一种知母皂苷i在制备抗人卵巢癌药物中的应用
阅读说明：本技术 一种知母皂苷i在制备抗人卵巢癌药物中的应用 (Application of timosaponin I in preparation of anti-human ovarian cancer drugs ) 是由 邓斯敏 刘晨 许元 高彬斌 张静怡 俞婷婷 乐珅 程雁 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种知母皂苷I在制备抗人卵巢癌药物中的应用,属于知母皂苷I的医药新用途技术领域,其中知母皂苷I的分子式为C-(39)H-(66)O-(14),化学结构式为：本发明所述的知母皂苷I能够有效抑制人卵巢癌细胞SKOV3中SHH信号通路相关靶基因的mRNA及蛋白GLI1、SUFU的表达,且知母皂苷I可有效抑制SKOV3细胞的增殖、上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)、迁移和侵袭,表明本发明所述的知母皂苷I有望开发为抗人卵巢癌药物的有效成分；此外,该类药物可根据患者的需要制成不同制剂形式,便于患者服用,具有较好的开发应用前景。(The invention provides an application of timosaponin I in preparation of a human ovarian cancer resistant medicament, belonging to the technical field of new medical application of timosaponin I, wherein the molecular formula of timosaponin I is C 39 H 66 O 14 The chemical structural formula is as follows: the timosaponin I can effectively inhibit the expression of mRNA, protein GLI1 and SUFU of SHH signal channel related target genes in human ovarian cancer cells SKOV3, and can effectively inhibit the proliferation, Epithelial-mesenchymal transition (EMT) and mobility of SKOV3 cellsThe invasion indicates that the timosaponin I is expected to be developed into an effective component of an anti-human ovarian cancer medicament; in addition, the medicine can be prepared into different preparation forms according to the requirements of patients, is convenient for the patients to take, and has better development and application prospects.)
技术领域
本发明属于知母皂苷I的医药新用途技术领域，具体涉及知母皂苷I在制备抗人卵巢癌药物中的应用。
背景技术
卵巢癌是40岁以上妇女最常见的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，也是最致命的妇科癌症。2020年调查显示，全世界每年大约有313959例新发卵巢癌病例，207252例死亡病例。由于卵巢位置较为隐匿且缺乏有效的筛查方法，导致绝大多数卵巢癌确诊时已发生转移。目前卵巢癌的治疗模式以减瘤手术及基于铂类药物的化疗为主，卵巢癌患者往往经历手术-化疗-复发-化疗-再复发-再化疗的循环，期间化疗敏感性逐渐降低，复发周期不断缩短。最终，大约80％的患者发展为铂类耐药性卵巢癌，耐药性一旦出现，进一步化疗的反应率明显下降，大约为10％-15％，平均生存率仅为9-12个月。即使是在医疗资源丰富的发达国家，如美国和加拿大，卵巢癌的5年生存率也仅有47％，相比之下，乳腺癌的5年生存率为85％。因此，亟待开发安全有效的治疗药物，以提高卵巢癌的治愈率。
Sonic Hedgehog(SHH)信号通路在胚胎发育到成年阶段扮演着多种重要角色，广泛参与细胞分化、增殖、老化、重塑等生命过程。研究发现，SHH信号通路在多种恶性肿瘤中处于异常激活状态，卵巢癌就是其中一种。在高级别浆液性卵巢癌中，异常激活的SHH通路可能在维持肿瘤干细胞完整性方面发挥重要作用。此外，应用SHH通路抑制剂——环巴胺处理卵巢癌细胞，可显著下调SHH通路重要靶基因GLI1的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡。目前，针对SHH信号通路，已报道出许多卵巢癌治疗策略以及一些小分子药物，如TRIM16、二氢青蒿素等，均能有效抑制卵巢癌细胞的增殖、上皮-间充质转化、迁移及侵袭等恶性生物学行为。
知母是一种传统中药，其提取物众多，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗神经炎症等作用。知母皂苷I(Anemarrhenasaponin I，An-I)是从知母根茎中分离出的一种化合物，有研究表明，其为潜在的5-脂氧合酶(5-LOX)和环氧合酶-2(COX-2)双靶向抑制剂，但是知母皂苷I的许多功能和作用机制尚待研究。经文献检索等，目前尚未发现知母皂苷I在制备抗人卵巢癌药物的相关实验研究。
发明内容
本发明的目的在于提供知母皂苷I的医药新用途，即在制备具有抗人卵巢癌药物中的应用。以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种知母皂苷I在制备抗人卵巢癌药物中的应用，其特征在于，所述知母皂苷I作为活性成分，其有效浓度为25μM。
所述知母皂苷I的分子式为C39H66O14，化学结构式为：
一种具有知母皂苷I成分的抗人卵巢癌药物，其特征在于：所述药物包括知母皂苷I和辅助成分，所述辅助成分即配以赋形剂、填充剂或稀释剂中的一种或多种制成药用制剂。
