阅读说明：本技术 一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法 (Improved method for detecting gastric cancer frozen tissue open chromatin ) 是由 郑晓斌 姜昊 陈海洋 冯宇亮 冯通 揭敏文 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种改进的胃癌冷冻组织样品的开放染色质检测方法,把胃癌冷冻组织加入Stable buffer中研磨,将重悬后的样品过70μm滤膜,再次研磨,过40μm滤膜收集滤液离心,加入Stable buffer混匀,随后加入不同浓度的碘克沙醇溶液梯度离心,得到含细胞核的滤液；然后加入Restable Buffer-Tween稀释,对滤液中的细胞核进行计数,挑取50,000细胞核,离心并去除上清,向沉淀中加入转座体系,进行转座反应；然后对已转座的DNA进行纯化,再进行PCR扩增,最后将PCR产物纯化后测序。所述方法能有效对临床胃癌冷冻组织进行染色质结构检测,该方法可结合患者的临床数据,从而建立基于染色质结构检测与患者预后的模型,对于促进精准医疗的发展,具有重要的意义。(The invention discloses an improved open chromatin detection method of a gastric cancer frozen tissue sample, which comprises the steps of adding a gastric cancer frozen tissue into a Stable buffer for grinding, filtering a resuspended sample through a 70-micron filter membrane, grinding again, filtering through a 40-micron filter membrane, collecting filtrate for centrifugation, adding the Stable buffer for uniform mixing, and then adding iodixanol solutions with different concentrations for gradient centrifugation to obtain filtrate containing cell nuclei; then adding a Restable Buffer-Tween for dilution, counting the cell nucleuses in the filtrate, picking 50,000 cell nucleuses, centrifuging and removing a supernatant, adding a transposition system into the precipitate, and carrying out transposition reaction; then purifying the transposed DNA, performing PCR amplification, and finally purifying and sequencing the PCR product. The method can effectively detect the chromatin structure of the clinical gastric cancer frozen tissue, and can be combined with clinical data of patients, thereby establishing a model based on the chromatin structure detection and the patient prognosis, and having important significance for promoting the development of accurate medical treatment.)

一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法。

背景技术

在人类细胞细胞中，DNA与多种蛋白结合形成具有多层结构的染色质。然而，只有1％的染色质是活跃的，被称为活跃染色质(开放染色质)。这些活跃染色质((如启动子，增强子)的打开和关闭，以及它们在细胞核中的位置与基因的表达调控和细胞的生物学行为有密切关系。

一直以来，研究者利用DNase I酶切和高通量测序方法(DNase-Seq)揭示活跃染色质在基因组中的线性位置。但是这种方法需要10⁷级别数量以上的细胞以及大量的时间投入，限制了其在临床活检中的应用。2013年底斯坦福大学Greenleaf教授和Howard Chang报道的ATAC-seq(Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing)技术的出现突破这一限制，为研究染色质的可接近性提供了全新的手段(ATAC-seq通过Tn5转座酶将测序的adapters***到基因组上的“可接近”区域来标记调控的区域，仅需500～50000个细胞就能获得高质量的染色质开放结构图谱并随着测序深度的加深(达200millionsreads)，甚至可以直接看到转录因子的结合位点(有转录因子结合的地方不被Tn5酶切割，形成印迹(footprint)，大大简化了实验流程及样本损耗。2017年7月12日，ATAC-seq技术发明者之一Howard Chang通过追踪患者在组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)抗癌药物治疗过程中各个时间点的表观遗传状态，首次在时间尺度上深入研究表观遗传基因组和关键性转录因子对患者药物敏感性的动态调控机制，并准确预测患者对HDACi抗癌药物的敏感性，为新的靶向治疗方案提供依据，也为研究其他疾病的精准医疗的表观遗传调控机制建立模板。另外，通过ATAC-seq数据对正常、混合、宿主、肿瘤细胞的DNA拷贝数进行分析，利用人类染色体图显示人类基因组DNA的拷贝数在各细胞类型中的差异，Howard Chang证实了在混合和肿瘤细胞中多个已被报道的遗传变异，如chr4q、chr8q和chr17q的增加，chr10q和chr17p的缺失等，并发现这些变异并没有发生在正常人或者患者的宿主细胞中。有趣的是，HowardChang发现遗传层面的DNA拷贝数差异并不能反映患者对药物的敏感性，相反，表观遗传层面的转录因子调控机制却可以准确的预测患者对药物的应答情况，再一次说明对患者表观遗传基因组研究的重要性，也提示了当前精准医疗研究中常规使用的基因测序的局限性。同时，这些鉴定出的转录因子可以很好的区分正常人和处于不同癌症阶段的病人，基于这一点，可以将正常人与癌症病人、不同阶段癌症病人特异的转录因子核酸序列设计成为基因芯片上的靶核苷酸探针来检测病人是否患有癌症或位于癌症的哪个阶段，这些新的特异探针也大大拓展了现有的一些经典的检测探针，使得基因芯片的结果更具准确性。

