度为3～5℃，更优选包括：所述醇沉使用的醇溶液与上层清液的体积比为4:1，所述醇溶液的质量百分比为95％，所述醇沉的温度为4℃。

在本发明中，所述第一沉淀物的质量与sevage试剂的体积比优选为1g:1～3ml，更优选为1g:1ml，所述震荡优选为摇床剧烈震荡。在本发明中，所述sevage试剂可使第一沉淀物中的蛋白变性，除去第一沉淀物中的蛋白质，可提高最终产物枣多糖的纯度。

在本发明中，所述步骤(4)醇沉条件优选包括：所述醇沉使用的醇溶液与上层水相的体积比为2～4:1，所述醇溶液的质量百分比为80～98％，所述醇沉的温度为3～5℃，更优选包括：所述醇沉使用的醇溶液与上层水相的体积比为3:1，所述醇溶液的质量百分比为95％，所述醇沉的温度为4℃，

在本发明中，所述透析袋优选为纤维素透析袋，截流分子量优选为7000D。在本发明中，所述透析可除去第二沉淀物中的盐，提高枣多糖的纯度。

本发明还提供了上述技术方案所述的山楂原花青素-枣多糖组合物在制备改善肠道菌群紊乱的药物中的应用。在本发明中，所述肠道菌群紊乱优选为高脂膳食导致的肠道菌群紊乱。在本发明中，所述肠道菌群包括疣微菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门中的一种或两种以上。在本发明中，所述肠道菌群还包括艾克曼菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属、布劳特氏菌属、毛螺菌属、颤螺旋菌属、消化链球菌属、埃希氏菌属中的一种或两种以上。

在本发明中，所述表儿茶素、原花青素B2、原花青素B5和原花青素C1的制备方法优选包括如下步骤：

(1)将山楂与乙醇溶液混合，在60～90℃条件下提取120-150min，得到乙醇提取液；

(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液冷却至室温后，用乙酸乙酯对乙醇提取液进行萃取，得到上层萃取液；

(3)采用大孔树脂AB-8对步骤(2)得到的上层萃取液进行纯化，收集山楂原花青素解析液；

(4)将步骤(3)得到的山楂原花青素解析液进行旋转蒸发浓缩、冻干，得山楂原花青素；

(5)将步骤(4)得到的山楂原花青素溶于0.5～2ml的甲醇中，过滤，得样液，注入制备型高效液相色谱仪，分离得到表儿茶素、原花青素B2、原花青素B5和原花青素C1。

在本发明中，所述山楂的质量与乙醇溶液的体积比优选为1g:15～30mL，更优选为1g:25mL，所述乙醇溶液的质量百分比为50～80％，更优选为70％。在本发明中，所述山楂与乙醇溶液的适宜比例以及乙醇溶液的浓度可提高山楂原花青素的提取率和含量。

在本发明中，所述乙酸乙酯对乙醇提取液进行萃取的条件优选包括：萃取时间为20～30min，乙酸乙酯：乙醇提取液体积比为1～2:1，萃取3～5次；更优选的包括：萃取时间为25min，乙酸乙酯：乙醇提取液体积比为1.5:1，萃取4次。

在本发明中，所述大孔树脂AB-8对上层萃取液的纯化条件优选包括：解析液为质量百分比为40～60％的乙醇溶液，解析液pH为4～6，径高比为1:30～50；更优选包括：解析液为质量百分比为50％的乙醇溶液，解析液pH为5，径高比为1:40。

在本发明中，所述制备高效液相色谱仪的色谱条件优选包括：色谱柱为SunFire^TMC18(4.6mm×250mm，5m)，流动相A为0.4％冰乙酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长为280nm，进样量为100mL，流速为16mL/min，按0～10min、5％→15％B，10～15min、15％→35％B，15～20min、35％→50％B，20～30min、50％→80％B，30～65min、80％→30％B，65～75min、30％B，75～80min、30％→10％B，80～85min、10％B进行梯度洗脱，12.675min收集原花青素B2、14.611min收集表儿茶素、20.472min收集原花青素C1、38.032min收集原花青素B5。在本发明中，制备高效液相色谱条件的设定不同，最终分离的各组分不同，经本申请设定的色谱条件可精确的从山楂原花青素提取物中分离出原花青素B2、表儿茶素、原花青素C1、原花青素B5。