所述制剂的剂型为粉剂、片剂、散剂、丸剂、胶囊剂、口服液或注射液。
本发明从细胞水平、分子水平探讨了知母皂苷I对卵巢癌细胞的抗肿瘤作用机制，利用Western blotting、Real-Time PCR、EdU、CCK8、Transwell等方法详细研究了知母皂苷I对卵巢癌细胞生物学行为的影响，证实具有以下有益效果：
本发明所述的知母皂苷I能够有效抑制人卵巢癌细胞SKOV3中SHH信号通路相关靶基因的mRNA及蛋白GLI1、SUFU的表达，且知母皂苷I可有效抑制SKOV3细胞的增殖、EMT、迁移与侵袭。
通过上述试验可知，本发明所述的知母皂苷I可能是通过抑制SHH信号通路从而达到抗肿瘤作用，这一结果为未来治疗卵巢癌提供了新思路与可能靶点，并揭示了知母皂苷I作为治疗卵巢癌候选药物的可能性，显示出中国传统中药资源的巨大医药潜能。
附图说明
图1为Western blotting测定知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61处理人卵巢癌细胞SKOV3 24h后，对SHH通路相关蛋白GLI1、SUFU表达量的影响；
图2为Real-Time PCR测定知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61处理人卵巢癌细胞SKOV3 24h后，对SHH通路相关靶基因GLI1以及组成成分SUFU mRNA表达量的影响；
图3为EdU增殖试验检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响；
图4为CCK8法检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响；
图5为平板克隆实验检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3克隆形成能力的影响；
图6为Transwell检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3迁移及侵袭能力的影响；
图7为Western blotting测定知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61处理人卵巢癌细胞SKOV3 24h后，对EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin表达量的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
Western blotting测定知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3相关蛋白表达量的影响。
1.实验材料：
1)人卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC，美国)；
2)McCoy’s5A不完全培养液(凯基公司，中国)；
3)DMEM高糖培养基粉末、GlutaMaxTM谷氨酰胺添加剂、丙酮酸钠溶液和0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；
4)胎牛血清FBS(Wisent公司，加拿大)；
5)青霉素-链霉素-新霉素混合抗生素PSN和BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)；
6)兔抗Gli1多克隆抗体(CST公司，美国)；
7)兔抗Sufu多克隆抗体(Abcam公司，美国)；
8)兔抗GAPDH多克隆抗体(Santa Crutz公司，美国)；
9)辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch公司，美国)；
10)GANT61粉末(Selleck公司，美国)溶解于浓度为10mM的乙醇，用培养基稀释后供实验使用；
11)知母皂苷粉末(南京中医药大学，中国)溶解于浓度为1mM的DMSO中，用培养基稀释后供实验使用。
SKOV3细胞使用McCoy’s5A培养基培养，培养基中添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和PSN抗生素混合物(青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、新霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
2.实验方案：
分别用0μM、25μM、50μM、75μM知母皂苷I和10μM GANT61处理SKOV3细胞24h，消化收集细胞，TBS清洗2遍，RIPA裂解缓冲液提取SKOV3细胞蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，加入相应体积的5x上样缓冲液，95℃煮5min，使蛋白完全变性。
在SDS-PAGE胶上进行电泳。
经湿转法恒压80V，转膜1h，脱脂牛奶室温封闭2h，一抗按说明书要求1：1000或1：5000比例稀释，于4℃孵育过夜。
次日，TBST洗膜2-3次，每次15min，二抗按1：5000比例稀释，于室温孵育2h。
采用ECL曝光液曝光目的条带，以GAPDH为内参，检测蛋白质含量。
3.实验结果：
知母皂苷I处理后，SKOV3细胞的SHH信号通路相关靶蛋白GLI1、SUFU的表达量均下降，且随处理浓度递增，蛋白表达量下降越明显。
此外，以10μM浓度的GLI1抑制剂GANT61处理SKOV3细胞，作为阳性对照，GLI1、SUFU的蛋白表达量也明显下降，如图1所示。
实施例2
Real-Time PCR测定知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3相关mRNA表达量的影响。
1.实验材料：
1)人卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC，美国)；
2)McCoy’s5A不完全培养液(凯基公司，中国)；
3)DMEM高糖培养基粉末、GlutaMaxTM谷氨酰胺添加剂、丙酮酸钠溶液和0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；