遗憾的是，经典的ATAC-seq技术只能在新鲜细胞中进行Tn5的转座实验，否则文库的质量极差。因此严重限制了ATAC-seq在临床样本检测中的应用。专利CN 108300774A公开了一种针对冰冻组织的ATAC-seq方法，但是将所述方法用于胃癌冷冻组织的ATAC-seq研究时，构建的文库质量依然较差。因此，需要针对胃癌提供一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有ATAC-seq技术无法应用于胃癌冷冻组织)的缺陷和不足。提供一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法，所述方法能有效对临床胃癌冷冻组织进行染色质结构检测，其结果与ENCODE中组织检测的结果高度一致。该方法能有效地对临床标本库组织的染色质结构进行检测，并结合患者的临床数据，从而建立基于染色质结构检测与患者预后的模型，对于促进精准医疗的发展，具有重要的意义。

本发明的另一目的是提供一种用于胃癌冷冻组织开放染色质检测产品。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法，包括如下步骤：

S1.将胃癌冷冻组织加入Stable buffer中研磨，将重悬后的样品过70μm滤膜，再次研磨，过40μm滤膜收集滤液，离心去上清，加入Stable buffer混匀，随后分别按顺序加入不同浓度50％、30％、40％碘克沙醇溶液梯度离心，得到含细胞核的滤液；所述Sablebuffer包含以下终浓度的各组分：5mM CaCl₂，3mM Mg(Ac)₂，10mM Tris pH7.8，0.1mM EDTA，0.10％NP40，320mM蔗糖，0.02mM PMSF蛋白酶抑制剂，0.2mMβ-巯基乙醇；

S2.取步骤S1含细胞核的滤液，加入Restable Buffer-Tween稀释，然后对滤液中的细胞核进行计数，挑取50,000细胞核，离心去上清，向沉淀中加入转座体系，进行转座反应；然后对已转座的DNA进行纯化，再进行PCR扩增，最后将PCR产物纯化后进行测序；所述Restable Buffer-Tween包含以下终浓度的各组分：10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl₂，0.10％Tween 20。

本发明人研究发现，经典的细胞核提取方法和专利CN 108300774A中公开的方法均不适用于胃癌冷冻组织，无法从有限的胃癌冷冻组织中获取后续研究所需的细胞核数，难以进行Tn5的转座实验，制备的文库质量极差。本发明自主研制了一种可以在胃癌冷冻组织(临床样本)中获取高质量细胞核的方法，该方法与经典ATAC-seq先数取一定数量新鲜原代细胞或细胞株进行计数后再通过裂解液裂解相比，在从胃癌冷冻组织中提取细胞核的同时，就可以对细胞核核膜进行初步的裂解，方便后续的实验。本发明的细胞核提取方法可以从有限的胃癌冷冻组织中提取到足量的细胞核数进行之后的实验。

优选地，所述胃癌冷冻组织为液氮或-80℃保存的组织。

优选地，所述胃癌冷冻组织与Stable buffer的质量体积比为10～20mg：1～2mL；ATAC-seq的关键是裂解，裂解不充分，Tn5进不去，裂解太过的话，又会破坏核膜，因此对裂解液与细胞组织的比例有一定的要求。

优选地，所述Stable buffer中各组分的母液浓度为：1M CaCl₂，1M Mg(Ac)₂，1MTris pH7.8，500mM EDTA，10％NP40，1M蔗糖，100mM PMSF蛋白酶抑制剂，14.3mMβ-巯基乙醇。

优选地，为了保证组织中细胞核的完整性和活性，所述全部试剂均为预冷的试剂。

具体地，所述50,000细胞核的转座体系为25μL TD buffer，2.5μL DDW，2.5TDE1(Tn5酶)，16.5μL PBS，0.5μL 1％digitonin，0.5μL 10％Tween-20；其中，细胞核数与TD(Tn5酶)的用量是至关重要的，它们共同决定着DNA片段的产生分布。所述转座体系含有的0.5μL 1％digitonin，0.5μL 10％Tween-20，这两种去垢剂的加入可以大大降低背景噪点。

具体地，所述转座为在恒温混匀仪上，1000rpm，37℃，30min。

具体地，所述对已转座的DNA进行纯化为用AMPure beads进行纯化：向已转座的DNA中加入AMpure beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液洗脱。