在本发明中，所述原花青素B2、表儿茶素、原花青素C1和原花青素B5作为组分结合所述枣多糖按特定用量制备成山楂原黄青素-枣多糖组合物。

山楂原花青素-枣多糖组合物的制备方法：将原花青素B2、表儿茶素、原花青素C1、原花青素B5与枣多糖按比例充分混合均匀，得山楂原花青素-枣多糖组合物。

山楂原花青素-枣多糖组合物的使用方法：将组合物按照大鼠灌胃剂量溶于蒸馏水，得到的溶液进行灌胃。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

山楂原花青素各组分的制备：

(1)山楂果实去籽干燥后制成粉末，将山楂粉末与质量百分比为70％的乙醇混合，质量体积比为1g:25ml，80℃下提取120min，得乙醇提取液

(2)将上述乙醇提取液冷却至室温后，采用乙酸乙酯对其进行萃取，乙酸乙酯：乙醇提取液体积比为1.5:1，萃取25min，萃取4次，收集上层萃取液；

(3)采用大孔树脂AB-8对上层萃取液进行纯化，所用解析液为质量百分比为50％乙醇溶液，所用解析液pH为5，径高比为1:40(cm)，收集山楂原花青素解析液；

(4)将上述山楂原花青素解析液进行旋转蒸发浓缩、冻干，得纯度为81.20％的山楂原花青素类提取物；

(5)通过高效液相色谱仪对山楂原花青素类提取物的各个组份进行定性和定量检测：将100mg山楂原花青素类提取物溶于1.0mL的甲醇，通过0.22μm滤器过滤，得到样液，注入分析型高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为SunFire^TMC18(4.6mm×250mm，5m)，流动相A为0.4％冰乙酸水溶液，流动相B为乙腈，进样量为10μL，流速为1mL/min，检测波长为280nm，柱温为25℃，按0～10min、5％→15％B，10～15min、15％→35％B，15～20min、35％→50％B，20～30min、50％→80％B，30～65min、80％→30％B，65～75min、30％B，75～80min、30％→10％B，80～85min、10％B进行梯度洗脱，测的山楂原花青素的各组分以及含量。结果见表1。

(6)通过制备型高效液相色谱仪对山楂原花青素类提取物各个组份的制备：将得到的100mg山楂原花青素类提取物溶于1.0mL的甲醇，通过0.45μm滤器过滤，得到样液，注入制备型高效液相色谱仪，色谱条件包括：色谱柱为SunFire^TM C18(4.6mm×250mm，5m)，流动相A为0.4％冰乙酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长为280nm，进样量为100μL，流速为16mL/min，按0～10min、5％→15％B，10～15min、15％→35％B，15～20min、35％→50％B，20～30min、50％→80％B，30～65min、80％→30％B，65～75min、30％B，75～80min、30％→10％B，80～85min、10％B进行梯度洗脱，12.675min收集原花青素B2、14.611min收集表儿茶素、20.472min收集原花青素C1、38.032min收集原花青素B5，获得表儿茶素、原花青素B2、原花青素B5、原花青素C1。

表1山楂原花青素提取物中主要组分及含量

实施例2

枣多糖的制备：

(1)枣去核干燥后制成粉末，将枣粉末与蒸馏水质量体积比为1g:10mL混合，再加入质量百分含量为0.3％的纤维素酶(m/v)，于55℃下水浴提取5h，将水浴后的提取溶液在4000r/min下离心10min，得上层清液；

(2)将上述上层清液用4倍体积的95％乙醇溶液在4℃下过夜重新沉淀，得到第一沉淀物。

(3)用sevage试剂除去第一沉淀物中的蛋白，将第一沉淀物与sevage试剂质量体积比为1:1混合，利用摇床剧烈振荡15min，4000r/min下离心5min，多次重复此过程至变性蛋白消失，得上层水相。

(4)用移液枪慢慢吸取出上层水相，加入3倍体积的95％乙醇溶液，4℃下静置2d，然后将乙醇提取溶液取出，4000r/min离心10min，得第二沉淀物。

(5)将第二沉淀物溶解在适当体积的水中，将溶液倒入截留分子量为7000D的纤维素透析袋中，封口，低温环境下透析2d，除去小分子物质，将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到枣多糖。利用苯酚-硫酸法测定枣多糖含量为72.5％。