4)胎牛血清FBS(Wisent公司，加拿大)；
5)青霉素-链霉素-新霉素混合抗生素PSN(Thermo Fisher公司，美国)；
6)TRIzol试剂(TaKaRa公司，日本)；
7)HiScriptⅡQ-RT SuperMix for qPCR(gDNA wiper)逆转录试剂盒、AceQ qPCRSYBR Green Master Mix荧光定量PCR试剂盒(诺唯赞公司，中国)；
8)GANT61粉末(Selleck公司，美国)溶解于浓度为10mM的乙醇，用培养基稀释后供实验使用；
9)知母皂苷粉末(南京中医药大学，中国)溶解于浓度为1mM的DMSO中，用培养基稀释后供实验使用。
SKOV3细胞使用McCoy’s5A培养基培养，培养基中添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和PSN抗生素混合物(青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、新霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
2.实验方案：
分别用0μM、25μM、50μM、75μM知母皂苷I和20μM GANT61处理SKOV3细胞24h，胰酶消化后收集细胞，用PBS清洗2遍，再依次用TRIzol试剂、氯仿、异丙醇、乙酸钠、75％乙醇(DEPC水配制)分离提纯RNA并测定其浓度。
用HiScript II Q-RT SuperMix for qPCR试剂盒反转录生成cDNA，反转录产物稀释10倍，取1μL进行qPCR。
所用引物均是人源的，序列如下：
GLI1上游5′-AGCTAGAGTCCAGAGGTTCAA-3′
下游5′-TAGACAGAGGTTGGGAGGTAAG-3′
SUFU上游5′-ACATGCTGCTGACAGAGGAC-3′
下游5′-CACTGCTGGGCTGAGTGTAG-3′
18S上游5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’
下游5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’
3.实验结果：
以稍低浓度的知母皂苷I处理后，SKOV3细胞的SHH信号通路相关靶基因GLI1 mRNA表达量即明显下降，但以稍高浓度处理后，GLI1 mRNA表达量反而上升，其作用机制还有待探究。
同时，以稍高浓度知母皂苷I处理SKOV3细胞后，SUFU mRNA表达量的下降才出现统计学意义。
此外，以20μM GLI1抑制剂GANT61处理细胞，其作用效果不明显，如图2A、B所示。
实施例3
EdU增殖实验检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响
1.实验材料：
1)人卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC，美国)；
2)McCoy’s5A不完全培养液(凯基公司，中国)；
3)DMEM高糖培养基粉末、GlutaMaxTM谷氨酰胺添加剂、丙酮酸钠溶液和0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；
4)胎牛血清FBS(Wisent公司，加拿大)；
5)青霉素-链霉素-新霉素混合抗生素PSN(Thermo Fisher公司，美国)；
6)EdU细胞增殖检测试剂盒(锐博生物科技，中国)；
7)GANT61粉末(Selleck公司，美国)溶解于浓度为10mM的乙醇，用培养基稀释后供实验使用；
8)知母皂苷粉末(南京中医药大学，中国)溶解于浓度为1mM的DMSO中，用培养基稀释后供实验使用。
SKOV3细胞使用McCoy’s5A培养基培养，培养基中添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和PSN抗生素混合物(青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、新霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
2.实验方案：
用25μM知母皂苷I和10μM GANT61处理SKOV3细胞24h后，消化计数，将SKOV3细胞以5×104个/孔种植在24孔板上，贴壁后，采用EdU细胞增殖分析试剂盒进行细胞增殖分析，荧光显微镜下观察并分析EdU插入情况。
3.实验结果：
以25μM知母皂苷I处理SKOV3细胞，EdU增殖实验显示知母皂苷I可有效抑制SKOV3细胞的增殖，而以10μM GANT61处理SKOV3细胞，其抑制效果不明显，如图3A、B所示。
实施例4
CCK8法检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响。
1.实验材料：
1)人卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC，美国)；
2)McCoy’s5A不完全培养液(凯基公司，中国)；
3)DMEM高糖培养基粉末、GlutaMaxTM谷氨酰胺添加剂、丙酮酸钠溶液和0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；
4)胎牛血清FBS(Wisent公司，加拿大)；青霉素-链霉素-新霉素混合抗生素PSN(Thermo Fisher公司，美国)；
5)CCK8试剂盒(APExBIO公司，美国)；
6)GANT61粉末(Selleck公司，美国)溶解于浓度为10mM的乙醇，用培养基稀释后供实验使用；
7)知母皂苷粉末(南京中医药大学，中国)溶解于浓度为1mM的DMSO中，用培养基稀释后供实验使用。
SKOV3细胞使用McCoy’s5A培养基培养，培养基中添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和PSN抗生素混合物(青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、新霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
2.实验方案：