优选地，所述已转座的DNA与AMpure beads的体积比为1：2～3。

具体地，DNA纯化后的PCR扩增方法与经典方法相同。

具体地，所述PCR产物纯化为用AMPure beads进行纯化：向PCR反应产物中加入终浓度为0.65×的AMpure beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，将上清液转到新管中，加入终浓度为1.8×的AMpure beads，混匀后静置，再置于磁分离架上静置分离，然后去除上清并用80％乙醇溶液洗涤，重复该步骤，去除残留的乙醇溶液，最后用EB溶液洗脱。

经典的ATAC-seq通过QiagenMinElute kit对已转座的DNA进行过柱纯化，通过凝胶电泳法对PCR产物进行纯化并分选；传统的过柱纯化和凝胶电泳法使DNA损失较多，会造成文库复杂度降低(50000细胞DNA转座后得到DNA量很少)，而本发明通过使用AMPurebeads回收可减少DNA的损失(约30％)；去除文库中的无效测序片段：经典的ATAC-seq并未对文库中的adaptor dimer及大于600bp片段去除(保留所有的nucleosome pattern)，然而，如果实验只关注的是开放染色质区域而非核小体定位信息，没必要保留600bp以上的大片段(二代测序仪对600bp以上片段的测序效率极低)。因此，我们利用AMPure beads，经过两轮的AMpure beads筛选(通过控制不同的AMPure beads与样本的比例)，去除了adaptordimer和大于600bp的大片段，大大提高了文库DNA的有效测序比例。

同时，上述方法在胃癌冷冻组织开放染色质检测中的应用亦在本发明保护范围内。

本发明还请求保护所述方法在制备胃癌冷冻组织开放染色质检测的产品中的应用。

一种用于胃癌冷冻组织开放染色质检测的产品，所述产品包含上述Stablebuffer、不同浓度碘克沙醇溶液、Restable Buffer。

优选地，还包括用于进行DNA和PCR产物纯化的AMpure beads。

优选地，所述产品还包含40μm细胞滤网，70μm细胞滤网，Illumina Tagment DNAbuffer，Illumina NexteraTagment DNA enzyme，1％digitonin，10％Tween-20，NEBNextHigh-Fidelty 2xPCR Master Mix，100x SYBR Green I。

优选地，所述产品为试剂盒。本发明的所述试剂盒可对临床胃癌冷冻组织进行开放染色质检测，其结果可以达到和ENCODE组织检测结果高度一致。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种改进的胃癌冷冻组织开放染色质检测方法，通过对胃癌冷冻组织的细胞核提取方法进行改进，以及通过使用AMpure beads技术大大提高了文库的质量，所述方法能有效对临床胃癌冷冻组织进行染色质结构检测。该方法能有效地对临床标本库组织的染色质结构进行检测，并结合患者的临床数据，从而建立基于染色质结构检测与患者预后的模型，对于促进精准医疗的发展，具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明PCR循环数计算方法图。

图2为利用AMPure beads对文库片段进行筛选前后的bioanalyzer分析数据图；上图显示的是未经AMPure beads处理的文库(与2013年Nature Methods报道的ATAC-seq的文库类似，呈现特征性的核小体分布)，下图是经过AMPure beads处理的文库。

图3为冷冻乳腺组织与ENCODE胃癌组织UCSC基因组浏览器截图。

图4为多次重复实验的UCSC基因组浏览器截图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1胃癌冷冻组织的开放染色质检测方法

一、方法

1、从液氮或-80冰箱中，取出10mg胃癌组织转移到装有2mL 1×预冷StableBuffer玻璃匀浆器中，温柔地匀浆20下。所述Stable Buffer具体配方如表1所示：

表1 Stable Buffer

试剂	终浓度	每100mL需要的体积
			1M CaCl<sub>2</sub>	5mM	500μL
1M Mg(Ac)<sub>2</sub>	3mM	300μL
			1M Tris pH 7.8	10mM	1mL
100mM PMSF	0.02mM	20μL
			14.3Mβ-mercaptoethanol	0.2mM	1.4μL
1M Sucrose	320mM	32mL
			500mM EDTA	0.1mM	20μL
10％NP40	0.10％	1mL
			DDW		65.16mL

2、把匀浆后的样品用70μm滤膜的细胞滤网(cell strainer)(放在50mL管中)进行过滤；收集滤液重新加回玻璃匀浆器中，温柔地匀浆15下。

3、再将样品用40μm滤膜的cellstrainer过滤，将滤液转移至2mL EP管中，4℃，350g，离心5min。

4、弃去上清，加入400μL 1×预冷Stable Buffer。

5、加入400μL的50％Iodixanol Solution，重悬混匀，使终浓度为25％。

6、将600μL的30％Iodixanol Solution小心地加入25％的溶液层之下，避免混匀两个溶液层。

7、将600μL的40％Iodixanol Solution小心地加入30％的溶液层之下，避免混匀两个溶液层。

8、4℃，20min，3000g，离心。

9、吸取200μL的细胞核层溶液转移到新的1.5mL的EP管中。加入500μL预冷的Restable Buffer-Tween进行稀释，重悬混匀。所述Restable Buffer-Tween的配方如表2所示：