实施例3

将实施例1制备的山楂原花青素各组分(表儿茶素、原花青素B2、原花青素B5、原花青素C1)以及实施例2制备的枣多糖制备成山楂原花青素-枣多糖组合物，技术方案如下：

山楂原花青素-枣多糖组合物由于如下重量份的组分组成：21.92份表儿茶素、13.12份原花青素B2、1.40份原花青素B5、3.56份原花青素C1和60份枣多糖。

将原花青素B2、表儿茶素、原花青素C1、原花青素B5与枣多糖按上述重量份充分混合均匀，得山楂原花青素-枣多糖组合物。

实施例4

山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食诱导大鼠血脂、血糖和炎症因子的改善情况

取雄性Wistar大鼠60只，5周龄，使大鼠适应新环境一周后，随机分为5组，每组11只，分别为阴性对照组(CON)、高脂模型组(HFD)、实施例1制备的山楂原花青素类提取物组，实施例2制备的枣多糖组，实施例3制备的山楂原花青素-枣多糖组合物组(HPC)。阴性对照组大鼠给予标准饲粮，其余大鼠给予高脂饲粮连续8周。同时，山楂原花青素类提取物组、枣多糖组、山楂原花青素-枣多糖组合物组分别给予山楂原花青素类提取物、枣多糖、山楂原花青素-枣多糖组合物200mg/kg，8周，阴性对照组和高脂模型组均给予等量蒸馏水。

实验结束后，禁食12h，麻醉大鼠，然后浸泡在75％酒精1min消毒。对阴性对照组、高脂模型组、山楂原花青素类提取物组，枣多糖组、山楂原花青素-枣多糖组合物组大鼠静脉采血，3000g离心10min，取血清。采用南京建成生物工程有限公司生化标准试剂盒检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，检测结果见表2；采用上海源叶生物工程有限公司ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)，检测结果见表3。

表2山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食大鼠血脂改善情况

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

表3山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食大鼠炎症因子改善情况

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

处理各组大鼠实验8周后，将各组中大鼠禁食12小时后，剪尾法采集阴性对照组、高脂模型组、山楂原花青素类提取物组、枣多糖组、山楂原花青素-枣多糖组合物组大鼠空腹血样，对所有采血后的大鼠口服2.5g/kg·bw的葡萄糖溶液(40％)，然后分别在0、0.5、1和2h记录血糖，计算糖耐量曲线下面积。采用血糖检测仪(Super glucocard II，Shiga，日本)检测大鼠空腹血糖(禁食12h)和口服葡萄糖耐量。结果见表4。

表4山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食大鼠血糖改善情况

注：与阴性对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01。

由表2-4实验数据结果表明，山楂原花青素-枣多糖组合物可以显著改善高脂膳食大鼠血脂、血糖和炎症因子水平，且山楂原花青素-枣多糖组合物显示了比单个山楂原花青素类提取物或枣多糖具有更好的改善高脂膳食大鼠血脂、血糖的作用，表明山楂原花青素和枣多糖组合后具有更好的协同增效作用，取得了明显的技术效果。

实施例5

山楂原花青素-枣多糖组合物对高脂膳食诱导大鼠肠道菌群的改善情况

取雄性Wistar大鼠60只，5周龄，使大鼠适应新环境一周后，随机分为3组，每组11只，分别为阴性对照组(CON)、高脂模型组(HFD)、实施例3制备的山楂原花青素-枣多糖组合物组(HPC)。阴性对照组大鼠给予标准饲粮，其余大鼠给予高脂饲粮连续8周。同时，山楂原花青素-枣多糖组合物组分别给予山楂原花青素-枣多糖组合物200mg/kg，8周，阴性对照组和高脂模型组均给予等量蒸馏水。造大鼠模型后，处死阴性对照组、高脂模型组、实施例3制备的山楂原花青素-枣多糖组合物组的大鼠，无菌环境下取大鼠盲肠内容物，通过宏基因组分析其内菌群的变化。结果见图1-3。

由图1-3实验分析结果显示，山楂原花青素-枣多糖组合物可以提高高脂膳食大鼠的肠道菌群多样性，使拟杆菌门的丰度提高，厚壁菌门的丰度减少，与肥胖有关的菌丰度也有所提高，如Akkermansia。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。