将SKOV3细胞按4x103/孔的密度接种于96孔板，培养24h后，分别用25μM知母皂苷I和10μM GANT61处理SKOV3细胞24h、48h、72h、96h和120h，用酶标仪测定450nm处的吸光度。
3.实验结果：
CCK8实验显示，知母皂苷I和GANT61均可有效抑制SKOV3细胞的增殖，如图4所示。
实施例5
平板克隆试验检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3克隆形成能力的影响。
1.实验材料：
(1)人卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC，美国)；
(2)McCoy’s5A不完全培养液(凯基公司，中国)；
(3)DMEM高糖培养基粉末、GlutaMaxTM谷氨酰胺添加剂、丙酮酸钠溶液和0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；
(4)胎牛血清FBS(Wisent公司，加拿大)；
(5)青霉素-链霉素-新霉素混合抗生素PSN(Thermo Fisher公司，美国)；
(6)GANT61粉末(Selleck公司，美国)溶解于浓度为10mM的乙醇，用培养基稀释后供实验使用；
(7)知母皂苷粉末(南京中医药大学，中国)溶解于浓度为1mM的DMSO中，用培养基稀释后供实验使用。
SKOV3细胞使用McCoy’s5A培养基培养，培养基中添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和PSN抗生素混合物(青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、新霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
2.实验方案：
分别用25μM知母皂苷I和20μM GANT61处理SKOV3细胞24h后，消化计数，取1.0x103个SKOV3细胞种到P60培养皿中，在37℃、5％CO2条件下培养，于10d后终止培养。
弃培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛(PFA)固定10min，结晶紫染色5min，用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，拍照，观察细胞克隆数。
3.实验结果：
平板克隆试验显示，知母皂苷I和GANT61均能显著抑制SKOV3细胞的克隆形成能力，如图5A、B所示。
实施例6
Transwell检测知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61对人卵巢癌细胞SKOV3迁移及侵袭能力的影响。
1.实验材料：
(1)人卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC，美国)；
(2)McCoy’s5A不完全培养液(凯基公司，中国)；
(3)DMEM高糖培养基粉末、GlutaMaxTM谷氨酰胺添加剂、丙酮酸钠溶液和0.25％EDTA-胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；
(4)胎牛血清FBS(Wisent公司，加拿大)；
(5)青霉素-链霉素-新霉素混合抗生素PSN(Thermo Fisher公司，美国)；
(6)Transwell小室(Millpore公司，美国)；
(7)Matrigel基质胶(BD公司，美国)；
(8)鼠抗Vimentin单克隆抗体(上海Arigobio公司)；
(9)鼠抗E-Cadherin(4A2)单克隆抗体(CST公司，美国)；
(10)GANT61粉末(Selleck公司，美国)溶解于浓度为10mM的乙醇，用培养基稀释后供实验使用；
(11)知母皂苷粉末(南京中医药大学，中国)溶解于浓度为1mM的DMSO中，用培养基稀释后供实验使用。
SKOV3细胞使用McCoy’s5A培养基培养，培养基中添加10％FBS、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和PSN抗生素混合物(青霉素50μg/ml、链霉素50μg/ml、新霉素100μg/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。
2.实验方案：
侵袭：分别用25μM知母皂苷I和20μM GANT61处理SKOV3细胞24h后，用未添加任何物质的培养液按1：80的比例稀释基质胶(低温)，加入100μL稀释后的基质胶于小室中，37℃培养箱中孵育2h以上。
无血清培养液饥饿处理细胞24h后，消化计数，每个小室加入5x104个SKOV3细胞(300μL)，下层加入含10％FBS培养基600μL，于37℃、5％CO2条件下培养12h后，取出含SKOV3细胞的小室，移除上、下室的液体，下室加入600μL 4％PFA固定细胞10min，加入600μL结晶紫染色5min，用PBS洗涤小室，在显微镜下观察并计数细胞。
迁移：实验步骤基本同上述Transwell细胞侵袭实验，区别为：
①无需制备基质胶，在小室内直接接种细胞；
②含SKOV3细胞的小室培养11h后进行固定染色，在显微镜下观察并计数细胞。
将剩余细胞收集起来，PBS清洗2遍，通过Western blotting测定知母皂苷I和SHH通路抑制剂GANT61处理后，人卵巢癌细胞SKOV3 EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin的表达量。
3.实验结果：
Transwell实验结果显示，知母皂苷I处理之后，SKOV3细胞的迁移和侵袭得到明显抑制(图6A、B、C)，Western blotting结果显示，EMT标志物E-cadherin表达量轻微上升，N-cadherin表达量明显下降，Vinmentin表达量无明显变化，如图7所示，这表明知母皂苷I能够抑制卵巢癌细胞的EMT，间接验证了Transwell实验结果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明新型精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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