表2 Restable Buffer-Tween

10、用台盼蓝(trypan blue)对细胞核进行计数；

11、把50,000细胞核转移到1.5mL EP中，使用Restable Buffer-Tween把液体补足到50μL，然后4℃，500g离心10分钟；

12、去除上清后进行加入25μL TD buffer，2.5μL DDW，2.5TDE1(Tn5酶)，16.5μLPBS，0.5μL 1％digitonin，0.5μL 10％Tween-20并转移到恒温混匀仪上，1000rpm，37℃，30min。

13、用AMPurebeads对已转座的DNA进行纯化：

(1)加入100μL AMpurebeads,吹打10次，室温静置15min；

(2)然后把beads放在magneticrack上，室温静置2min；

(3)去除上清；

(4)加入200μL 80％新鲜配制的乙醇；

(5)室温孵育30sec后去除上清；

(6)重复用乙醇清洗一次；

(7)去除上清后，进行短暂spin down，然后把EP管放回到magneticrack中，去除残余的乙醇；

(8)室温风干5min；

(9)把EP管移离magnetic rack；

(10)用16.5μL EB buffer重悬beads；

(11)室温孵育2min；

(12)把EP管放到magneticrack中，小心地吸取15μL上清；

14、对已纯化的转座DNA进行PCR扩增，所述PCR反应体系如表3所示，PCR程序如表4所示：

表3

表4

15、为了减少GC和DNA片段大小偏倚，进行如下的一个预PCR反应，以确定剩余样本的PCR循环数(避免过饱和)：其中，反应体系如表5所示，PCR程序为表6所示；

表5

组分	体积
		上述5个循环扩增的DNA	5μL
Nextera PCR引物index N7XX(25μM)	0.25μL
		Nextera PCR引物index S5XX(25μM)	0.25μL
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master	5μL
		100x SYBR Green I**	0.06μL
H<sub>2</sub>0	4.7μL

表6

16、计算剩余45μLPCR反应的最佳循环数(原理如图1所示)：

方法：测量每个曲线1/4或1/3最大荧光强度所对应的循环数，该循环数则为剩余45μL样本反应的最佳循环数；

17、对剩余的45μL进行PCR扩增(除循环数改变外，其余程序与12一样)。

18、对PCR产物进行进行两轮AMPurebeads纯化；

第一轮(0.65×AMPure beads)

(1)把45μLPCR反应产物用水补足到50μL，加入32.5μLAMPurebeads，吹打10次；

(2)室温静置15min；

(3)然后把beads让在magneticrack上，

(4)静置2min；

(5)把上清转移到一个新的EP管中；

第二轮(1.8×AMPure beads)

(1)往上清中加入57.5μL AMPure beads，吹打10次，室温静置15min；

(2)把beads放在magneticrack上，室温静置2min；

(3)去除上清；

(4)加入200μL 80％新鲜配置的乙醇；

(5)室温孵育30sec后去除上清；

(6)重复用乙醇清洗一次；

(7)去除上清后，进行短暂spindown，然后把EP管放回到magneticrack中，去除残余的乙醇；

(8)室温风干5min；

(9)把EP管移离magneticrack；

(10)用22.5μLEBbuffer重悬beads,室温孵育2min；

(11)把beads放到magneticrack中，小心地吸取20μL上清。

19、将纯化后的PCR产物进行测序。

二、结果

1、本发明的胃癌冷冻组织文库经过使用两轮AMPure beads处理后，文库中的adaptor dimer(左边红框)和大于600bp的片段(右边红框)被很好地去除(如图2所示)。而未经AMPure beads处理的文库(与2013年Nature Methods报道的ATAC-seq的文库类似，呈现特征性的核小体分布)。

2、本实施案例中胃癌冷冻组织的ATAC-seq文库(AMPure处理后)进行测序，结果发现产生约83871个peaks；UCSC基因组浏览器显示胃癌冷冻组织和ENCODE的胃癌组织ATAC-seq检测结果高度相似，且噪点更低(图3是UCSC genome browser截取管家基因ACTB基因附近的区域)，重复试验显示本发明针对胃癌冷冻组织样品的开放染色质检测方法结果稳定、可靠(图4)。